serminar phương pháp western blot

serminar phương pháp western blot

KHOA KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC CỬU LONG LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD : Ts Bùi Chí Bảo

2 Chạy điện di 1 chiều với SDS page  

3 Chuyển protein từ gel đến  màng

• Western blot là kĩ thuật xét nghiệm protein trên polyacrylamide gel chuyển đến môi trường bền vững hơn và cố định

• Là kỹ thuật lai giữa protein với protein(giữa kháng nguyên với kháng thể) protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang

Western blot bằng cách sử dụng một kháng thể nhận ra các protein được sửa đổi với lipoic acid

Mẫu có thể được lấy từ mô thực vậtđộng vật, bằng cách cắt ra thành nhiều mảnh nhỏ Chúng ta cho thêm cát và dung dich đệm để ly trích ( thể tích tùy vào số lượng mẫu).

1 Chuẩn bị mẫu

* Lysis buffer chứa:

Sodium hydroxide (NaOH): giúp phá vỡ các thành tế bào

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): hòa tan màng tế bào

Tris, pH 7.5

→ nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base

DNA, SDS cũng làm biến tính phần lớn các protein

trong các tế bào, giúp tách các protein từ các plasmid

sau trong tiến trình

Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và các dung dịch đệm có thể được

sử dụng để ly giải tế bào và hòa tan protein

I I. Qui trình

Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và các dung dịch đệm có thể được

sử dụng để ly giải tế bào và hòa tan protein.Chất ức chế Protease và phosphatase được thêm vào để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của riêng mình Chuẩn bị mô thường được thực hiện ở nhiệt

độ lạnh để tránh làm biến tính protein và suy thoái Và một sự kết hợp của kỹ thuật sinh hóa và cơ khí - bao gồm các loại lọc và ly tâm

1 Chuẩn bị mẫu

a lysis bộ đệm

Để chuẩn bị mẫu để chạy trên gel, các tế bào và mô cần phải được ly giải để giải phóng protein quan tâm

b Chất ức chế protease và phosphatase

Ngay sau khi ly giải xảy ra, dephosphorylation phân giải protein,

và biến tính bắt đầu Những biến cố này có thể bị chậm lại rất nhiều nếu mẫu được lưu giữ trên băng hoặc ở 4°C ở tất cả các thời gian

và chất ức chế thích hợp được thêm tươi để lysis đệm

1 Chuẩn bị mẫu

Phổ biến nhất của điện di gel sử dụng gel

polyacrylamide và bộ đệm được nạp với SDS.

    SDS (sodium dodecylsulfate): là một chất

khử amionic gây biến tính protein bằng cách

bao quanh bộ khung polypeptide khiến các

phân tử duỗi thẳng ra

Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu

2.Chạy điện di 1 chiều

Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn

rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu;

vì thế điện tích ban đầu của protein không ảnh

hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp Phức

hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện

di Sau đó các mẫu được nạp vào các giếng trong

gel

2.Chạy điện di 1 chiều

Khi điện di kết thúc, những

protein trên gel sẽ được nhìn

thấy là một dãy các băng bằng

cách nhuộm với bạc hay một

chất nhuộm màu như

Coomassie blue

Độ phân giài của SDS- Page là rất rất lớn, các phức hợp được tách thành hàng trăm vết băng trên gel

2.Chạy điện di 1 chiều

3 Chuyển protein từ gel đến màng

Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các protein được

chuyển từ trong gel lên một màng nitrocellulose hoặc

polyvinylidene difluoride (PVDF )

Phương pháp chính để chuyển các protein và sử dụng một dòng

điện để kéo protein gel vào PVDF hoặc màng nitrocellulose

Các protein di chuyển từ bên trong gel lên

màng Một phương pháp chuyển bao gồm

việc đặt một màng trên gel, và một chồng

giấy lọc Ngăn toàn bộ được đặt trong một

dung dịch đệm nó di chuyển lên giấy bằng

cách mao dẫn, đưa các protein với nó

protein trên màng nitrocellulose hoặc PVDF

Trong thực tế phương pháp này không được sử dụng vì nó mất quá nhiều thời gian; electroblotting được ưa thích.kết quả của hai quá trình "thấm", các protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để phát hiện Cả hai màng tế bào được lựa chọn cho các thuộc tính cụ thể không protein ràng buộc(tức là liên kết tất cả các protein tốt như nhau).

Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương tác giữa các màng tế bào và protein Màng nitrocellulose rẻ hơn so với PVDF, nhưng mỏng manh hơn và không đứng lên cũng

probings lặp đi lặp lại

3 Chuyển protein từ gel đến màng

Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có thể được kiểm tra bằng cách nhuộm màng với

coomassise Brilliant Blue hoặc S thuốc nhuộm ponceau Ponceau

S là phổ biến hơn của hai, do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan

nước, sau này làm cho nó dễ dàng hơn để sau đó destain và thăm

dò màng

3 Chuyển protein từ gel đến màng

1 Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị

trí như đã phân tách trên gel.Rửa màng lai từ 5-10 phút trong dung

dịch TBS.

2 Ủ trong dung dịch khóa

3 Sau rửa màng lai 2 lần TBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa

4 Ủ màng lai đã cố định protein trong 1-2 giờ với một kháng thể sơ

cấp (primary antibody) với sự kích động nhẹ Kháng thể sơ cấp là

một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm

5 Sau rửa màng lai 2-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.

6 Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody)

có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong 1 tiếng có sự kích động nhẹ

7.Sau rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa 8.Sau rửa màng lai lần cuối với TBS.

9.Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với

enzyme Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát

hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp

protein-kháng thể sơ cấp-protein-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là

ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm

9 Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme

Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền có kh  năng ả phản ứng với các enzyme

(như peroxidase ) được ràng buộc với các kháng thể thứ cấp

đó màng

5 Phát hiện và phân tích hình ảnh

Phát hiện bằng đo màu

phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi

thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng không

hòa tan của một màu sắc khác tủa thành các

vết ngay bên cạnh các enzyme và qua xuất

hiện vết trên màng

Phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những thuốc nhuộm hòa tan Hàm lượng protein được đánh giá thông qua densitometry (cường độ vết là) hoặc quang phổ

phát hiện bằng huỳnh quang

 Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bởi ánh sáng

và sự phát xạ kích thích sau đó được phát hiện bởi một

photosensor như CCD máy ảnh được trang bị với các bộ lọc khí thải thích hợp chụp một hình ảnh kỹ thuật số và cho

phép phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng

phân tử s  l ng phân t ố ượ ử Huỳnh quang được coi là một trong những phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít nhạy cảm hơn chemiluminescence

Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ

màng lai  với một chất nền sẽ luminesce khi tiếp xúc

với reporter trên kháng thể thứ cấp Ánh sáng sau đó

được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy

ảnh CCD chụp một hình ảnh kỹ thuật số Những hình ảnh được phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của

nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học

Mới hơn phần mềm cho phép phân tích dữ liệu xa hơn như

phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp

được sử dụng

Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent

Hệ thống máy chạy western blot của Biorad:

V3 Western Workflow™

Các quy trình làm việc V3 đầy đủ kết hợp kỹ thuật truyền thốngvới công cụ sáng tạo, chẳng hạn như TGX Stain ™ đúc sẵn gel,Trans-Blot ® Turbo hệ thống ™, và ChemiDoc ™ MP màn hình,

để nhanh chóng kiểm tra kết quả điện di và chất lượng chuyển giao trước khi đến western blotting, đơn giản hóa phân tích, định lượng protein để có được kết quả nhanh hơn

Bio-Rad's V3 Western Workflow là một

phương pháp gồm năm bước để đơn

giản quy trình western blotting

- Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ precast

gels and Criterion™ TGX Stain-Free™ precast gels tách

protein cao với thời gian chạy nhanh và sử dụng dung dịch

đệm Tris_ glycine để chạy.

TGX Stain-Free™ precast gels có chứa một công nghệ độc đáo được xây dựng vào hóa học gel cho phép nhanh

chóng, chất lượng cao, tách biệt protein trong thời gian ít nhất

là 15 phút.

1 Tách biệt Protein

2.Hình tượng hóa các protein

Điều này cho phép hình dung ngay

được protein trên gel toàn bộ mà không

cần nhuộm Stain-công nghệ là một giải pháp thay thế tiết kiệm thời

gian để nhuộm Coomassie truyền thống,

cung cấp một quy trình làm việc sắp xếp hợp lý

- Trans-Blot Turbo hệ thống là một protein bộ máy chuyển giao nhanh chóng có thể làm giảm các bước chuyển giao ít nhất là 3 phút, trong khi duy

trì chuyển protein cao hiệu quả trên một loạt

các khối lượng phân tử

- ChemiDoc MP màn

hinh kết hợp vớicông nghệ bẩn miễn

phí cho phép xác minh ngay lập

tức chuyểnprotein

3 Chuyển protein

4.Xác minh chuyển giao protein

Bình thường hóa cho protein tổng số, tước và reprobing

Tây thấm qua bình thường

hóa protein tổng số kết hợp với

protein vệ sinh.

IV ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT WESTERN BLOT

 Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô.

 Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu

 Xác định độ lớn của gen mục tiêu.

 Nhận dạng protein mục tiêu.

 Phân tích cây trồng chuyển gen.

 Đánh giá tính chuyên biệt của antibody.

 Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra.

 Phân tích sự phát triển của thực vật

western blot để phát hiện kháng thể chống

HIV trong một mẫu huyết thanh của con

người

Một số hình thức của bệnh Lyme thử nghiệm

sử dụng Western blot

 Western blot cũng có thể được sử dụng

như một thử nghiệm xác minh về nhiễm

viêm gan B

Ứng dụng Western blot trong y tế:

1 3

Các protein sau đó được chuyển giao cho một màng, nơi đang thăm dò

(phát hiện) bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu với protein

Sử dụng điện di gel để tách các protein có nguồn gốc biến tính bằng chiều dài của chuỗi polypeptide hoặc bởi cấu trúc 3-D của protein

4 6

Western blot còn được sử dụng trong các lĩnh vực sinh học phân tử, hóa sinh,

immunogenetics

và các ngành sinh học phân tử khác

Phương pháp này cho phép sự tách biệt của tất cả các protein

tế bào trên một gel lớn.lợi thế lớn của phương pháp này là

nó thường phân biệt giữa các đồng dạng khác nhau của một loại protein cụ thể.

lượng tương đối

của protein trong

các mẫu khác

nhau

http://www.bio-rad.com/prd/en/SG/adirect/biorad?

ts=1&cmd=BRCatgProductDetail&vertical=LSR&catID=M08HIB15

http://www.wattpad.com/371606-c%C3%B4ng-ngh

%E1%BB%87-dna-t%C3%A1i-t%E1%BB%95-h

%E1%BB%A3p-c%C3%B4ng-ngh%E1%BB%87-sinh-h%E1%BB%8Dc?p=85