ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1: PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT 1.1 Định nghĩa Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay phương pháp lai thấm protein là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp

1.3.2 Chạy điện di một chiều với SDS-PAGE

1.3.3 Chuyển protein từ gel lên màng

1.3.4 Lai với antibody

2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giởi và ở Việt Nam

2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới

2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam

2.2 Giới thiệu hội chứng Taura- TS

2.2.1 Khái niệm

2.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của Taura-TS

2.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm

2.3 Các phương phápvà kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura

2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng

2.3.2 Phương pháp miễn dịch

2.3.3 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gene

2.4 Vật liệu và phương pháp

2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm màu gel

2.4.2 Các dung dịch để thực hiện western Blot

MỞ ĐẦU

Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, thì các kỹ thuật

về sinh học phân tử ra đời: phương pháp western blot, PCR, Phương pháp western blot

là một kỹ thuật quan trọng được sử dụng trong tế bào và sinh học phân tử Bằng cách sử dụng western blot , các nhà nghiên cứu có thể xác định được protein cụ thể trong một hỗnhợp phức tạp có chứa các protein chiết xuất từ tế bào

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

1.1 Định nghĩa

Western blot( còn có tên gọi khác là Western blotting hay phương pháp lai thấm protein) là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecul sulfate- polyacrylamide gen eletratphoresis), thường thì sử dụng antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang để phát hiện một loại protein nào đó, được dùng rộng rải trong chuẩn đoán HIV, viêm gan,…

1.2 Nguyên tắc

Trong western blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE), miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS)-

SDS-là một tác nhân biến tính protein Các vạch protein được chuyển lên màng nitrocellulose

và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâm màng nitrocellulose với kháng thểđơn dòng hoặc đa dòng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho proteinquan tâm Nếu protein quan tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trícủa nó trên các điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X quang.Gọi là hình X quang

1.3 Quy trình thực hiện

Sodium hydroxide(NaOH): phá vỡ thành tế bào.

Sodium dodecyl sulfate(SDS): hòa tan màng tế bào

Tris, pH 7,5

Nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base DNA, SDS cũng làm biến tính phần lớn các protein trong các tế bào.

-Ngay sau khi ly giải xảy ra, dephosphoryl phân giải protein, và biến tính bắt đầu

Để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của tế bào ta thêm chất ức chế

protease và phosphatase vào dung dịch đệm

-Chuẩn bị mẫu thường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh(C) để tránh làm biến tính protein và suy thoái

1.3.2 Chạy điện di 1 chiều

-Chọn một loại gel thích hợp để phát hiện các protein quan tâm Phổ biến nhất của điện di gel sử dụng gel polyacrylamide và bộ đếm được nạp với SDS Nồng độ của acrylamide trong thường được sử dụng gel thay đổi 7-15%

+SDS là một chất khử amionic gây biến tình protein bằng cách bao quanh bộ khungpolypeptide khiến các phân tử duỗi thẳng ra

-Lắp ráp các thiết bị điện và thiết lập gel

-Lắp đầy cả thùng bên trong và bên ngoài của thiết bị điện với bộ đệm điện di và rửa sạch mỗi giếng của gel bằng cách ngâm nó nhiều lần với đệm điện

-Thêm SDS mẫu đệm và điều chỉnh nhiệt độ của mẫu ở 95 ° C trong vòng 3 phút hoặc ở 75 ° C trong 10 phút để làm biến tính protein

- Đưa mẫu và đánh dấu vào các giếng của gel SDS-PAGE

+ Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch SDS, một chất tẩy mang điện tích

âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu

+ Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của protein ban đầu; vì thế điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di Sau đó các mẫu được nạp vào giếng trong gel

- Chạy các mẫu tại một điện thế không đổi (200 V) Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như bromophenol blue

- Tháo rời bộ máy điện và đưa gel ra.

+ Độ phân giải của SDS-Page là rất lớn các phức hợp được tách thành hàng trăm vết băng trên gel

1.3.3 Chuyển protein từ gel đến màng

-Mục đích của phương pháp này là để kéo protein từ gel vào PVDF hoặc màng nitrocellulose

Nguyên tắc:

- Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các protein được chuyển từ tronggel lên màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride( PVDF) Ta chọn màng nitrocellulose

- Cắt kính thước màng tế bào vào giấy lọc cho cùng kích thướt với gel

+ Xử lý các gel nhẹ nhàng trong đệm SDS Không ngâm gel trong bộ đệm khác như PBS, bởi vì để giữ cho protein điện tích âm

- Ngâm màng, giấy lọc, và miếng thấm trong bộ đệm western transfer buffer

- Khi lắp ráp các lớp thấm để thực hiện việc chuyển protein, tránh có không khí hoặc bong bóng ở giữa màng và gel, ta giữ màng và gel ướt cho đến khi phân tích

western blot hoàn thành

- Thực hiện chuyển protein trên màng trong khoảng 30 phút với cường độ

20mA/cm

+ Trong thực tế, phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì chúng mất nhiều thời gian; electrblotting được ưa thích hơn Kết quả của hai quá trình “ thấm” các protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để phát hiện Cả hai mạng tế bào được lựa chọn cho các thuộc tính cụ thể không protein ràng buộc( tức là liên kết tất cả các protein tốt như nhau)

+Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương tác giữa các màng tế bào và protein Màng nitrocellulose rẻ hơn so với PVDF, nhưng mỏng manh hơn

và không đứng lên cùng probing lặp đi lặp lại

+Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có thể được kiểm tra bằng cách nhuộn màng với coomasise Brilliant blue hoặc S thuốc nhuộm

ponceau Ponceau S phổ biến hơn do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan nước, sau này làm cho nó dể dàng hơn để sau đó destain và thăm dò màng

1.3.4 Lai với antibody

- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel Rửa màng lai 5-10 phút trong dung dịch TTBS

TTBS là hỗn hợp của Tris-buffered saline và Tween 20 0.05%

 Nếu trong TTBS mà không cho Tween thì kháng thể nó bám không đặc hiệu mạnh hơn

 Nếu không có Tween để pha đệm rửa thì có thể thay bằng Triton X-100

- Ủ trong dung dịch khóa

- Sau đó rửa màng lai 2 lần với TBS, 5-10 phút mỗi lần rửa

TBS (Tris-buffered saline) là dung dịch đệm dùng để rửa sạch màng nitrocellulose và duy trì độ pH trong phạm vi tương đối hẹp Gồm:

50 mM Tris

150 mM NaCl

- Ủ màng lai đã cố định protein trong 1- 2 giờ với một kháng thể sơ cấp( primary antibody) với sự kích động nhẹ Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.

- Rửa màng lai 2- 6 lần với TTBS , 5-10 phút mỗi lần rửa

- Ủ màng lai lai với một kháng thể thứ cấp( secondary antibody) có enzyme ( alkalinphosphattase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong 1 giờ có kích động nhẹ

- Sau đó rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10 phút cho mỗi lần rửa

- Rửa màng lai lần cuối với TBS

- Tiếp tục ủ mạng lai trong 1 hỗn hợp đặc hiệu với enzyme Nếu mọi việc đều diễn

ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp-enzyme hay ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm

protein Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra

do enzyme

1.3.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh

Phát hiện bằng đo màu

Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền có khả năng phản ứng với các enzyme( như pexodase) được ràng buộc với các kháng thể thứ cấp

Phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng không hòa tan của một màu sắc khác nhau tủa thành các vết ngay bên cạnh các enzyme

và qua xuất hiện vết tren màng

Phản ứng phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những thuốc nhuộm hòa tan Hàm lượng protein được đánh giá thông qua densitometry ( cường độ vết là) hoặc quang phổ

Phát hiện bằng huỳnh quang

Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bới ánh sáng và sự phát xạ kích thích sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh kỹ thuật số và cho phép phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử, số lượng phân tử Huỳnh

quang được coi là phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít nhạy cảm hơn

Chemiluminescent

Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent

Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền sẽ làm cho luminese tiếp xúc với reporter trên kháng thế sơ cấp Ánh sang sau đó được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp một ảnh kỹ thuật

số Những hình ảnh được phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học Mới hơn phần mền cho phếp phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp được sử dụng

1.4 So sánh với phương pháp ELISA

2.2.1 Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay)

Còn được gọi là EIA( enzyme immuno assay)

Nguyên tắc: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể được gắn với một enzym bằng liên kết đồng hoá trị Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trôi đi Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất(introphenol phosphate) làm thay đổi màu do hoạt tính của enzyme Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.Quy trình:

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như

peptides, protein, antibodies,…

Kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và

chất tạo màu, được thực hiện qua hai bước:

• Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

• Phản ứng hóa học: thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxyhóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Kỹ thuật này khá nhạy cảm và đơn giản, cho phép xác định được kháng nguyên hay

- Gắn với enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ

-Chạy trên gel SDS-PAGE

-Tắc nghẽn với protein dư

-Kháng thể đối kháng với protein X được đánh dấu phóng xạ hay enzyme

-Trích từ kháng nguyên

-Phức hợp giữa kháng nguyên-kháng thể

- Cho thêm chất tạo màu.-Chạy trên đĩa plastic

-Tắc nghẽn với kháng nguyên dư

-Kháng thể gắn đặc hiệu vớikháng nguyên thông qua enzyme

2.3 Ưu, nhược điểm

2.3.1 Ưu điểm

- Cho kết quả nhanh

- Sinh phẩm dễ bảo quản

- Có thể làm số lượng hàng loạt hay ít mẫu

- Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, không cần máy móc, dụng cụ đắt tiền.

- Độ đặc hiệu cao Đọc kết quả bằng mắt thường

- Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở

Phương pháp western blot được ứng dụng để:

- Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô

- Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu

- Đánh giá độ lớn của gen mục tiêu

- Định dạng protein mục tiêu

- Phân tích cây trồng chuyển đổi gen

- Đánh giá tính chuyên biệt của antibody

- Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra

- Phân tích sự phát triển của thực vật

Trong y tế western blot được ứng dụng để:

- Xác định bệnh nhân có kháng thể chống HIV trong mẫu huyết thanh không

- Western blot sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêm gan BCHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG

ỨNG DỤNG CỦA WESTERN BLOT TRONG NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ( Penaeus

monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG(Penaeus vannamei)

3.1 Tình hình bệnh và tác hại của bệnh trên thế giới và ở Việt Nam

3.1.1 tình hình nuôi tôm trên thế giới

Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong nhữngngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế giới Tuy nhiên, nghề nuôi tôm gặp không ít khó khăn do tôm mắc bệnh và gây chết hàng loạt Mộttrong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay do virus gây nên là Virus

hội chứng Taura (TSV).Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm và ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới (Nguyễn Văn Hảo, 2000) Trong thời gian qua, Virus hội chứng Taura (TSV) đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Mỹ- Latinh Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây dịch lớn tại Châu Mỹ (Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm khoảng 90% Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á khi tôm TCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan Năm 1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999; Yu

và Song, 2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm 1999, dẫn đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫn đến 500.000 trường hợp và 50.000 tôm chết vào năm 2001

3.1.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam

Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển Sản lượng tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần 10% sản lượng tôm Châu Á, mang lại lợi ích đáng kể cho người nuôi tôm (Lý Thị Thanh Loan 2001)

Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô công nghiệp, “dịch bệnh” tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ những năm đầu thập niên 90 Năm

2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm thẻ chân trắng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau

3.2 Giới thiệu về hội chứng Taura-TS

3.2.1 Khái niệm

Tên phổ biến thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura (TSV) Ngoài ra có một

số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura như: hội chứng Taura (Taura Syndrome – TS); bệnh Hội chứng Taura (Taura Syndrome Disease – TSD); bệnh đỏ đuôi (Red Tail Disease – RTD) (Lightner, 1996)

3.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của TST

TSV là loại virus RNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30 – 32 nm, không có

vỏ envelope được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ

Genome của TSV có kích thước khoảng 9 kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205

nucleotid, tạo chuỗi poly–A –3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) lớn

Hội chứng Taura được biết là bệnh của tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn còn nhỏ, xảy

ra trong khoảng 14 – 40 ngày sau khi thả Tôm bị hội chứng Taura thường là loại tôm giống nhỏ, khoảng 0,05 – 5 g, tuy nhiên tôm lớn hơn cũng có thể bị ảnh hưởng Quá trìnhdiễn biến của bệnh hội chứng Taura xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn của một chu kỳ lột xác Biểu hiện bệnh tiến triển theo 2 pha:

Pha tiền cấp tính có biểu hiện:

• Thường thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể

• Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển

• Biểu hiện sự lan tỏa vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏ nhạt, quạt đuôi và chân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khi lột xác

• Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của chu kỳ lột xác

• Là điểm nhạy cảm trong quá trình phát sinh bệnh hội chứng Taura

Pha mãn tính có biểu hiện: biểu hiện kiểu tổn thương của bệnh do vi khuẩn gây ra như có nhiều điểm bị đen hóa

3.3 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura

3.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng

Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôi có màu đỏ

rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểu mỏng vỏ, xoang tiêu hóa rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời gian lột xác

3.3.2 Phương pháp miễn dịch

Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (MAs) để xác định TSV ở những mẫu huyết

và dịch tế bào đồng thể từ tôm MAs còn có thể áp dụng để kiểm tra những mẫu mô đônglạnh, hoặc đã cố định Hiện trên thị trường có sản phẩm của DiagXotics

3.3.3 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen

Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kế trên trình

tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò (probe) Chất chỉ thị

có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang… Sau đó lai probe với DNA – RNA của virus Những probe này được tổng hợp trong phòng thí nghiệm hoặc từ những nguồn thương mại Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển

3.4 Vật liệu và phương pháp