ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1-CHƯƠNG 3-Ứng dụng khảo sát các phương pháp tinh sạch urease từ đậu nành

Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT Chương 3: Ứng dụng khảo sát phương pháp tinh urease từ đậu nành 3.1 Urease - Urease loại enzym thuỷ phân urea hình thành NH CO 2, ứng dụng nhiều Y học Công nghiệp thực phẩm để định lượng urea mẫu bệnh phẩm nước chấm Trước đây, có nhiều nghiên cứu enzyme urease đưa nhiều phương pháp tinh urease, nhiên chưa có nghiên cứu so sánh phương pháp tinh khác Ở nước ta, có số nghiên cứu tinh enzym urease từ đậu nành chưa đưa quy trình tinh hiệu chưa ứng dụng sản xuất chế phẩm urease Ngành Y học Thực Phẩm nước ta phải nhập chế phẩm urease kit urease từ nước với giá thành cao - Do tơi thực đề tài nhằm tìm quy trình tinh urease hiệu từ đậu nành, nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm Đồng thời sử dụng phương pháp điện di gel acrylamide để nghiên cứu thành phần enzyme urease từ đậu nành 1.5 Urease 1.5.1 Khái niệm - Urea sản phẩm trao đổi đạm thải với nước tiểu người, động vật có vú, bị sát vài lồi cá Urea hình thành gan - Urease protein tìm thấy vi khuẩn, nấm men số thực vật bậc cao 1.5.2 Tính chất - Urease enzyme xúc tác thủy phân urea thành carbon dioxide amoniac (NH2)2CO + H 2O → CO + 2NH - Urease đặc biệt tìm thấy Helicobacter pylori, kết hợp bốn sáu enzyme thường xuyên tiểu đơn vị lắp ráp tứ diện tồn thể 24 tiểu đơn vị α 12 β 12 - Có thể tác dụng với kim loại như: Nikel - Phân tử khối: 480 kDa 545 kDa o - Độ pH thuận lợi: 60 C Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT Hình 3.1 Cấu tạo urea - - Chất ức chế: kim loại nặng Pb Pb 2+ - Enzyme đặc thù: urease hydroxyurease Hình 3.2 Trung tâm hoạt động urease Quá trình thủy phân urea qua bước sau: Hình 3.3 Cơ chế phân hủy urea - Sau cacbamil acid tự động phân hủy để tạo thành amoniac carbon dioxide Sử dụng thuốc thử phenolphtalein dung dịch vừa tạo có màu đỏ có xuất ion OH - Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Người ta sử dụng urease để xác định hàm lượng urea máu Từ phương trình phản ứng ta định lượng hàm lượng urea dựa vào sản phẩm tạo thành CO NH dùng NH tác dụng với cetoglutarate NH3 + NADH → glutaric acid / NAD - Định lượng glutaric acid hay NAD để suy lượng urea máu - Phương trình tổng quát - Urea bị thủy phân enzyme urease hình thành nên amonia carbon dioxide Từ phản ứng kiểm sốt thay đổi độ dẫn điện ion theo thời gian Độ dẫn điện tương ứng với nồng độ ion hình thành suốt trình phản ứng 3.2 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nguyên liệu - Đậu nành loại bỏ hạt xấu, bỏ sâu mọt, xay mịn, loại lipid, bảo quản lạnh - Hoá chất: Urease chuẩn (urease Jack bean), Albumin bovine, Etherpetrolium, acetone, glycine, Tris(base), Coomassie Brilliant Blue – G250 (Merck), Nessler, EDTA, L-Cystein.HCl, Acrylamide bisacrylamide, SDS, TEMED, Amonium persulfate, Sephadex G 50, DEAE – Cellulose (Merck)… 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tủa sunfat amon + Phương pháp 1: tủa phân đoạn nồng độ 65% 55% bão hoà + Phương pháp 2: tủa phân đoạn nồng độ 20% 55% bão hoà - Phương pháp sắc ký: tách liên tục vi phân hỗn hợp chất + Sắc ký rây phân tử gel Cephadex G-50 (6×12cm) + Sắc ký trao đổi ion gel DEAE-Cellullose - Phương pháp Bradford: xác định hàm lượng protein - Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Phương pháp điện di: kiểm tra hiệu tinh sạch, điện di gel 10% polyacrylamid với tốc độ dòng 20mA, gel nhuộm với Coomassie Blue R-250 - Phương pháp siêu lọc: sử dụng thiết bị lọc membrane Vivaflow 3.2.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu [20] - Chiết xuất lấy enzyme: Nghiền kỹ bột đậu dung dịch HCl 0,4% có thêm -3 -3 EDTA (trilon B, complexon III) 5.10 M L cystein 5.10 M Sau ly tâm tách bã lấy dịch chiết o - Xử lý nhiệt: Nâng nhiệt nhanh đến 60 C, giữ 30 phút đem ly tâm tách bỏ cặn kết tủa - Siêu lọc: Dịch ly tâm lọc qua màng siêu lọc để loại bỏ peptid polypeptid có trọng lượng phân tử bé (M>500) - Kết tủa aceton: Dịch lọc xử lý aceton lạnh (tỷ lệ 1:1), ly tâm tách kết tủa Phần kết tủa đem hòa tan trisbuffer 0,1M, pH = chứa EDTA L -3 cystein 5.10 M - Sắc ký trao đổi ion: Dịch enzyme chạy sắc ký trao đổi ion cột chứa DEAE - cellulose với gradien nồng độ NaCl từ 0-1M Phân đoạn chứa enzyme sấy thăng hoa (đông khô) với chất saccharose làm chất ổn định với tỷ lệ 2,5mg/1mg enzyme Chế phẩm thu có hoạt tính tăng 25 lần so với ban đầu hiệu suất thu hồi 43% 3.3 Kết 3.3.1 Khảo sát phương pháp tinh urease từ đậu nành 3.3.1.1 Khảo sát nồng độ aceton để kết tủa enzyme - Kết so sánh độ tinh hiệu suất thu hồi enzym urease tủa với nồng độ aceton từ 30% - 60% trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết so sánh hiệu tủa enzym nồng độ aceton khác Giai Vdịch, ml đoạn mbột , mg Trích ly Aceton 150.00 882.75 P, mg/ml A, UI/ml Pt, mg (UI/mg) (mg/mg) 19.69 0.21 2953.50 104.40 185.38 1.36 Ap At, UI UI/mg Pr 15660.00 5.30 1200.54 6.48 Độ tinh H, % 1.00 1.22 100 7.67 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT 30% Aceton 2976.00 0.46 1368.96 1.79 5327.04 3.89 0.73 34.02 40% Aceton 3313.24 0.45 1490.96 1.87 695.76 4.16 0.78 39.55 50% Aceton 3788.25 0.44 1666.83 2.91 11023.81 6.61 1.25 70.39 60% - Kết bảng 3.1 cho thấy độ tinh mẫu tủa 30% 60% aceton gần lớn 1, hiệu suất thu hồi nồng độ aceton 60% nhiều gấp 10 lần so với nồng độ aceton 30% Ở mẫu tủa 40% 50% aceton có độ tinh thấp nhỏ hiệu suất thu hồi enzym không cao Kiểm tra mẫu qua điện di gel acrylamid 10%, kết trình bày hình 3.1 Hình 3.4 Kết điện di urease tủa nồng độ aceton khác - Điện di đồ hình 3.4 cho thấy: urease đậu rựa dù dạng tinh khiết xuất vạch rõ ràng, điều chứng tỏ urease đậu rựa loại enzyme heterogeneous Điện di đồ đậu nành chứa đủ vệt có điện di đồ đậu rựa Ngồi điện di đồ đậu nành cịn chứa số vạch khác rõ ràng, đặc biệt vạch thứ với độ đậm tăng dần từ nồng độ aceton 30% - 60% Kết chạy điện di cho thấy phương pháp tủa aceton có hiệu tinh chưa cao, lẫn nhiều protein tạp nên mẫu điện di chưa có phân tách rõ ràng Như từ kết kiểm tra hiệu tinh cho thấy nồng độ aceton 60% nồng độ dung mơi làm tủa enzyme urease có hiệu độ tinh hiệu suất thu hồi enzyme 3.3.1.2 Khảo sát kết tủa phân đoạn (NH4)2SO4 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Kết xác định độ tinh hiệu suất thu hồi hai phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 So sánh hiệu tinh phương pháp tủa phân đoạn (NH4)2SO4 Giai Vdịch, ml P, Pt, A, đoạn mbột , mg mg/ml mg Trích 150.00 ly P Pháp 1896.72 P Pháp 1214.25 Ap, Tinh UI/ml UI/mg (UI/mg (mg/mg A t, UI H, % pr ) 19.69 ) 2953 104.40 15660 5.30 1.00 100 0.19 50 360 1.60 00 3034.7 8.42 1.59 19.38 0.19 38 230 1.36 1651.3 7.16 1.35 10.55 71 - Các số liệu thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ tinh enzyme hiệu suất thu hồi enzyme cao so với phương pháp Tuy nhiên hiệu suất thu hồi enzyme phương pháp thấp, 10 – 20% Kiểm tra mẫu qua điện di gel acrylamid 10%, kết trình bày hình 3.5 Hình 3.5 Kết chạy điện di mẫu urease thu từ hai phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon - Kết điện di cho thấy, hai mẫu tủa Sunfate amonium xuất vạch tương đồng với mẫu chuẩn chứa vạch so với mẫu trích ly Ở mẫu tủa Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT theo phương pháp loại bớt protein tạp vạch số số 4, nhiên cịn sót thể thành vạch mờ Ở mẫu tủa sunfat amon theo phương pháp loại hoàn toàn protein tạp vạch 2, so với mẫu trích ly Điện di đồ mẫu tủa theo phương pháp lại vạch - Như vậy, phương pháp tủa phân đoạn Sunfate amonium theo phương pháp đem lại hiệu tinh tốt phương pháp Do chúng tơi chọn tủa Sunfate amonium theo phương pháp để tiếp tục bước nghiên cứu sau 3.3.1.3 Khảo sát trình tinh urease phương pháp sắc ký cột Sephadex G-50 - Lấy 0,5ml dịch trích ly điều chỉnh pH = cho lên cột Sephadex G-50) Rửa cột đệm phosphate pH = 7; 1/15M Kiểm tra hàm lượng protein hoạt tính enzyme phân đoạn Biếu đồ 3.1 Sắc ký đồ dịch trích ly từ đậu nành qua cột Sephadex G - 100 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT Hình 3.6 Kết điện di mẫu qua cột qua cột SephadexG-50Sephadex, phân đoạn - Từ sắc ký đồ cho thấy vị trí cực đại peak protein vị trí cực đại peak enzyme phân đoạn Để kiểm tra hiệu tinh sạch, tiến hành chạy điện di gel acrylamide 10% với chất chuẩn urease từ đậu rựa Kết trình bày hình 3.6 - Sắc ký đồ gel acrylamide cho thấy tất vạch mẫu trích ly xuất mẫu qua tinh Sephadex Điều có nghĩa trước sau chạy sắc ký lọc gel cột Sephadex G-50 chưa có hiệu mặt tinh sạch, Sephadex G-50 không phù hợp nên chưa thể loại bỏ số tạp chất 3.3.1.4 Siêu lọc - Dịch trích ly cho qua thiết bị lọc màng membrane có kích cỡ lỗ 10000 Da, áp suất lọc 2.5 bar, lọc 2h Sau qua siêu lọc, nồng độ enzyme mẫu cao Bảng 3.3 Kết đánh giá hiệu tinh phương pháp siêu lọc Giai Vdịch, ml P, đoạn Pt, mg A, mbột , mg mg/ml At , UI Độ UI/mg UI/ml Ap, tinh Trích 150.00 (mg/mg) (UI/mg) pr 27.28 4029.00 68.40 10260.00 2.51 ly Dung 90.00 29.34 H, % 1.00 100 2640.60 78.14 7032.60 2.66 1.06 68.54 2956.85 0.76 5226.06 1.77 0.71 50.94 dịch siêu lọc Siêu 6876.40 0.43 lọc đk - Khi sử dụng màng lọc 10000 Da nhỏ so với phân tử Urease nên hiệu tinh không cao, làm dịch enzyme đậm đặc Dịch siêu lọc sau đơng khơ bị giảm hoạt tính, số chất ổn định hoạt tính urease L-Cystein, EDTANa bị loại siêu lọc 3.3.2 So sánh phương pháp tinh - Kết so sánh phương pháp tinh sơ enzym urease trình bày bảng 3.4 Đồ án cơng nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT Bảng 3.4 So sánh hiệu tinh phương pháp Giai đoạn V dịch , P, Pt, mg A, A t, UI Ap, Độ H, % ml mg/ml UI/ml UI/mg tinh m bột, (mg/mg) (UI/mg) pr Trích ly Dung dịch mg 150.00 90.00 27.28 29.34 4029.00 68.40 2640.60 78.14 10260.00 2.51 7032.60 2.66 1.00 1.06 100 68.54 lọc SK 300.00 7.88 2362.50 23.08 6924.00 2.93 1.17 57.88 Cephadex (NH4)2SO 1906.00 0.39 743.34 1.48 2820.88 3.79 1.51 27.49 65% Aceton 4837.13 0.46 2225.08 1.47 7110.58 3.19 1.27 69.30 60% - Kết cho thấy tủa phân đoạn (NH 4)2SO theo phương pháp cho độ tinh cao (1,51), hiệu suất thu hồi lại tương đối thấp (18,01%) Ở phương pháp siêu lọc sắc ký Cephadex hiệu suất thu hồi cao, hiệu tinh lại không cao Phương pháp tủa aceton 69% thực đơn giản, thời gian tủa ngắn dễ thu hồi, q trình khơng ổn định, enzyme dễ biến tính Hơn nữa, bột sau đơng khơ độ hồ tan Bột đơng khơ thu từ mẫu tủa sunfat amon có độ tan tốt Kiểm tra mẫu qua điện di gel acrylamid 10%, kết trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Kết điện di urease qua phương pháp tinh Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Kết điện di hoàn toàn phù hợp với số liệu thực nghiệm bảng 3.4 Các phương pháp sắc ký rây phân tử, siêu lọc, tủa aceton khơng đem lại hiệu tinh cao, điều thể qua điện di đồ nhiều vạch tạp chất Ở mẫu tủa sunfat amon theo phương pháp có hiệu tinh cao nhất, điện di đồ cịn vạch rõ ràng, ngồi vạch tương ứng với vạch điện di đồ urease đậu rựa vạch thứ đậm Từ nhận xét trên, định chọn phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon theo phương pháp để tiếp tục qua sắc ký trao đổi ion 3.3.3 Kết tinh cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose - Trong phần này, thực thí nghiệm song song: 1) Mẫu enzyme urease đậu nành sau tinh phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon qua thẩm tích đối nước qua cột trao đổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH = 1/15M, gradient muối NaCl nồng độ từ – 1M Sắc ký đồ trình bày biểu đồ 3.2 2) Dung dịch sau thẩm tích đơng khơ chạy sắc ký trao đổi ion cột DEAE cellulose Sắc ký đồ trình bày biểu đồ 3.3 Biểu đồ 3.2 Sắc ký đồ DEAE-Cellullose dịch tủa (NH 4)2 SO phương pháp 10 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT Biểu đồ 3.3 Sắc ký đồ DEAE-cellulose bột tủa (NH 4)2SO phương pháp đông khô - Sắc ký đồ cho thấy tách phân đoạn dung dịch enzyme sau tủa (NH 4)2SO nhờ sắc ký trao đổi ion thu peak protein peak enzyme Vị trí cực đại peak enzyme trùng với vị trí cực đại peak protein thứ nồng độ muối 0,3M Enzyme tủa phân đoạn (NH 4)2SO sau đông khô qua sắc ký trao đổi ion có sắc ký đồ tương tự sắc ký đồ mẫu chưa đông khô, gồm peak protein peak enzyme Peak enzyme trùng với peak protein thứ 3, hoạt tính enzyme tập trung ống 11 12, ống 12 có hoạt tính cao Như vậy, mẫu dung dịch tủa (NH4)2SO tủa (NH4)2SO qua đông khô, enzyme urease đẩy nồng độ muối 0,3M Peak chứa enzyme urease thu sau sắc ký trao đổi ion kiểm tra độ tinh qua điện di, kết trình bày hình 3.8 Hình 3.8 Kết tinh qua giai đoạn tinh 11 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Kết điện di cho thấy, hiệu tinh kết tách phân đoạn qua cột sắc ký cao, loại bỏ gần toàn protein tạp Nhờ vậy, điện di đồ vạch rõ Kết hoàn toàn phù hợp với kết số nghiên cứu trước Từ đó, chúng tơi kết luận: urease đậu nành (Glycine max) đậu rựa (jackbean) có hoạt lực thuỷ phân nguyên liệu đặc hiệu khác phân tử lượng thành phần cấu tạo, cụ thể: kết sắc ký đồ điện di đồ thí nghiệm chúng tơi cơng trình nghiên cứu trước urease đậu rựa (jackbean) loại enzym heterogeneous, urease đậu nành (Glycine max) homogeneous Bảng 3.5 Kết tổng kết qua giai đoạn tinh Giai đoạn Vdịch, ml P, Pt, mg mbột , mg mg/ml A, UI/ml At , UI Ap, Độ UI/mg H, % tinh Trích ly Dung dịch 150.00 75.00 (mg/mg) (UI/mg) pr 24.66 3669.00 62.47 9370.50 2.55 14.25 1068.75 55.29 4146.75 3.88 1.00 1.52 100 44.25 (NH4)2SO DEAE 225.00 2.46 553.50 10.13 2279.25 4.12 1.62 24.32 dịch (NH4)2SO 1897.23 0.35 664.03 1.34 2542.29 3.83 1.50 27.13 đk DEAE – 379.45 371.86 5.07 1923.81 5.17 2.03 20.53 -Cell dung 0.98 Cell đk - Như vậy, qua cấp tinh urease tách khỏi protein tạp khác Ở mẫu tủa (NH 4)2SO qua đông khơ qua cột DEAE-cellulose hoạt tính chủ yếu tập trung ống, độ tinh cao mẫu dịch tủa (NH 4)2SO đạt 2,03 với hiệu suất thu hồi enzym 20,53 3.4 Kết luận Qua trình nghiên cứu giải vấn đề sau: - So sánh phương pháp tinh sơ enzyme urease kiểm tra độ tinh điện di gel acrylamide nhận thấy phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon 65% 55% hiệu so với phương pháp siêu lọc, tủa aceton, sắc ký rây phân tử 12 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose thu peak protein peak enzyme urease ứng với nồng độ muối 0,3M - Đã xây dựng quy trình thu nhận tinh enzyme urease từ đậu nành hiệu quả, loại bỏ gần toàn protein tạp, độ tinh đạt 2,03 hiệu suất thu hồi enzyme 20,53 - Sử dụng điện di để kiểm tra độ tinh enzyme xác định urease đậu nành loại homogeneous Trong nghiên cứu so sánh phương pháp tinh sơ enzyme urease: tủa phân đoạn sunfat amon, tủa aceton, sắc ký rây phân tử siêu lọc Dựa vào kết xác định độ tinh sạch, hiệu suất tinh enzyme kết kiểm tra độ tinh điện di gel acrylamid nhận thấy phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon nồng độ 65% 55% bão hoà hiệu Tiếp tục thực tinh qua sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose, sắc ký đồ cho thấy có peak protein có peak enzyme urease ứng với nồng độ muối 0,3 M Thu nhận peak enzyme, kiểm tra điện di gel acrylamid xác định urease đậu nành loại homogeneous Kết điện di chứng minh quy trình tinh tơi xây dựng tinh enzyme urease 13 ... siêu lọc 3.3.2 So sánh phương pháp tinh - Kết so sánh phương pháp tinh sơ enzym urease trình bày bảng 3.4 Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT Bảng 3.4 So sánh hiệu tinh phương pháp Giai đoạn V... Kết 3.3.1 Khảo sát phương pháp tinh urease từ đậu nành 3.3.1.1 Khảo sát nồng độ aceton để kết tủa enzyme - Kết so sánh độ tinh hiệu suất thu hồi enzym urease tủa với nồng độ aceton từ 30% - 60%... DEAE-Cellullose - Phương pháp Bradford: xác định hàm lượng protein - Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease Đồ án công nghệ Nguyễn Thị Thúy_11SHLT - Phương pháp điện di: kiểm tra hiệu tinh sạch,