Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae doc

Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae P. H. Van (1) , N. P. N. Ha (2) , N. T. M. Thu (3) , D. T. T. Thuy (4) Tóm tắt Với hai chủng vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát hiện từng tác nhân riêng lẻ đạt đến 1 DNA bộ gen vi khuẩn trong thể tích phản ứng, và độ nhạy phát hiện hai tác nhân vi khuẩn trong cùng một phản ứng được tiên đoán là rất thuận lợi trong thực tế trên bệnh nhân. Summary “Prepare the Multiplex PCR mix detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae sulmutaneously” With two strains of N. gonorrhoeae and C. trachomatis in hand, the authors have prepared successfully the multiplex PCR mix detecting these two bacteria sulmutaneously with the sensitivity in detecting these bacteria separately reaches 1 DNA genome of the target bacteria in the volume of reaction; and the study also revealed that the sensitivity in detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae simultaneously is favored for the detecting of these bacteria from infected patients. Đặt vấn đề C. trachomatis và N. gonorrhoeae là hai tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng đường sinh dục rất thường gặp với các hậu quả cũng khá nặng nề nếu không phát hiện và chữa trị (1,2) . Phương pháp thông thường nhất hiện nay để phát hiện C. trachomatic là dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp để phát hiện vi khuẩn trong các quệt cổ tử cung, tuy nhiên phương pháp này cho kết quả khá chủ quan vì tuỳ thuộc vào kỹ năng và kinh nghiệm người đọc kết quả trên kính hiển vi huỳng quang. Để phát hiện N. gonorrhoeae thì nuôi cấy là phương pháp thường được dùng nhất, tuy nhiên có rất nhiều trườ ng hợp nuôi cấy thất bại vì bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó. Chính vì vậy phương pháp được cho là nhạy cảm và thích hợp nhất hiện nay để phát hiện hai tác nhân C. trachomatis và N. gonorrhoeae là kỹ thuật PCR. Hiện nay đã có kit phát hiện đồng thời N. gonorrhoeae và C. trachomatis bằng kỹ thuật PCR-ELISA được sản xuất bởi Roche Diagnostic. Tuy nhiên kit này ít được sử dụng tại Việt Nam vì giá thành khá cao, đồng thời cũng khá phức tạp khi thực hiện xét nghiệm. Trong nước cũng có vài tác giả cố gắng sản xuất kit PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân này nhưng cũng chưa thành công vì không có điều kiện thử nghiệm trên chủng vi khuẩn thật sự, đặc biệt là chủng C. trachomatis, ngoài ra các nơi dự định sản xuất các kit này cũng không phải là nơi sản xuất chuyên nghiệp với đầy đủ kinh nghiệm sản xuất cũng nh ư hệ thống kiểm soát chất lượng. Chính vì vậy mặc dù trước đây chúng tôi đã có kit phát hiện C. trachomatis nhưng vì hiện vẫn có nhiều khách hàng muốn được chúng tôi cung cấp thêm kit PCR phát hiện đồng thời C. trachomatis và N. gonorrhoeae cho tiện sử dụng, nên đơn vị R&D của chúng tôi cũng đã đặt ra mục tiêu chế tạo kit PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân này. Mục tiêu của công trình này là tìm hiểu độ nhạy cảm và độ đặ c hiệu của kit PCR này trên các chủng vi khuẩn C. trachomatis và N. gonorrhoeae thật sự. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Mẫu thử trong nghiên cứu là các trích biệt DNA từ các huyền dịch vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis. Vi khuẩn N. gonorrhoeae là chủng vi khuẩn được phân lập trên bệnh nhân, được định danh chính xác nhờ hình ảnh song cầu Gram [-], tính chất oxidase [+], và chỉ lên men đường glucose trong thử nghiệm lên men đường nhanh Cummitech 4. Vi khuẩn được phòng R&D của công ty Nam Khoa bảo quản ở -70 o C. Để chuẩn bị cho thử nghiệm, vi khuẩn được cấy phân lập lại trên thạch nâu, ủ 37 o C trong tủ ấm CO 2 trong 48 giờ. Sau đó vi khuẩn được gặt trong nước muối sinh lý để đạt độ đục tương đương 10 6 vi khuẩn/ml). Huyền dịch vi khuẩn này được đun cách thuỷ trong 10 phút kể từ lúc nước sôi, sau đó ly tâm 13.000RPM/5 phút. Dịch nổi chính là trích biệt DNA của N. gonorrhoeae. Dịch nổi này được pha loãng trong đệm TE theo hệ số pha loãng 10 1 (1) BS., TS., Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM; Cố vấn chất lượng và trưởng phòng QA Công Ty Nam Khoa. (2) CN., Trưởng phòng Vi Sinh-SHPT Bệnh Viện Phong và Da Liễu Qui Hòa, Qui Nhơn. (3)CN., Nghiên cứu viên phòng R&D Công Ty Nam Khoa. (4) BS., ThS., Giảng viên Bộ Môn Hoá Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM; Trưởng phòng R&D công ty Nam Khoa. Công trình được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa. để có các độ pha loãng 1 (không pha loãng), 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , và 10 -6 được đặt tên là G 0 , G 1 , G 2 , G 3 , G 4, G 5 và G 6 tương đương 10 4 /10µl, 10 3 /10µl, 10 2 /10µl, 10/10µl, 1/10µl và 0.1/10µl. Vi khuẩn C. trachomatis là hai dòng vi khuẩn 1 và 2 xin từ Khoa Sinh Học, Đại Học Royal Holloway thuộc Đại Học London, Anh. Hai dòng này được cung cấp dưới dạng huyền dịch có nồng độ vi khuẩn đạt 10 7 vi khuẩn/ml. Tại Phòng R&D của công ty Nam Khoa, hai dòng vi khuẩn được giữ ở -70 o C. Trước khi trích biệt DNA, pha loãng hai huyền dịch vi khuẩn này 1/100 trong đệm TE để đạt nồng độ vi khuẩn 10 5 /ml. Dùng hai phương pháp trích biệt DNA cho huyền dịch C. trachomatis này: Phương pháp đun cách thuỷ trong 10 phút kể từ lúc nước sôi và sau đó ly tâm để lấy dịch nổi – như vậy là có 2 mẫu d1 và d2, và phương pháp trích biệt DNA bằng bộ DNAPREP- BOOM do công ty Nam Khoa sản xuất theo đúng qui trình hướng dẫn kèm theo – như vậy là có 2 mẫu b1 và b2. Ngoài ra, chúng tôi còn dùng thêm mẫu chứng âm là trích biệt DNA từ quệt cổ tử cung lấy từ người không nhiễm hai tác nhân trên đã được xác định bằ ng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện C. trachomatis âm tính và cấy cũng như soi trực tiếp âm tính N. gonorrhoeae. Mẫu chứng âm này được trích biệt DNA bằng phương pháp dùng phenol-chloroform với bộ DNAPREP-PHCHL do công ty Nam Khoa sản xuất và thực hiện theo hướng dẫn đi kèm. Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời C. trachomatis và N. gonorrhoeae do phòng R&D của công ty Nam Khoa điều chế gồm các thành phần chính: Taq polymerase và PCR buffer của Biorad, dNTP của Roche, dUTP và UNG của Amersham, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen tổng hợp) cho đoạn DNA dài 241bp trên crytic plasmid của C. trachomatic, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen tổng hợp) cho đoạn DNA dài 390bp trên crytic plasmid của N. gonorrhoeae, MgCl 2 của Biorad. Có hai loại multiplex PCR mix được pha, loại chứa hàm lượng mồi 50pm/thể tích phản ứng, và loại chứa hàm lượng mồi 25pm/thể tích phản ứng. Hai loại PCR mix này được đặt tên là Multiplex CHL-GNC PCR mix 50pm và Multiplex CHL- GNC PCR mix 25pm. Thể tích của PCR mix là 40µl, để thể tích của mẫu thử cho vào là 10µl, và như vậy thể tích phản ứng là 50µl. Trước hết chúng tôi tìm hiểu phương pháp trích biệt DNA của huyền dịch C. trachomatis bằng ph ương pháp BOOM và bằng phương pháp đun cách thuỷ, phương pháp nào tốt hơn?. Đồng thời chúng tôi cũng tìm hiểu hàm lượng mồi 50pm và 25pm đặc hiệu C. trachomatis và N. gonorrhoeae, hàm lượng nào cho kết quả khuếch đại tốt hơn?. Để trả lời hai câu hỏi này chúng tôi thực hiện thử nghiệm PCR với các mẫu trích biệt DNA đã chuẩn bị ở trên cho vào 9 tube PCR mix 50pm và 7 tube PCRmix 25pm theo như trình bày trong bảng 1 sau đây. Bảng 1: Mẫu trích biệt DNA và thể thích mẫu (µl) được cho vào hai loại PCR mix CHL-GNC PCR mix 50pm CHL-GNC PCR mix 25pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 d1 (µl) 10 10 d2 (µl) 10 10 b1 (µl) 10 10 b2 (µl) 10 10 G 1 (µl) 10 10 G 2 (µl) 10 10 G 3 (µl) 10 10 G 4 (µl) 10 C (-) 10 Các PCR mix sau khi đã cho các mẫu thử được cho vào máy PCR, chúng tôi sử dụng máy iCycler loại Dual-block của Biorad, và chạy PCR theo chương trình luân nhiệt sau: 40 o C/10 phút, 95 o C/5 phút, 40 chu kỳ 94 o C/45 giây – 55 o C/45 giây – 72 o C/1 phút, 72 o C/7 phút. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 2% pha trong TBE 0.5X và có trộn thêm 0.01mg ethidium bromide trong 50ml thạch. Thạch điện di được pha từ bộ thuốc thử điện di AGE do công ty Nam Khoa sản xuất theo hướng dẫn đi kèm. Thang DNA được chạy điện di song song với sản phẩm PCR cũng do công ty Nam Khoa sản xuất, đây là thang 100-1000bp với khoảng cách mỗi vạch là 100bp. Sau khi đã có kết quả xác định được PCR mix có hàm lượng mồi nào là thích hợp nhất và trích biệt nào là tốt nhất đối với huyền dịch C. trachomatis, chúng tôi tiến hành xác định độ nhạy cảm của PCR mix này trong phát hiện C. trachomatis và N. gonorrhoeae riêng lẻ cũng như 2 trong phát hiện đồng thời. Phương pháp xác định độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân riêng lẻ được tiến hành như sau: (1) Trước hết pha loãng trích biệt DNA (cho kết quả tốt nhất) trong TE theo hệ số pha loãng 10 để có các độ pha loãng 1 (không pha loãng), 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 được đặt tên là C 0 , C 1 , C 2 , và C 3 , tương đương 10 3 /10µl, 10 2 /10µl, 10/10µl, và 1/10µl. (2) Cho các độ pha loãng của trích biệt DNA của C. trachomatis vừa chuẩn bị và các độ pha loãng của trích biệt DNA của N. gonorrhoeae đã chuẩn bị trước đó (các mẫu G 0 , G 1 , G 2 , G 3 , G 4, G 5 và G 6 ) vào các PCR mix, lượng mẫu cho vào là 10µl. (3) Chạy PCR theo chương trình luân nhiệt sau: 40 o C/10 phút, 95 o C/5 phút, 40 chu kỳ 94 o C/45 giây – 55 o C/45 giây – 72 o C/1 phút, 72 o C/7 phút. (4) Sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 2% pha trong TBE 0.5X như trên, đọc kết quả xác định độ nhạy cảm là hàm lượng thấp nhất của DNA bộ gen của hai vi khuẩn C. trachomatis và N. gonorrhoeae còn cho được kết quả sản phẩm khuếch đại. Để xác định độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân C. trachomatis và N. gonorrhoeae đồng thời, chúng tôi thực hiện thử nghi ệm PCR với các độ pha loãng của các trích biệt DNA của C. trachomatis và N. gonorrhoeae các cho vào 16 PCR mix sao cho các nồng độ DNA của C. trachomatis đều gặp được các nồng độ DNA của N. gonorrhoeae. Sau đó chạy PCR và phát hiện và đánh giá các kết quả sản phẩm khuếch đại điện di trong thạch agarose 2% như phương pháp đã trình bày ở trên. Bảng 2 dưới đây trình bày cách cho các pha loãng mẫu trích biệt DNA của C. trachomatis và N. gonorrhoeae vào các PCR mix để đạt đượ c yêu cầu này. Bảng 2: Các pha loãng mẫu trích biệt DNA và thể tích mẫu (µl) được cho vào PCR mix PCR mix 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 C 0 (µl) 5 5 5 5 C 1 (µl) 5 5 5 5 C 2 (µl) 5 5 5 5 C 3 (µl) 5 5 5 5 G 3 (µl) 5 5 5 5 G 4 (µl) 5 5 5 5 G 5 (µl) 5 5 5 5 G 6 (µl) 5 5 5 5 Kết quả Kết quả điện di trong hình 1 cho thấy phương pháp trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp đun tỏ ra có hiệu quả hơn phương pháp Boom vì trong cả hai mẩu C. trachomatis 1 và C. trachomatis 2, vạch khuếch đại sản phẩm PCR với DNA trích biệt bằng phương pháp đun cách thuỷ (giếng 2, 4, 11 và 13) cho kết quả sáng đậm hơn và rõ nét hơn phương pháp Boom (giếng 1, 3, 10 và 12). Ngoài ra kết quả trên hình 1 cũng cho th ấy PCR mix 50pm có vẻ tốt hơn PCR mix 25pm vì với mẫu trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp Boom, kết quả PCR cho thấy mẫu b1 không cho sản phẩm khuếch đại với PCR mix 25pm, nhưng vẫn cho sản phẩm khuếch đại với PCR mix 50pm. Từ kết quả này, chúng tôi chọn phương pháp trích biệt DNA cho huyền dịch vi khuẩn C. trachomatis là phương pháp đun cách thuỷ, đồng thời chúng tôi chọn PCR mix có hàm lượng mồi 50pm cho các thí nghiệm xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix. Kết quả điện di trong hình 2 cho thấy Multiplex CHL-GNC PCR mix 50pm có độ nhạy cảm phát hiện N. gonorrhoeae và C. trachomatis riêng lẻ đạt đến 1 bộ gen vi khuẩn trong một thể tích mẫu cho vào tube phản ứng. Tuy nhiên, kết quả điện di trong hình 3 thì cho thấy trong phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này cùng một lúc thì với các mẫu thử có hàm lượng DNA bộ gen C. trachomatis cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiệ n N. gonorrhoeae. Trong khi các mẫu có hàm lượng DNA bộ gen của N. gonorrhoeae dù rất cao (đến 10 4 bộ gen DNA trong thể tích phản ứng) vẫn không ảnh hưởng đến khả năng phát hiện C. trachomatis. Kết quả này rất thuận lợi trong thực tế phát hiện bệnh vì thông thường nếu một người nhiễm C. trachomatis thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử sẽ rất thấp, trong khi đó nếu nhiễm N. gonorrhoeae thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử sẽ cao hơn. 3 4 C 0 C 1 C 2 C 3 mk mk G 2 G 3 G 4 G 5 G 6 Hình 2: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 trong phát hiện từng tác nhân C. trachomatis (gel bên trái) và N. gonorrhoeae (gel bên phải). Kết quả cho thấy PCR mix có khả năng phát hiện N. gonorrhoeae đến nồng độ G 5 , tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube phản ứng; khả năng phát hiện C. trachomatis đến nồng độ C 3 , tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube phản ứng. 1 2 mk 3 4 5 6 7 8 9 mk PCR mix 50pm 10 11 12 13 14 15 16 mk PCR mix 25pm Hình 1: K ết quả điện di sản phẩm PCR, gel bên trái là PCR mix 50, gel bên phải là PCR mix 25. Giếng 1,3, 10, 12: trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp Boom; giếng 2, 4, 11, 13 là trích biệt DNA của C. trachomatis bằng phương pháp đun cách thuỷ; Giếng 5 đến 16 là trích biệt DNA của N. gonorrhoeae bằng phương pháp đun cách thuỷ với giếng 5, 14 là G1; giếng 6, 15 là G2; giếng 7, 16 là G3; giếng 8 là G4. G 3 G 4 G 5 G 6 G 3 G 4 G 5 G 6 G 3 G 4 G 5 G 6 G 3 G 4 G 5 G 6 C 0 C 0 C 0 C 0 C 1 C 1 C 1 C 1 C 2 C 2 C 2 C 2 C 3 C 3 C 3 C 3 Hình 3: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 trong phát hiện cùng một lúc hai tác nhân C. trachomatis (vạch khuếch đại 241bp) và N. gonorrhoeae (vạch khuếch đại 390bp). Bàn luận Chlamydia trachomatis là một trong các tác nhân nhiễm trùng lây truyền bằng đường tình dục phổ biến nhất tại các nước đang phát triển (1) . Bởi vì hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh đều không có triệu chứng do vậy mà các trường hợp phát hiện được bệnh chỉ là một phần nổi của một tảng băng chìm (1) . Người ta phỏng đoán ở Hoa Kỳ mỗi năm có 3-4 triệu trường hợp nhiễm bệnh và trên toàn thế giới có đến 90 triệu trường hợp nhiễm bệnh (3) . Tỷ lệ phụ nữ dưới 25 tuổi nhiễm C. trachomatis có thể rất cao (đến 30%), trong đó nguy cơ cao nhất là ở phụ nữ có hoạt động tình dục nhiều (3-5) . Nếu nhiễm bệnh mà không điều trị thì có thể đưa đến viêm vùng chậu và dẫn đến các di chứng nghiêm trọng như thai ngoài tử cung hay vô sinh (1,2) . Tuy nhiên nhiễm trùng C. trachomatis là một nhiễm trùng rất dễ dàng để điều trị bằng kháng sinh do vậy việc phát hiện và điều trị được các trường hợp riêng lẻ là một trong các chìa khoá trong chương trình kiểm soát nhiễm trùng. Chính vì thế có nhiều nơi, người ta đã khuyến cáo là các thanh niên nam nữ trưởng thành dưới 25 tuổi nên được sàng lọc phát hiện nhiễm C. trachomatis mỗi năm một hay thậm chí hai lần (4-7) . Cũng như vậy, nhiễm N. gonorrhoeae mạn tính hay không triệu chúng là một trong các yếu tố gây lây lan lậu trong cộng đồng (8) . Lậu không triệu chứng hay mạn tính có ở cả đàn ông và phụ nữ (9,10) . Một trong các tiếp cận tốt nhất để kiểm soát và loại trừ được bệnh lậu chính là việc phải phát hiện và điều trị cho được các trường hợp mang mầm bệnh này vì đây chính là các nhân tố nguy cơ cao. Độ nhạy của các phương pháp truyền thống như nuôi cấy hay phát hiện kháng nguyên để phát hiện C. trachomatis hiện nay đã bị các phương pháp khuếch đại nucleic acid qua mặt. Cũng như vậy, phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống đã bị chứng minh là không đủ nhạy cảm để phát hiện được N. gonorrheae trong các đối tượng nhiễm lậu không triệu chứng hay mạn tính, do vậy các phương pháp khuếch đại nucleic acid hiện đang rất được quan tâm để áp dụng. Có nhiều phương pháp khuếch đại nucleic acid đã được đưa ra thương mại như các phương pháp dựa vào kỹ thuật LCR (Abbott), PCR (Roche) (11) , TMA (Bayer), hay SDA (BD). Trong các phương pháp này, dễ tiếp cận nhất là phương pháp PCR vì đây là phương pháp mà các nhà nghiên cứu dễ dàng thiết kế nhất và không cần phải bị phụ thuộc vào một hệ thống kín nào. Mục tiêu chính của công trình này là thiết kế được multiplex PCR mix phát hiện được đồng thời cả hai tác nhân C. trachomatis và N. gonorrhoeae, và cả hai tác nhân này đều có thể hiện diện cùng một lúc trong bệnh phẩm chứ không phải là có tác nhân này thì không có tác nhân kia. Chính vì vậy khi thiế t kế Multiplex PCR này, phải dự đoán được sự cạnh tranh của cả hai loại DNA đích của cả hai tác nhân khi cùng tham gia vào phản ứng khuếch đại. Kết quả nghiên cứu cho thấy, để phát hiện từng tác nhân riêng lẻ, Multiplex PCR mix do chúng tôi chế tạo có khả năng phát hiện rất cao, có thể nói là lý tưởng: đạt mức phát hiện tối thiểu chỉ cần 1 DNA bộ gen của vi khuẩn đích có mặt trong phả n ứng là hoàn toàn có thể phát hiện được. Đây chỉ là sự tính toán lý thuyết vì với phương pháp trích biệt DNA mà chúng tôi sử dụng trong công trình này chỉ là phương pháp đun cách thuỷ do vậy lượng DNA bộ gen trích ra ngoài dung dịch chắc sẽ thấp hơn lượng DNA bộ gen thật sự có trong huyền dịch vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy đối với huyền dịch C. trachomatis, phương pháp BOOM để trích biệt DNA bộ gen t ỏ ra không hiệu quả. Điều này hoàn toàn có thể giải thích được nếu chúng ta hiểu được nguyên tắc trích biệt DNA của phương pháp BOOM, đó là dùng triton X100 để phá huỷ tế bào giải phóng DNA, dùng Guanidine thiocyanate để bất hoạt các men nuclease. Các DNA tự do sẽ bám vào các hạt silica nhờ vậy mà trích biệt được DNA. Tuy nhiên vì trong dịch cấy C. trachomatis là dịch cấy tế bào, do vậy bên cạnh DNA của C. trachomatis, vẫn có nhiều DNA của tế bào và chính các DNA này đã cạnh tranh vớ i DNA của C. trachomatis khi bám vào các hạt silica do vậy khả năng DNA của C. trachomatis được trích biệt sẽ thấp đi nhiều. Do vậy, dù chúng tôi là những người đầu tiên mang về Việt Nam kỹ thuật BOOM để trích biệt DNA nhưng không áp dụng BOOM một cách máy móc vào tất cả các bệnh phẩm mà phải xác định các bệnh phẩm nào không lẫn nhiều DNA tạp nhiễm mới dùng BOOM. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy là trong phát hi ện đồng thời cả hai tác nhân N. gonorrhoeae và C. trachomatis; nếu C. trachomatis trong mẫu thử có lượng DNA bộ gen là 10 3 thì ngưỡng phát hiện N. gonorrhoeae là 10 DNA bộ gen trong mẫu thử, nếu C. trachomatis có lượng DNA bộ gen là 10 2 thì ngưỡng phát hiện N. gonorrhoeae là 1, nếu C. trachomatis có lượng DNA bộ gen là 10 và 1 thì ngưỡng phát hiện N. gonorrhoeae là 0.1 bộ gen trong mẫu thử. Ngược lại lượng DNA bộ gen của N. gonorrhoeae không có ảnh huởng nhiều đến ngưỡng phát hiện C. trachomatis. Như vậy có nghĩa là lượng vi khuẩn C. trachomatis trong mẫu cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiện N. gonorrhoeae. Trên thực tế thì thông thường với một người nhiễ m C. trachomatis 5 thì ít khi lượng vi khuẩn trong mẫu cao đến mức 10 3 vi khuẩn trong 10µl mẫu thử tức là đến 10 5 /ml mẫu thử vì nếu với những người đã từng quan sát phát hiện C. trachomatis trong các quệt cổ tử cung bằng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp thì không bao giờ có thể thấy được vi khuẩn này nhiều trên quang trường quan sát. Do vậy hiệu ứng này chắc chắn sẽ không ảnh hưởng đến việc phát hiện cả hai tác nhân này cùng một lúc trên thực tế mẫu bệnh phẩm lấ y từ bệnh nhân. Kết luận Nghiên cứu đã thành công trong việc chế tạo được multiplex phát hiện đồng thời cả hai tác nhân C. trachomatis và N. gonorrhoeae trong mẫu thử, ngoài ra còn xác định được độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này một cách riêng lẻ hay đồng thời. Thành công này là chìa khóa để có thể tiến tới chế được bộ thử nghiệm PCR phát hiện C. trachomatis và N. gonorrhoeae trong các bệnh phẩm lấy từ đường ti ết niệu và sinh dục bệnh nhân. Tài liệu tham khảo 1. Centers for Disease Control and Prevention. 2001. Sexually transmitted disease surveillance 2000 supplement: Chlamydia Prevalence Monitoring Project. U.S. Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta, Ga. 2. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51:1–78. 3. Burstein, G., C. A. Gaydos, M. Diener-West, M. R. Howell, J. Zenilman, and T. C. Quinn. 1998. Incident Chlamydia trachomatis infections among inner city adolescent females: implications for frequency of chlamydial screening. JAMA 280:521–526. 4. Burstein, G., G. Waterfield, A. Joffe, J. M. Zenilman, T. C. Quinn, and C. A. Gaydos. 1998. Screening for gonorrhea and chlamydia by DNA amplification in adolescents attending middle school health centers: opportunity for early intervention. Sex. Transm. Dis. 25:395–402. 5. Burstein, G. R., J. M. Zenilman, C. A. Gaydos, M. Diener-West, M. R. Howell, W. Brathwaite, and T. C. Quinn. 2001. Predictors of repeat Chlamydia trachomatis infections diagnosed by DNA amplification testing among inner city females. Sex. Transmit. Infect. 77:26– 32. 6. Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections, 2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51:1–38. 7. U.S. Preventive Services Task Force. 2001. Screening for chlamydial infection, recommendations and rationale. Am. J. Prev. Med. 20:90–94. 8. Handsfield, H. H. 1990. Neisseria gonorrhoeae, p. 1613– 1631. In G. L. Mandell, R. G. Jr. Douglas, and J. E. Bennett (ed.), Principles and practice of infectious diseases, 3rd ed. Churchill Livingstone, New York, N.Y. 9. Biro, F. M., S. L. Rosenthal, and M. Kiniyalocts. 1995. Gonococcal and chlamydial genitourinary infections in symptomatic and asymptomatic adolescent women. Clin. Pediatr. 34:419–423. 10. Dalabetta, G., and E. W. Hook III. 1987. Gonococcal infections. Infect. Dis. Clin. N. Am. 1:25–24. 11. Roche Diagnostic Systems Inc. 1996. AMPLICOR™ Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG) test package insert. Roche Diagnostic Systems,Inc., Branchburg, N.J. 6 . Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae P. H. Van (1) , N. P. N. Ha (2) ,. Thuy (4) Tóm tắt Với hai chủng vi khuẩn N. gonorrhoeae và C. trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn. là nhạy cảm và thích hợp nhất hiện nay để phát hiện hai tác nhân C. trachomatis và N. gonorrhoeae là kỹ thuật PCR. Hiện nay đã có kit phát hiện đồng thời N. gonorrhoeae và C. trachomatis