kết hợp phương pháp pcr và reverse dot blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM GÂY BỆNH CHO CON NGƢỜI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ Tp Hồ Chí Minh, tháng 4/2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM GÂY BỆNH CHO CON NGƢỜI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA Nam, Nữ: Dân tộc: KINH Lớp, khoa: SH10A3 – Khoa công nghệ sinh học Năm thứ: Số năm đào tạo: Ngành học: Công nghệ sinh học vi sinh – sinh học phân tử Ngƣời hƣớng dẫn: ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG Tp Hồ Chí Minh, tháng 4/2014 MỤC LỤC THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI v THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ix DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ x DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH xi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiv ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I I.1 TỔNG QUAN SƠ LƢỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP I.1.1 Bacillus cereus I.1.1.1 Đặc điểm hình thái I.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.1.3 Thông tin gen I.1.2 Brucella spp I.1.2.1 Đặc điểm hình thái I.1.2.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.2.3 Thông tin gen I.1.3 Clostridium botulinum I.1.3.1 Đặc điểm hình thái I.1.3.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.3.3 Thông tin gen I.1.4 Clostridium perfringens I.1.4.1 Đặc điểm hình thái I.1.4.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.4.3 Thông tin gen I.1.5 Escherichia coli I.1.5.1 Đặc điểm hình thái I.1.5.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.5.3 Thông tin gen I.1.5.4 Phân loại I.1.6 Listeria monocytogenes I.1.6.1 Đặc điểm hình thái Trang i I.1.6.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.6.3 Thông tin gen I.1.7 Staphylococcus aureus I.1.7.1 Đặc điểm hình thái I.1.7.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng I.1.7.3 Thông tin gen 10 I.1.8 Salmonella spp 10 I.1.8.1 Đặc điểm hình thái 10 I.1.8.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng 10 I.1.8.3 Thông tin gen 11 I.1.9 Shigella spp 11 I.1.9.1 Đặc điểm hình thái 11 I.1.9.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng 11 I.1.9.3 Thông tin gen 12 I.1.10 Vibrio cholerae 12 I.1.10.1 Đặc điểm hình thái 12 I.1.10.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng 12 I.1.10.3 Thông tin gen 13 I.1.11 Vibrio parahaemolyticus 13 I.1.11.1 Đặc điểm hình thái 13 I.1.11.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng 13 I.1.11.3 Thông tin gen 14 I.1.12 Yersinia enterocolitica 14 I.2 I.1.12.1 Đặc điểm hình thái 14 I.1.12.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng 14 I.1.12.3 Thông tin gen 15 THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA 15 I.2.1 Gen 16S rDNA 15 I.2.2 Gen 23S rDNA 16 I.3 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CON NGƢỜI 17 I.3.1 Kỹ thuật định danh truyền thống [27] 17 I.3.2 Kỹ thuật sinh học phân tử đại 19 I.3.2.1 Kỹ thuật PCR[2][14] 19 Trang ii I.3.2.2 Multiplex PCR[14] 24 I.3.2.3 Phƣơng pháp microarray [66][61] [14] 24 I.3.2.4 Phƣơng pháp Reverse dot blot [14] 25 I.4 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NHANH CHĨNG VÀ ĐỒNG THỜI TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY BỆNH 26 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 PHẦN II II.1 VẬT LIỆU 29 II.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 II.2.1 Thu thập liệu khảo sát in silico 29 II.2.2 Thu thập liệu 29 II.2.3 Khảo sát in silico 29 II.2.3.1 Thu thập tr nh tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA 29 II.2.3.2 Thu thập cặp mồi 29 II.2.3.3 Phƣơng pháp khảo sát cặp mồi, thiết kế mồi 30 II.2.4 Khảo sát thực nghiệm 30 II.2.4.1 Tách chiết DNA 30 II.2.4.2 Kiểm tra chất lƣợng DNA thu nhận phƣơng pháp đo quang phổ 31 II.2.4.3 Phản ứng PCR: 32 II.2.4.4 Phƣơng pháp điện di: 33 II.2.4.5 Phƣơng pháp lai RDB 34 II.2.4.6 Khảo sát độ nhạy phƣơng pháp PCR-RDB 34 II.2.4.7 lúc Khảo sát khả phát đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh 35 PHẦN III III.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 Kết thu thập liệu khảo sát in silico 36 III.1.1 Thu thập liệu 36 III.1.2 Kết khảo sát in silico 37 III.1.2.1 Thu thập đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò 37 III.1.2.2 Khảo sát hệ cặp mồi 39 III.1.2.3 Khảo sát mẫu dò 47 III.2 Kết thực nghiệm 69 III.2.1 Tách chiết DNA 69 III.2.2 Kết khảo sát nhiệt độ lai mồi 16S rDNA 71 Trang iii III.2.3 Kết khuếch đại cặp mồi 16S_F – 16S_R chủng vi khuẩn đối chứng 72 III.2.4 Kết lai RDB chủng vi khuẩn đối chứng 73 III.2.5 Kết thực nghiệm mẫu bệnh phẩm 75 III.2.6 Khảo sát độ nhạy phƣơng pháp PCR-RDB 77 III.2.7 Kết phát đồng thời chủng vi khuẩn gây bệnh 78 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80 IV.1 KẾT LUẬN 80 IV.2 ĐỀ NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 91 Trang iv THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: “Kết hợp phƣơng pháp PCR Reverse Dot Blot phát đồng thời tác nhân vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho ngƣời” - Sinh viên thực (Nhóm trƣởng): NGUYỄN TRỌNG NGHĨA - Lớp: SH10A3 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: - Sinh viên thực 2: DƢƠNG NGỌC HUỲNH - Lớp: DH11SH02 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: - Sinh viên thực 3: NGUYỄN HOÀNG ANH TUẤN - Lớp: DH11SH01 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: - Sinh viên thực 4: VÕ THẮNG THƢỞNG - Lớp: DH11SH02 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: - Sinh viên thực 5: LÊ THỊ TỐ QUYÊN - Lớp: SH10A3 Khoa: CNSH Năm thứ: Số năm đào tạo: - Ngƣời hƣớng dẫn: ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình phát 12 tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột kỹ thuật PCR kết hợp lai phân tử (Reverse dot blot) sử dụng vùng trình tự 16 -23S rDNA, nhằm t m phƣơng pháp chẩn đốn nhanh, xác tác nhân vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp mẫu bệnh phẩm Tính sáng tạo: Chúng tơi kết hợp phƣơng pháp PCR lai ngƣợc dòng (PCR-Reverse Dot Blot) để phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Cho đến có công bố khoa học nƣớc ứng dụng kỹ thuật việc phát Trang v tác nhân vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung, nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nói riêng Phƣơng pháp khắc phục hạn chế phƣơng pháp phân tích truyền thống (tiêu tốn thời gian, độ xác, khó phát đồng thời thời gian, ) Kết nghiên cứu: Nhóm sinh viên khảo sát thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ nhạy mồi chung (universal primer) 12 mẫu dò chuyên biệt nhằm phát 12 loài vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Đồng thời nhóm sinh viên đạt đƣợc số kết đáng ghi nhận: − Thực phản ứng PCR – RDB mẫu DNA vi khuẩn đối chứng Chúng thực thành công chủng vi khuẩn đối chứng: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica − Áp dụng quy trình PCR – RDB 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu đƣợc xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm phƣơng pháp vi sinh thƣờng quy bệnh viện) Chúng ghi nhận 6/15 mẫu đƣợc phát nhiễm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, kết hoàn toàn trùng khớp với kết xét nghiệm truyền thống Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: − Đề tài nghiên cứu hoàn thiện việc xây dựng quy trình phát nhanh, nhạy xác định xác vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Đề tài có ý nghĩa cơng tác xét nghiệm, kiểm nghiệm bệnh truyền nhiễm tác nhân vi khuẩn gây nên nhƣ cơng tác phịng chống ngộ độc thực phẩm − Áp dụng quy trình mẫu bệnh phẩm thực tế, ghi nhận tính đặc hiệu, độ nhạy độ xác quy trình PCR-Reverse dot blot với mồi 12 mẫu dò chuyên biệt 12 vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài: Trang vi Ngày tháng năm 2014 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài Nguyễn Trọng Nghĩa  Nhận xét ngƣời hƣớng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài: Nhóm sinh viên thực đề tài, sinh viên Nguyễn Trọng Nghĩa làm trƣởng nhóm hồn thành tốt nội dung nghiên cứu giảng viên hƣớng dẫn đề nghị giai đoạn kế thừa kết nghiên cứu tiền đề sinh viên nhóm năm 2013 Kết thúc giai đoạn này, sinh viên thực việc xác định thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ nhạy mồi chung (universal primer) 12 mẫu dò chuyên biệt nhằm phát 12 lồi vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Đồng thời nhóm sinh viên đạt đƣợc số kết đáng ghi nhận: - Xác định tính đặc hiệu mồi 12 mẫu dò chủng vi khuẩn: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica - Xác định độ nhạy quy trình PCR-Reverse dot blot mẫu bệnh phẩm − Áp dụng thành cơng quy trình PCR-Reverse dot blot 15 mẫu bệnh phẩm (chai cấy máu) thu thập đƣợc thành phố Hồ Chí Minh Nhóm sinh viên thực quy trình PCR – RDB 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu) đƣợc xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm phƣơng pháp vi sinh thƣờng quy bệnh viện Kết ghi nhận 6/15 mẫu đƣợc phát nhiễm chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, kết hoàn toàn trùng khớp với kết xét nghiệm truyền thống Trang vii Ngày 07 tháng năm 2014 Ngƣời hƣớng dẫn Xác nhận đơn vị ThS TRƢƠNG KIM PHƢỢNG Trang viii TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Hà Vinh, (2011), Shigella kháng thuốc TP Hồ Chí Minh, Bệnh viện Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh, Tạp chí Thời y học, số 58 [2] Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, (2008), Sin Họ P ân ử, NXB Giáo dục, TP.Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Đức Lƣợng, (2003), Cơ Sở Côn N ệ Vi Sin Vật, NXB Giáo dục, TP.Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Hƣơng Thủy, Zachary W Bent, (2011), Vai trò YSCW việc tiết độc tố vi sinh vật gây bệnh Yersinia enterocolitica, Khoa Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Nơng nghiệp Hà Nội, Việt Nam, Tạp chí Khoa học Phát triển 2011, Tập 9, số 3: 485 – 491 [5] Nguyễn Minh Trực, Nguyễn Mạnh Hùng, Trịnh Thu Lê, Tô Kim Anh, (2008), Bƣớc đầu khảo sát nhiễm Listeria monocytogenes số thực phẩm thị trƣờng Hà Nội kĩ thuật polymerase chain reaction (PCR), Tạp chí khoa học cộng nghệ, Tập 46, số 2, 2008, trang 67-77 [6] Nguyễn Thị Xuân Trang cộng (2012), Tần số xuất Vibrio cholera tôm nhuyễn thể, xác định serotype O1, O139 biotype V cholera kỹ thuật Multiplex-PCR, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, trang 19 [7] Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Cẩm Ly, (2012), Phân lập xác định gen độc tố Vibrio parahaemolyticus hải sản tƣơi sống Nha Trang, Trƣờng Đại học Nha Trang, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ thủy sản [8] Trần Ngọc Bích, (2012), Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella thủy cầm sản phẩm thủy cầm tỉnh Hậu Giang, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa họ rườn Đại học Cần ơ, số 23a, trang 235-242 [9] Trần Thị Hƣơng Giang, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, (2012), Xác định tỷ lệ độc lực vi khuẩn Escherichia coli phân lập đƣợc từ thịt (lợn, bò, gà) số huyện ngoại thành Hà Nội, Khoa Thú y, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Tạp chí Khoa Trang 81 học Phát triển rườn Đại học Nông Nghiệp Hà Nội 2012, Tập 10, số 2: 295 – 300 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [10] Amit Kumar, Ajay Kumar, Vandana Kaushal, Sandip Patil, Chandani Payal, Anil Kumar, (2011), Antibacterial potential of some natural food preservatives against Staphylococcus aureus isolated from various food samples of himachal pradesh (India), World Journal of Science and Technology 2011, 1(10): 48-53 [11] Anthony RM, Brown TJ, French GL, (2000), Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array, J Clin Microbiol, 38(2):781-788 [12] Arun, Bhunia K, 2008, Foodborne Microbial Pathogens, Food Science Text Series [13] Ballmer K, Korczak BM, Kuhnert P, Slickers P, Ehricht R, Hächler H, (2007), Fast DNA Serotyping of Escherichia coli by Use of an Oligonucleotide Microarray, J Clin Microbiol, 45(2):370-379 [14] Bartlett J.M.S., Sterling D.,(2004) Methods in Molecular Biology, PCR Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ 226: 337 – 340 [15] Bavykin SG, Lysov YP, Zakhariev V, Kelly JJ, Jackman J, Stahl DA, Cherni A, (2004), Use of 16S rRNA, 23S rRNA, and gyrB gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microorganisms, J Clin Microbiol., 42(8):3711-3730 [16] Bottone EJ., (1997), Yersinia enterocolitica: the charisma continues, Clin Microbiol Rev., 10(2):257-276 [17] Bruant G, Maynard C, Bekal S, Gaucher I, Masson L, Brousseau R, Harel J, (2006), Development and validation of an oligonucleotide microarray for detection of multiple virulence and antimicrobial resistance genes in Escherichia coli Appl Environ Microbiol., 72(5):3780-3784 [18] Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland D, (2012), A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria., J Microbiol Methods., 69(2):330-339 Trang 82 [19] Chiang YC, Yang CY, Li C, Ho YC, Lin CK, Tsen HY, Identification of Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp and Vibrio spp with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization, Int J Food Microbiol, 107(2):131-137 [20] Chiba N, Murayama SY, Morozumi M, Nakayama E, Okada T, Iwata S, Sunakawa K, Ubukata K, (2009), Rapid detection of eight causative pathogens for the diagnosis of bacterial meningitis by real-time PCR, J Infect Chemother, 15(2):92-98 doi: 10.1007/s10156-009-0670-3 [21] Churchill RL, Lee H, Hall JC, (2006), Detection of Listeria monocytogenes and the toxin listeriolysin O in food., J Microbiol Methods., 64(2):141-170 [22] Clarridge JE, (2004), Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases, Clin Microbiol Rev., 17(4):840-862 [23] Collins MD, East AK, (1998), Phylogeny and taxonomy of the foodborne pathogen Clostridium botulinum and its neurotoxins, J Appl Microbiol, 84(1):517 [24] Elizaquível P, Aznar R., (2008), A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp and Staphylococcus aureus on fresh, minimally processed vegetables., Food Microbiol., 25(5):705-713 doi: 10.1016/j.fm.2008.03.002 [25] Eom HS, Hwang BH, Kim DH, Lee IB, Kim YH, Cha HJ, (2007), Multiple detection of food-borne pathogenic bacteria using a novel 16S rDNA-based oligonucleotide signature chip, Biosens Bioelectron., 15;22(6):845-853 [26] Ezquerra E, Burnens A, Jones C, Stanley J, (1993), Genotypic typing and phylogenetic analysis of Salmonella paratyphi B and S java with IS200, J Gen Microbiol., 139(10):2409-2014 [27] Falegan C, (2011), Microbiology profile and biochemical characteristics ofcommercial „ogiri‟ samples from south-western, nigeria, Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 1(2):187-203 Trang 83 [28] Fiss EH, Chehab FF, Brooks GF, (1992), DNA amplification and reverse dot blot hybridization for detection and identification of mycobacteria to the species level in the clinical laboratory, J Clin Microbiol., 30(5):1220-1224 [29] Foster G, Osterman BS, Godfroid J, Jacques I, Cloeckaert A, (2007), Brucella ceti sp nov and Brucella pinnipedialis sp nov for Brucella strains with cetaceans and seals as their preferred hosts, Int J Syst Evol Microbiol., 57(Pt 11):26882693 [30] Foster JT, Beckstrom-Sternberg SM, Pearson T, Beckstrom-Sternberg JS, Chain PS, Roberto FF, Hnath J, Brettin T, Keim P, (2009), Whole-genome-based phylogeny and divergence of the genus Brucella., J Bacteriol., 191(8):2864-2870 doi: 10.1128/JB.01581-08 [31] Fox GE, Stackebrandt E, Hespel RB, Gibson J, Maniloff J, Dyer TA, Wolfe RS, Balch WE, Tanner RS, Magrum LJ, Zablen LB, Blakemore R, Gupta R, Bonen L, Lewis BJ, Stahl DA, Luehrsen KR, Chen KN, and Wose CR, (1980), The phylogeny of prokaryotes, Science, 209:457-463 [32] Gaibani P, Mariconti M, Bua G, Bonora S, Sassera D, Landini MP, Mulatto P, Novati S, Bandi C, Sambri V, (2013), Development of a broad-range 23S rDNA real-time PCR assay for the detection and quantification of pathogenic bacteria in human whole blood and plasma specimens, Biomed Res Int, 2013:264651 doi: 10.1155/2013/264651 [33] Goji N, Macmillan T, Amoako KK, (2012), A New Generation Microarray for the Simultaneous Detection and Identification of Yersinia pestis and Bacillus anthracis in Food, J Pathog, 2012:627036 doi: 10.1155/2012/627036 [34] Guo D, Liu B, Liu F, Cao B, Chen M, Hao X, Feng L, Wang L, (2013), Development of a DNA microarray for molecular identification of all 46 Salmonella O serogroups, Appl Environ Microbiol., 79(11):3392-3399 doi: 10.1128/AEM.0022513 [35] Hamelin K, Bruant G, El-Shaarawi A, Hill S, Edge TA, Bekal S, Fairbrother JM, Harel J, Maynard C, Masson L, Brousseau R., (2006), A Virulence and Antimicrobial Resistance DNA Microarray Detects a High Frequency of Trang 84 Virulence Genes in Escherichia coli Isolates from Great Lakes Recreational Waters, Appl Environ Microbiol., 72(6):4200-4206 [36] Hong BX, Jiang LF, Hu YS, Fang DY, Guo HY, (2004), Application of oligonucleotide array technology for the rapid detection of pathogenic bacteria of foodborne infections, J Microbiol Methods, 58(3):403-411 [37] Hunt DE, Klepac-Ceraj V, Acinas SG, Gautier C, Bertilsson S, Polz MF, (2006), Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity, Appl Environ Microbiol, 72(3):2221-2225 [38] Jin LQ, Li JW, Wang SQ, Chao FH, Wang XW, Yuan ZQ, (2005), Detection and identification of intestinal pathogenic bacteria by hybridization to oligonucleotide microarrays, World J Gastroenterol., 11(48):7615-7619 [39] Johansson A, Aspan A, Bagge E, Båverud V, Engström BE, Johansson KE, (2006), Genetic diversity of Clostridium perfringens type A isolates from animals, food poisoning outbreaks and sludge, BMC Microbiol, 6:47 [40] Joshy L, Chaudhry R, Dhawan B, Das BK, Kumar L, Broor S, (2006), Enterotoxigenic Clostridium perfringens and sporadic diarrhoea: a study from an Indian tertiary care hospital., J Med Microbiol., 55(Pt 12):1757-1758 [41] Jurtshuk RJ, Blick M, Bresser J, Fox GE, Jurtshuk P Jr, (1992), Rapid in situ hybridization technique using 16S rRNA segments for detecting and differentiating the closely related gram-positive organisms Bacillus polymyxa and Bacillus macerans., Appl Environ Microbiol., 58(8):2571-2578 [42] Kenneth Todar, (2005), Todar‟s Online Textbook of Bacteriolygy University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus), Kenneth Todar University of Wisconsin- Madison Department of Bacteriology [43] Koo K, Jaykus LA, (2003), Detection of Listeria monocytogenes from a model food by fluorescence resonance energy transfer-based PCR with an asymmetric fluorogenic probe set, Appl Environ Microbiol., 69(2):1082-1088 [44] Kostić T, Weilharter A, Rubino S, Delogu G, Uzzau S, Rudi K, Sessitsch A, Bodrossy L, (2007), A microbial diagnostic microarray technique for the sensitive detection and identification of pathogenic bacteria in a background of nonpathogens, Anal Biochem, 360(2):244-254 Trang 85 [45] Kurella M, Hsiao LL, Yoshida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR., (2001), DNA microarray analysis of complex biologic processes, J Am Soc Nephrol.,12(5):1072-1078 [46] Lecour H, Ramos H, Almeida B, Barbosa R., (1988), Food-borne botulism A review of 13 outbreaks., Arch Intern Med., 148(3):578-580 [47] Lee DY, Shannon K, Beaudette LA., (2006), Detection of bacterial pathogens in municipal wastewater using an oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR, J Microbiol Methods, 65(3):453-467 [48] Maity B, Trivedi R, Kashyap VK, (2008), Development of a macroarray based on 16S-23S rDNA probe hybridization rapid diagnosis of human pathogenic bacteria, Indian Journal Biotechnology, 7:448-455 [49] Mao Z, Zheng H, Wang X, Lin S, Sun Y, Jiang B, 2008, DNA microarray for direct identification of bacterial pathogens in human stool samples, Digestion., 78(2-3):131-138 [50] María Naranjo, Sarah Denayer, Nadine Botteldoorn, Laurence Delbrassinne, Jean Veys, Jacques Waegenaere, Nicolas Sirtaine, Ronald B Driesen, Karin R Sipido,6 Jacques Mahillon, and Katelijne Dierick, (2011), Sudden Death of a Young Adult Associated with Bacillus cereus Food Poisoning, J Clin Microbiol., 49(12): 4379–4381 [51] Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K, (2007), Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcriptionPCR, Appl Environ Microbiol,73(1):32-39 [52] Maynard C, Berthiaume F, Lemarchand K, Harel J, Payment P, Bayardelle P, Masson L, Brousseau R., (2005), Waterborne pathogen detection by use of oligonucleotide-based microarrays., Appl Environ Microbiol., 71(12):8548-8557 [53] Meyer Me, (1961), Metabolic characterization of the genus Brucella III Oxidative metabolism of strains that show anomalous characteristics by conventional determinative methods, J Bacteriol., 82:401-410 [54] Myers ML, Panicker G, Bej AK, (2003), PCR detection of a newly emerged pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 pathogen in pure cultures and seeded waters from the Gulf of Mexico, Appl Environ Microbiol, 69(4):2194-2200 Trang 86 [55] Na-Ubol M, Srimanote P, Chongsa-Nguan M, Indrawattana N, Sookrung N, Tapchaisri P, Yamazaki S, Bodhidatta L, Eampokalap B, Kurazono H, Hayashi H, Nair GB, Takeda Y, Chaicumpa W, (2011), Hybrid & El Tor variant biotypes of Vibrio cholerae O1 in Thailand, Indian J Med Res, 133:387-394 [56] Nelson BP, Liles MR, Frederick KB, Corn RM, Goodman RM, (2002), Label-free detection of 16S ribosomal RNA hybridization on reusable DNA arrays using surface plasmon resonance imaging, Environ Microbiol., 4(11):735-743 [57] Nguyen TV, Le Van P, Le Huy C, Gia KN, Weintraub A, (2005), Detection and characterization of diarrheagenic Escherichia coli from young children in Hanoi, Vietnam, J Clin Microbiol, 43(2):755-760 [58] Palka-Santini M, Cleven BE, Eichinger L, Krönke M, Krut O., (2009), Large scale multiplex PCR improves pathogen detection by DNA microarrays, BMC Microbiol., 9:1 doi: 10.1186/1471-2180-9-1 [59] Panicker G, Call DR, Krug MJ, Bej AK., (2004), Detection of pathogenic Vibrio spp in shellfish by using multiplex PCR and DNA microarrays., Appl Environ Microbiol., 70(12):7436-7444 [60] Pei AY, Oberdorf WE, Nossa CW, Agarwal A, Chokshi P, Gerz EA, Jin Z, Lee P, Yang L, Poles M, Brown SM, Sotero S, Desantis T, Brodie E, Nelson K, Pei Z, (2010), Diversity of 16S rRNA Gens within individual Prokaryotic genomes, Appl Environ Microbiol, 76(12):3886-3897 doi: 10.1128/AEM.02953-09 [61] Rasooly A, Herold KE, (2008), Food microbial pathogen detection and analysis using DNA microarray technologies, Foodborne Pathog Dis.,5(4):531-550 doi: 10.1089/fpd.2008.0119 [62] Rodríguez-Lázaro D, Pla M, Scortti M, Monzó HJ, Vázquez-Boland JA., (2005), A novel real-time PCR for Listeria monocytogenes that monitors analytical performance via an internal amplification control., Appl Environ Microbiol 71(12):9008-9012 [63] Rudi K, Treimo J, Nissen H, Vegarud G, (2003), Protocols for 16S rDNA Array Analyses of Microbial Communities by Sequence-Specific Labeling of DNA Probes, ScientificWorldJournal., 3:578-584 Trang 87 [64] Rudi K, Treimo J, Nissen H, Vegarud G., (2003), Protocols for 16S rDNA array analyses of microbial communities by sequence-specific labeling of DNA probes, ScientificWorldJournal.,3:578-584 [65] Salehi TZ, Tonelli A, Mazza A, Staji H, Badagliacca P, Tamai IA, Jamshidi R, Harel J, Lelli R, Masson L, (2012), Genetic characterization of Escherichia coli O157:H7 strains isolated from the one-humped camel (Camelus dromedarius) by using microarray DNA technology Mol Biotechnol., 51(3):283-288 doi: 10.1007/s12033-011-9466-7 [66] Tanja Kostić , Angela Sessitsch, (2012), Microbial Diagnostic Microarrays for the Detection and Typing of Food- and Water-Borne (Bacterial) Pathogens, Microarrays, 1(1):3-24; [67] Uzuka R, Kawashima H, Hasegawa D, Ioi H, Amaha M, Kashiwagi Y, Takekuma K, Hoshika A, Chiba K, (2004), Rapid diagnosis of bacterial meningitis by using multiplex PCR and real time PCR, Pediatr Int, 46(5):551-554 [68] Walsh F, Cooke NM, Smith SG, Moran GP, Cooke FJ, Ivens A, Wain J, Rogers TR, (2010), Comparison of two DNA microarrays for detection of plasmidmediated antimicrobial resistance and virulence factor genes in clinical isolates of Enterobacteriaceae and non-Enterobacteriaceae, 35(6):593-598 doi: 10.1016/j.ijantimicag [69] Wang M, Cao B, Gao Q, Sun Y, Liu P, Feng L, Wang L., (2009), Detection of Enterobacter sakazakii and other pathogens associated with infant formula powder by use of a DNA microarray, J Clin Microbiol., 47(10):3178-3184 doi: 10.1128/JCM.00366-09 Epub 2009 Jul 29 [70] Wang RF, Beggs ML, Robertson LH, Cerniglia CE, (2002), Design and evaluation of oligonucleotide-microarray method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples, FEMS Microbiol Lett, 213(2):175-182 [71] Werner G, Strommenger B, Klare I, Witte W, (2004), Molecular detection of linezolid resistance in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis by use of 5' nuclease real-time PCR compared to a modified classical approach, J Clin Microbiol,42(11):5327-5331 Trang 88 [72] Wise MG, Siragusa GR Quantitative detection of Clostridium perfringens in the broiler fowl gastrointestinal tract by real-time PCR, Appl Environ Microbiol, 71(7):3911-3916 [73] Woo PC, Lau SK, Teng JL, Tse H, Yuen KY., (2008), Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories Clin Microbiol Infect.,14(10):908-934 doi: 10.1111/j.1469-0691.2008.02070.x [74] Xing JM, Zhang S, Du Y, Bi D, Yao LH, (2009), Rapid detection of intestinal pathogens in fecal samples by an improved reverse dot blot method, World J Gastroenterol., 15(20): 2537-2542 [75] Xing JM, Zhang S, Zhang HH, Shen CF, Bi D, Li G, Yao LH, (2008), Detection and identification of seven clinical common pathogenic bacteria by oligonucleotide microarray, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 29(8):815-818 [76] Zhu LX, Zhang ZW, Wang C, Yang HW, Jiang D, Zhang Q, Mitchelson K, Cheng, (2007), Use of a DNA microarray for simultaneous detection of antibiotic resistance genes among staphylococcal clinical isolates J Clin Microbiol 45(11):3514-3521 INTERNET [77] http://www.foodsafety.asn.au/resources/bacillus-cereus-and-other- bacillus-species/ [78] http://medchrome.com/basic-science/microbiology/brucella-and- brucellosis/ [79] http://www.extension.org/pages/13215/clostridium- botulinum#.U0L5LlcZUT0 [80] http://www.idimages.org/atlas/organism/?atlasentryID=5&organism=Cl ostridium [81] http://sfappeal.com/2013/11/local-food-distributor-might-be-behind-e- coli-outbreak-at-trader-joes/ [82] http://www.ehagroup.com/resources/pathogens/listeria-monocytogenes/ [83] http://www.healthhype.com/lab-tests-for-staph.html Trang 89 [84] http://textbookofbacteriology.net/salmonella.html [85] http://aapredbook.aappublications.org/content/1/SEC131/SEC259/F1802 expansion.html [86] http://www.phsource.us/PH/FHM/BIOTERRORISM.htm [87] http://www.revista.unam.mx/vol.6/num4/art33/art33.html [88] http://www.ehagroup.com/resources/pathogens/yersinia-enterocolitica/ [89] http://www.nk-biotek.com.vn/Detail.asp?ID=294&CategoryID=2 [90] http://www.readcube.com/articles/10.1038/nprot.2006.404) Trang 90 PHỤ LỤC Phụ Lục Bảng III.9 – Thông tin mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu STT Tên mẫu Tên Bệnh Nhân Phái Tuổi 1 Trần Thị C Nữ 1924 2 Nguyễn Huy L Nam 1983 3 Nguyễn Thị Thanh T Nữ 1966 4 Nguyễn Văn P Nam 1960 5 Đinh Thị T Nữ 1944 6 Nguyễn Văn U Nam 1934 7 Trần Thị N Nữ 1955 8 Lê Thị K Nữ 1962 9 Phạm Thị C Nữ 1949 10 10 Trần Mạnh T Nam 1994 11 11 Đinh Văn T Nam 1923 12 12 Nữ 1918 13 14 Nguyễn Thị T Trần Thị A Nữ 1951 14 13 Tô Trọng Q Nam 1937 15 15 Nguyễn Văn T Nam 1962 Chú thích (-) âm tính, (+) dƣơng tính Trang 91 Tên Vi Khuẩn Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Staphylococcus aureus Klebsiella oxytoca Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Escherichia coli Stenotrophomonas maltophilia Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Kết RDB + + + + + + - Phụ lục Bảng III.10 – Kết cấy trang (số khuẩn lạc) mật độ tế bào CFU/ml Nồng độ 10-6 10-7 10-8 Đĩa 28 13 Đĩa 27 12 Đĩa 23 15 Từ bảng III.10, Dựa vào cơng thức tính đƣợc trình bày mục II.2.2.6 ta tính đƣợc mật độ tế bào vi khuẩn có 1ml dịch khuẩn 4,8 * 109 CFU/ml Với lƣợng dịch khuẩn mật độ tiến hành tách chiết đƣợc nồng độ DNA từ 34,8175 – 170,2461 µl/µl Trang 92 Phụ lục Kết giải trình tự mẫu bệnh phẩm số Kết giải trình tự mẫu số với mồi 16S_F Trang 93 Kết giải trình tự mẫu số với mồi 16S_F Trang 94 Phụ lục Kết Blast trình tự mẫu bệnh phẩm sô với vặp mồi 16S_F – 16S_R Trang 95 ... Reverse Dot Blot? ??, thực đề tài nghiên cứu khoa học: “ Kết Trang hợp phƣơng pháp PCR Reverse dot blot phát đồng thời tác nhân vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho ngƣời” nhằm tiếp tục triển khai vi? ??c... THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: ? ?Kết hợp phƣơng pháp PCR Reverse Dot Blot phát đồng thời tác nhân vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho ngƣời” - Sinh vi? ?n thực... KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VI? ?N THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH