BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT UY BAN NHAN DÂN TPHCM ˆ Š VIỆN CƠ ĐIỆN NN & CÔNG NGHỆ STH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHAN VIEN CO DIEN NN & CONG NGHE STH TPHCM were ~'*c mm BÁO CÁO TỔNG KẾT “« ;
Dé tài: Nghiên cứu chế tạo bộ ki ELISA phát hiện
nhóm thuốc trừ sâu gốc cyclodiene trong rau qua
(Bee Bay wade be gep 4 Axo S 3 am 1K)
fe
Cơ quan quần lý: Sở Khoa Học và Công Nghệ TPHCM
Cơ quan chủ trì để tài: Phân Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công Nghệ Sau Thu Hoạch-TPHCM
Chú nhiệm đề tài: KS Nguyễn Thu Trang
Trang 2
BÁO CÁO TỔNG KẾT
Đà tài: Nghiên cứu chế tạo b6 kit ELISA phát hiện nhóm
thuốc trừ sâu gốc cyclodiene trong rau quả
Chủ nhiệm đề tài: KS Nguyễn Thu Trang
Cơ quan chủ trì đề tài: Phân Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công Nghệ Sau Thu Hoạch-TPHCM Địa chỉ: 54 Trần Khánh Dư- Q1- TPHCM Tel: 8-8483947 Fax: 8-8484632
Mail: siaep@hcm.vnn.vn
Cơ quan quần lý: Sở Khoa Học và Công Nghệ TPHCM
Cơ quan phối hợp chính: TT Ứng dụng và Dịch Vụ Khoa Học Kỹ Thuật Đại Học Nông Lam -TPHCM
Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật TPHCM
Cán bộ phối hợp chính:
1.TS Nguyễn Thị Anh TT Ứng dụng và Dịch Vụ Khoa Học Kỹ Thuật 2 TS Bùi Minh Trí Đại Học Nông Lâm -TPHCM
3 KS Nguyễn Văn Dũng Chí Cục Bảo Vệ Thực Vật TPHCM
4.CN Trần Thanh Bình Phân Viện Cơ Điện NN và Công Nghệ STH
Trang 3MỤC LỤC 1 DAT VAN BE 2 Một số bước chính trong việc phát triển ELISA cho thuốc bảo vệ thực vật 2.1 Sản xuất kháng thể 2.2 Tạo cộng hợp hapten-prOt€ÙUHIVHH, cceeneerherhhttrirhnretrrrrrtrririrtdtrtrrrrrnrdidrentidirrree 8 3.3 Khỏo sát các yếu tố ảnh hưởng — Thiết k
3 Các nghiên cứu phái triển ELISA cho nhóm thuốc trừ sâu cyclodlene
1HI VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1, Vật liệu và thiết bị
2 Tóm tắt các phương pháp đã sử dụng 2.1 Phương pháp tổng hợp hapren
2.2 Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể đu dòng
3.3 Phương pháp ELISA gidn tiếp kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch 3.4 Phương pháp tình chế kháng thể bằng tủa trong ammonium sulfate
3.5 Phương pháp ELISA cạnh tranh trực tiếp cho endosulfan 2.6 Phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp cho endosuifa
2,7 Phương pháp đo nông dé protein
2.8, Phương pháp sắc ký khí xác định nhóm clo hiu CƠ trong mẫu rau quả 1V KẾT QUẢ 1 Tổng hợp hapten
2 Tạo cộng hợp hapten và protein
3 Gây miễn dịch sân xuất kháng thể
4 Lựa chọn phương thức ELISA
5$ Phần ứng chéo với các thuốc trừ sâu gốc cyclodiene khác
6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưông để thiết kế bộ ki
7 Khảo sái giảm ảnh hưông chất nên của các mẫu rau quả
8 Kiểm tra độ thu hỗi — xây dung quy trình phân tích
9 So-sdnh mic độ tương đồng giữa phương pháp ELISA và sắc ký khí
10 Bảo quân các thành phân của bộ kù
Trang 4DANH MỤC HÌNH ANH VA DO THI Hình 1 ELISA dang canh tranh (1a) CO dinh khang thé ;1b) C6 dinh céng hop kháng nguyên
Hình 2 Mộ: số hapten cho nhóm thuốc trừ sâu cyclodiene (đại diện là endosulfan)
(Manclus J,et al 2004)
Hình 3 Sơ đồ phản ứng gắn hapten có nhóm -COOH lên protein nhờ DDC va NHS
Hinh 4 So dé phản ứng điều chế hapten H (Lee, 1995)
Hình 5 Sơ đồ phân ứng điều chế hapten IV (Lee, 1997;, Brummet, 1997) Hình 6 ODmax của phân ứng ELISA với các nông đệ phả kháng thể khác nhau Hình 7 Đường chuẩn ELISA đối với endosulfan, tính trung bình trong 3 ngày
Hình 8 Đồ thi ELISA cạnh tranh gián tiếp đối với endosulfan
Hình 9 Ảnh hưởng của nông độ các dung môi lên OD max
Hình 10 $o sánh đường chuẩn endosulfan pha trong 10% methanol và dung dich
chiết mẫu đã pha lodng 20 ldn trong 10% methanol
Hình 11 Độ thu hồi của một số mẫu
Hinh 12 So sénh mic độ tương động giữa phương pháp GC và ELISA Hình 13 Tóm tắt kết quả thử nghiệm tăng độ ổn định của cộng hợp
BẰNG
Bảng 1 Tóm tắt các cơ chất phổ biến của mội số enayme thường dùng trong ELISA
Bảng 2 Phân ứng chéo với các cyclodiene khác
Bảng 3 Kết quả so sánh mẫu rau kiểm tra bằng 2 phương pháp
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 H-NMR: Hapten II Phu luc 2 ‘H-NMR: Hapten IV
Phụ lục 3 Quy trình sử dụng bộ kù ELISA phái hiện thuốc trừ sâu gốc cyclodiene Phụ lục 4 Quy zrình chế tạo bộ kit ELISA phát hiện thuốc trừ sâu gốc cyclodiene
Trang 5L ĐẶT VẤN DE
Thuốc bảo vệ thực vật là loại vật tư không thể thiếu trong việc phòng trừ sâu bệnh cho cây trêng Tuy nhiên, nếu sử dụng không đúng kỹ thuật chúng sẽ đưa đến việc 6 nhiễm thực phẩm và môi trường Ở nước ta, trong vòng 5 năm qua với sự cố gắng của các
cơ quan hữu quan như Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, Cục và các Chỉ Cục Bảo
Vệ Thực Vật, Các Trung Tâm Y Tế Dự Phòng v.v việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên các sản phẩm nông nghiệp đã được quản lý ngày càng hiệu quả hơn Đơn cử theo thống kê của Chỉ cục BVTV TPHCM trong năm 2005 số mẫu rau có dư lượng thuốc trừ
sâu đã giảm xuống còn khoảng 1% Tuy nhiên cho đến nay trong số các vụ ngộ độc thực phẩm thì số vụ có nguyên nhân từ hóa chất mà trong đồ có thuốc trừ sâu vẫn còn chiếm
một tỉ lệ tương đối Theo Cục An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm, từ năm 2001-2005 cả nước có
988 vụ ngộ độc thực phẩm với 23200 người mắc và 263 người chết Trong đó, SỐ vụ có nguyên nhân từ hóa chất thường chiếm tỉ lệ hơn 10% (ví dụ trong năm 2005 tỉ lệ này là 14%) Điểu đó cho thấy việc kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu trong rau, quả và thực phẩm vẫn cần tăng cường hơn nữa để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng một cách tốt nhất
Trong các nhóm thuốc trừ sâu có nhiều nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm có thể kể đến nhóm thuốc gốc clo hữu cơ mà trong đó nhóm thuốc có gốc cyclodiene chiếm một tỉ lệ lớn Đại diện của nhóm thuốc này là endosulfan vừa bị cấm sử dụng từ cuối năm 2005,
ngoài ra còn có các thuốc endrin, aldrin, dieldrin, chlodan, heptachlor đã bị cấm từ trước
Do đặc điểm của nhóm thuốc này là có độ bên cao nên chúng vẫn có thể tổn tại lâu trong
môi trường, có khả năng ảnh hướng lâu đài cho người và vật nuôi Endosulfan và một dẫn xuất phổ biến của nó là endosulfan suifate có độc tính rất cao đối với cá (LDzu cho cá của endosulfan va endosulfan sulfate: 0.3 mg/l)
Để kiểm soát dư lượng thuốc trừ sâu nói chung và nhóm thuốc gốc cyclodiene nói riêng cần tiến hành kiểm tra lấy mẫu thường xuyên trên diện rộng Do số lượng mẫu lớn nên rất cẩn có một phương pháp nhanh và cho kết quả đủ ún cậy Hiện nay các phương pháp thông dụng để phân tích dư lượng thuốc trừ sâu là các phương phấp sắc ký Đây là các phương pháp có độ chính xác cao nhưng có một số điểm hạn chế như: đòi hỏi các thiết bị đắt tiến, quy trình chuẩn bị và làm sạch mẫu tương đối phức tạp nên khó có thể kiểm tra nhanh một lượng mẫu lớn Ngoài ra phương pháp sắc ký vẫn còn khá tốn kém với điều
kiện kinh tế của nước ta nên không thích hợp cho việc phân tích điểu tra trên diện rộng
Trong các phương pháp nhanh phát hiện thuốc trừ sâu đã được áp dụng có bộ ki GT của
Thái Lan và bộ kit RBPR của Đài Loan Nhưng hai bộ thuốc thứ trên chỉ kiểm tra phát
hiện nhóm lân và carbamate hữu cơ chứ không có khả năng phân tích nhóm thuốc clo
Trước yêu cầu thực tế đó Phân viện CNSTH-TPHCM đã để xuất và với sự chấp thuận của
Sở Khoa Học và Công Nghệ TPHCM phát triển một bộ kit thử nhanh theo phương pháp
ELISA có thể phát hiện nhóm thuốc trừ sâu trên Phân viện đã dựa theo các tài liệu khoa
học đã công bố cùng phối hợp với các đơn vị như TT Ưng dụng và Dịch vụ Khoa học kỹ thuật, Chỉ cục BVTV TPHCM và đại học Nông Lâm để phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhóm cyclodiene với độ nhạy cao và quy trình sử dụng đơn giản thích hợp cho công tác
Trang 6vụ cho công tác bảo đầm vệ sinh an toàn thực phẩm - một công cuộc đang được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội trong những năm gần đây
Nội dưng nghiên cứu
Từ mục tiêu trên của để tài, các nội dung nghiên cứu sẽ bao gồm các bước phát
triển phương pháp ELISA cạnh tranh cho nhóm thuốc trừ sâu gốc cyclodiene như sau:
1 Tổng hợp hapten đại diện cho nhóm thuốc trừ sâu cyclodiene
2 Tạo kháng nguyên từ các hapten trên bằng cách gấn lên phân tử protein 3 Tạo cộng hợp enzyme gifa hapten va enzyme
4 Tạo kháng thể kháng thuốc trừ sâu gốc cyclodiene từ kháng nguyên đã tạo ra bằng cách gây miễn dịch trên thỏ Quá trình đáp ứng miễn dịch được kiểm tra sau khi bảo đâm thu được kháng huyết thanh có khả năng nhận biết endosuifan sẽ tiến hành tỉnh chế
để thu kháng thể dùng cho bộ kit
3 Kiểm tra độ nhạy của kháng thể thu được với các thuốc trữ sâu có gốc cyclodiene 6 Kiểm tra các yếu tố ảnh hưởng để từ đó đưa ra các quy trình xử lý mẫu thích hợp để có thể ứng dụng bộ kỉt trên các mẫu rau quả
7 Xác định cách bảo quản và thời gian bảo quản cho các thành phần bé kit
8 Gay nhiém nhân tạo để kiểm tra nổng độ phát hiện tối thiểu, độ tin cậy So sánh
với phương pháp hóa lý là sắc ký khí để xác định mức độ tương đồng giữa hai phương
pháp (ELISA và sắc ký khí) đối với mẫu nhiễm nhân tạo và mẫu thực tế 9, Tổng kết và đưa ra kết luận cuối cùng
Trang 7IL TONG QUAN TAI LIEU
1 Giới thiệu về phương pháp ELISA phát hiện thuốc bảo vệ thực vật
Phương pháp ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) difa trên cơ sở phần ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Phản ứng trên sẽ được nhận biết thông qua phản ứng chỉ thị của một enzyme
Các nghiên cứu đầu tiên đặt cơ sở cho việc phát triển nên phương pháp ELISA
được Nakane và Pierce thực hiện vào giữa thập niên 60 Tiếp theo đó các thành công của
các nhà khoa học khác trong việc cố định kháng thể hoặc kháng nguyên trên bể mặt rắn
cùng việc gắn kết được enzyme vào kháng nguyên hoặc kháng thể trong những năm 70 đã
giúp phương pháp ELISA có được những ứng dụng to lớn ELISA được ứng dụng đầu tiên
trong các xét nghiệm y tế như xét nghiệm protein, vi khuẩn, virus, kháng thể v.v Riêng
trong lĩnh vực môi trường như phát hiện dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thì phương pháp ELISA mới được nghiên cứu phát triển nhiều từ thập niên 80 (Tijssen, P.,1985; Hock,
B.,1995; Nunes, 1998)
ELISA có rất nhiều phương thức tiến hành, nhưng dùng để phát hiện những hợp
chất có phân tử nhỏ như thuốc bảo vệ thực vật thì hiện nay người ta dùng phương pháp -
ELISA cạnh tranh trong đó được chia làm hai kiểu chính như sau:
(1) Cạnh tranh trực tiếp : cố định kháng thể (Hình 1a)
(2) Cạnh tranh gián tiếp: cố định cộng hợp kháng nguyên (Hình Ib)
Trong kiểu (1) cẩn phải có một cộng hợp kháng nguyên với enzyme (kháng
nguyên đánh dấu) đã biết trước Chất cần phân tích có thể coi nhu là 1 kháng nguyên chưa
biết Cả 2 kháng nguyên đều có thể bị kháng thể tóm bắt Khi cho cả 2 tiếp xúc với kháng thể đã được phủ cố định trên bể mặt rắn, chúng sẽ cạnh tranh với nhau để cùng bám vào kháng thể Sau 1 thời gian cân bằng, rửa trôi các chất còn dư, cơ chất tương ứng để phát hiện enzyme đánh dấu sẽ được cho vào Lượng chất cần phân tích càng nhiều thì lượng
cộng hợp kháng nguyên và enzyme bị kháng thể giữ lại càng ít, từ đó mà ta có thể định
lượng chất cần phân tích :
Trang 8a2 £ -_ a & 3? te 12 32 W Palystyren cose OQ ne S9 Sees, ean tad 2820 Substrate Oye Kháng nguyên có đánh dấu Chất cần phân tích ` Kháng thể bị cổ định Kháng thể 2 có đánh dấu Substrate Dye Chất cần phân tích Kháng thể L Boo Bow 4 Kháng nguyên bị cố định la) 1b) Hình 1 ELISA dạng cạnh tranh (1a) Cố định kháng thể, 1b) Cổ định cộng hợp kháng nguyên
Trên thế giới hiện đã có rất nhiều công trình nghiên cứu được công bế về việc
phát triển ELISA cho các thuốc trừ sâu khác nhau thuộc các nhóm clo hữu cơ, lân hữu cơ,
carbamate và pyrethroid Tùy thuộc vào yêu cầu ứng dụng mà các phép thử được phát triển đặc hiệu cho một thuốc trừ sâu chuyên biệt hay có thể phát hiện một nhóm chất
Trong các tài liệu khoa học đã công bố, đại đa số áp dụng phương pháp cạnh tranh trực tiếp Tuy nhiên cũng có một số áp dụng phương pháp cạnh tranh gián tiếp ví dụ nhóm tác giá Hammock đã công bố rất nhiều công trình phát triển ELISA cạnh tranh gián tiếp
cho nhóm thuốc trừ sâu pyrethroid Hiện chưa có một lý thuyết nào giải thích đây đủ vì sao và trong trường hợp nào nên áp dụng phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp hay
trực tiếp vì thực tế độ nhạy và tính đặc hiệu của một phép thử ELISA phụ thuộc rất nhiều yếu tố Nếu xét về tính tiện lợi cho người sử dụng thì ELISA cạnh tranh trực tiếp sẽ được tiến hành nhanh hơn vì ngắn hơn cạnh tranh gián tiếp một công đoạn Thực tế trên thị trường, đại đa số các bộ kit ELISA phân tích các hóa chất đều là ELISA cạnh tranh trực tiếp Tuy nhiên nếu tính về các công đoạn trong việc phát triển một bộ kit thì ELISA canh
tranh gián tiếp sẽ giảm bớt công đoạn sản xuất cộng hợp enzyme-kháng nguyên vì cộng
hợp enzyme và kháng thể thứ hai đặc hiệu cho kháng thể một loài (ví dụ dê, cừu, thỏ, chuột, v.v ) đã được thương mại hóa từ lâu và rất đễ đàng mua được
Trang 9Enzyme đánh dấu
Enzyme dùng đánh dấu cần phải bến, có tính đặc hiệu và hoạt tính cao đồng thời
phải rẻ tiễn và có khả năng xúc tác các phản ứng tạo ra các phức chất có thể định lượng
dễ dàng Việc tạo các cộng hợp vơi các enzyme này cẩn phải dễ đằng và tương đối bến
vững Hiện nay các enzyme được dùng phổ biến cho mục đích này là: horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, B-galactosidase, glucose oxidase va urease Để nhận biết và định lượng các enzyme này trong các phần ứng ELISA, người ta dùng các cơ chất
tương ứng để tạo các sản phẩm dễ nhận biết Sản phẩm cuối cùng của phần ứng thường là: hợp chất có mầu (đo rất để dàng bằng quang kế), hợp chất phát huỳnh quang và quang hóa (cho độ nhạy cao hơn nhưng phải sự dụng thiết bị đo đắt tiền)
Bang 1 Tóm tắt các cơ chất phổ biến của một số encyme thường dùng trong ELISA Enzyme Cơ chất Phép đo
Horseradish * 3,3’,5,5’-Tetramethyl Benzidine (TMB) Mật độ quang, 450nm peroxidase 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6- Mật độ quang, 410-650nm
sulfonic acid (ABTS)
O-Phenylen diamine (OPD) Mật độ quang, 492nm
Luminot Huỳnh quang kế
Homovaniliic acid (HVA) Huỳnh quang kế
Alkaline phosphatase p-Nitrophcayl Phosphate (PNPP) Mật độ quang, 405nm 4-Methylumbelliferyi Phosphate Huỳnh quang kế Fluorescein methy! phosphate Huỳnh quang kế 8-Galactosidase O-Nitrophenyl-B-Galactoside (o-NPG) Mật độ quang 405nm
4-Methylumbelliferyi-D-Galactopyranoside - Huỳnh quang kế
Glucose oxidase Homovanillic acid (HVA) Huỳnh quang kế
Urease Chất chỉ thị Bromocresoi
purple, chuyển màu từ
vang sang tim
Phổ biến nhất trong các kit ELISA 1a dang cdc enzyme horseradish peroxidase va
alkaline phosphatase véi các cơ chất tạo màu để có thé do dễ dàng và tương đối rẻ tiễn
bằng các máy đọc ELISA
Enzyme horseradish peroxidase (HRP):
Enzyme horseradish peroxidase (MW: 40.000) là một enzyme được chiết xuất từ
loại củ cải Amoracia rusticana được dùng rất nhiều trong các test ELISA HRP và cơ chất
của nó có giá thành tương đối rẻ so với các enzyme khác, đồng thời có độ nhạy cao và có
thể sử dụng được với rất nhiều cơ chất khác nhau (Bảng 1) Cộng hợp với kháng thể của
Trang 10Cơ chất của HRP là H;O; và phản ứng xúc tác của HRP được miêu tả tóm tắt như
Sau:
HRP + HạO; -> [HRP-H.O,] complex - >2HạO + HRP
2DH 2D
DH: các cơ chất cho hydro và tạo màu hoặc phát huỳnh quang như: TMB, ABTS, OPĐ, Luminol.HVA
HO có đặc tính vừa là cơ chất của HRP vừa là chất ức chế HRP Ví dụ khi cơ chất
tạo màu là TMEB, hoạt tính HRP tăng đẩn với nỗng độ HạO; tăng từ 0 đến 0.003% nhưng sau đó nếu HạOs tiếp tục tăng thì hoạt tính HRP lai giảm Do đó nồng độ HạO; tối ưn cần phải xác định đối với từng cơ chất tạo màu riêng biệt
Do H;O; không bển nên trong các kit ELISA HO; thường được thay thế bởi một
peroxide khác
Hoạt tính của HRP bị ức chế bởi các chất sau: sodium azide, cyanide, L—cystine,
dichromate, ethylenethiourea, hydroxylamine, sulfide, vanadate, p-aminobenzoic acid, Cd", Co®, Cu, Fe", Mn*, Ni, Pb Enzyme nay cé thé hoạt động trong khoảng pH từ
5.0-9.0 với điểm pH tối ưu là 6.0-6.5
2 Một số bước chính trong việc phát triển ELISA cho thuốc bảo vệ thực vật
Như đã nói ở trên, thành phần chính cho một bộ kit ELISA cạnh tranh sẽ bao gầm:
- Khang thể kháng chất cần phân tích
- _ Cộng hợp enzyme hoặc protein
-_ Cơchất tạo màu
Sản xuất ra kháng thể đặc hiệu và cộng hợp enzyme/protein là những bước quan trọng nhất trong việc phát triển bộ kit, Để đưa vào ứng dụng thực tế các yếu tố ảnh hưởng
đều phải được khảo sát Các đánh giá về tính đặc hiệu, độ nhạy, độ chính xác, tính bên
của các thuốc thử, khoảng xác định đối với từng loại mẫu đều phải tiến hành đầy đủ trước khi đưa phương pháp áp dụng vào thực tế
2.1.3» uất kháng thể
1 g thể đa dòng và đơn dong
Kháng thể dùng trong các kỹ thuật phân tích thường là một trong hai loại chính: đa dòng và đơn dòng Kháng thể đa đòng là kháng thể thu được từ huyết thanh của các động
vật thí nghiệm (chuột, thỏ, cừu, dê ) sau khi gây miễn dịch Chất gây miễn dịch có thể là
một đại phân tử như protein, nucleic acid hoặc polysaccharide hay là một cộng hợp của
một phân tử nhỏ với một đại phân tử Có thể thu được kháng thể đa dòng với nồng độ cao
Trang 11(khoảng 10mg/ml) một cách đơn giản là tỉnh chế từ huyết thanh Thông thường 2-3 tháng sau khi gây miễn địch có thể bắt đầu thu được kháng thể đa dòng này
Đối với kháng thể đơn dòng người ta thu được chúng từ tế bào sản xuất kháng thể
(tế bào lá lách) lấy được từ động vật đã gây miễn địch Các tế bào lá lách này được kết
hợp với tế bào myeloma để tạo thành dòng tế bào lai có khả năng sinh ra kháng thể Những tế bào này được nuôi cấy, lớn lên, phân chia và sản sinh ra nguồn kháng thể ổn định và liên tục trong môi trường nuôi cấy tế bào
'Trên nguyên tắc kháng thể đơn dòng được sinh ra bởi một dòng tế bào cho nên tính chất của chúng ổn định và đồng nhất Trong khi đó kháng thể đa dòng được tạo bởi rất nhiều dòng tế bào khác nhau của vật thí nghiệm, do đó chúng là một hỗn hợp nhiều kháng
thể khác nhau về ái lực và tính đặc hiệu Tùy từng trường hợp mà kháng thể đa dòng hay
đơn dòng có ưu thế hơn Trong nhiều trường hợp kháng thể đa dòng có ái lực cao hơn
kháng thể đơn dòng và có khả năng tạo những xét nghiệm có độ nhạy cao và nhanh hơn
Hơn nữa do là hỗn hợp nhiều kháng thể nên kháng thể đa dòng sẽ tỏ ra hiệu quả hơn khi chất cần phân tích là một hỗn hợp kháng nguyên hoặc có chứa nhiều điểm quyết định
kháng nguyên khác nhau
Kháng thể tái tổ hợp
Trong vòng mười năm trổ lại đây trong những bước tiến bộ vượt bậc của công nghệ
gen, người ta đã tạo ra kháng thé ở thế hệ thứ 3 đó là kháng thể tái tổ hợp Về cơ bản, kháng thể tái tổ hợp chỉ là đoạn protein chứa vùng liên kết với kháng nguyên Đó là phần
Fab hay Fv và không có phần Fc của một kháng thể nguyên vẹn Công nghệ kháng thể tái
tổ hợp cho phép người ta chọn lựa thay đổi tính chất kháng thể và dùng vỉ sinh vật như vỉ trùng, nấm men, tế bào côn trùng v.v để sản xuất ra chúng
Sản xuất kháng thể kháng thuốc bảo vệ thực vật
"Thuốc bảo vệ thực vật là những phân tử nhỏ không có khả năng kích thích động
vật sinh ra kháng thể Do đó cần phải có một hapten mô phỏng cấu trúc của chúng và gắn
đồng hoá trị lên một protein mang tạo thành một cộng, hợp kháng nguyên Cộng hợp này
khi tiêm vào động vật mới có khả năng gây miễn dịch và tạo ra kháng thể
Các protein thường được đùng làm protein mang là keyhole limpet hemocyanin
(KLH); bovine serum albumin (BSA), thyroglobulin, ovalbumin (OA) va conalbumin
(ConA)
Chọn lựa để tổng hợp được một hapten phù hợp là bước quyết định để tạo ra kháng thể mong muốn Người ta luôn phải cố gắng tạo các hapten thật giống các chất cần
phân tích ở cấu trúc không gian, khi đó kháng thể tạo ra mới có thể nhận biết được chất
đó, Các tài liệu khoa học hiện nay đã công bố rất nhiều công trình phát triển ELISA cho
thuốc bảo vệ thực vật Thực sự cho đến nay, các kết quá đều dựa trên thực nghiệm, các
tác giả cũng đã cố gắng lý giải những kết quả đạt được để xây dựng nên lý thuyết về mối liên hệ giữa cấu trúc của hapten và tính đặc hiệu của kháng thể Tuy nhiên đến nay vẫn chưa có một lý thuyết hoàn chỉnh giải thích và dự đốn đúng hồn toàn về mối liên hệ
Trang 12trên Thông thường các tác giả đểu cố gắng tổng hợp rất nhiều hapten khác nhau để gây miễn dịch và từ đó chọn ra kháng thể tốt nhất
Ví dụ: Manelus J và các cộng sự đã sử dụng một loạt các hapten sau để sản xuất
kháng thể cho nhóm thuốc trừ sâu cyclodiene : che et SH a oo s ° cl v ° cl EE oA 7 Seen 5 eœ- a TY ci 0 cel ot ccos ọ a on 0t „GI ° 1 cr j a € J7 4 Wl Tp EE €i h ct h ° ccp2 ccp4 cẻ cc “r2 œ ol so ENDOSULFAN
Hình 2 Một số hapten cho nhóm thuốc trừ sâu cyclodiene (dại điện là endosulfan)
Manclus J,et al (2004)
Nhóm tác giả trên đã dự đoán hapten CCD4 véi một cầu nối dài nhất sẽ tạo ra kháng thể rất tốt do cấu trúc của nó sẽ được đễ đàng nhận diện khi gắn lên protein Tuy nhiên kết quả thực nghiệm cho thấy CCD4 hoàn tồn khơng tạo ra kháng thể kháng endosulfan Và trong số các hapten còn lại, CCD2 tạo ra kháng thể có độ nhạy cao nhất đối với endosulfan
2.2 Tạo cộng hợp hapten-protein/enzyme
Các phương pháp gắn hapten lên một protein đã được rất nhiều tài liệu tổng hợp
lại Đa số các hapten thường được gắn với protein qua nhóm amine của protein Các tài liệu đã phân chia các hapten thành nhóm với các nhóm chức khác nhau tương ứng với các phương pháp gắn khác nhau Các nhóm chức cia hapten thường được sử dụng trong phan ứng gắn với protein/enzyme bao gém: carboxyl, amin, hydroxyl Trong đó nhóm carboxyl
chiếm đa số Dưới đây là một số phương pháp chính dùng để gắn hapten có nhóm
carboxyl lên protein mà không tạo thêm cầu nối (dây carbon):
- Phương pháp anhydride: là một phương pháp đơn giản, chỉ có một bước phản ứng Trong đó nhóm carboxyl của hapten được chuyển thành anhydride với sự có mật của isobutyichloroformate va triethylamine tại nhiệt độ thấp và phản ứng ngay với protein có
mặt trong hỗn hợp phản ứng Tuy nhiên phương pháp này hiệu suất gắn thấp, không ổn
Trang 13- Phương pháp carbodiimide: Đây là phương pháp được ding rất phổ biến Nhóm carboxyl
của hapten được hoạt hóa bởi 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyÐ) carbodiimide (EDC) và
phan ứng trực tiếp với protein trong hỗn hợp phản ứng EDC có ưu điểm là hòa tan tốt trong nước và cho hiệu suất gấn cao Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là gây các phản ứng phụ làm gắn kết các phân tử proiein nên có thể làm thay đổi tính chất của
chúng
Ngoài EDC có thể sử dụng 1-cyclohexyl-3(2-morpholinylethyl) Carbodiimide (CMC) với phản ứng tương tự
- Phương pháp N:Hydroxysuccinimide: Day cũng là một phương pháp được dùng rất phổ
biến Trong đó nhóm carboxyÌ của hapten đã được ester hóa bởi N-Hydroxysuccinimide
(NH$) với sự có mặt của N,N'dieyclohexyl carbodiimide (DCC) và xúc tác
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Ưu điểm của phương pháp là HNS-ester tương đối bến trong môi trường khan nên có thể tỉnh chế khỏi hỗn hợp phản ứng Sau đó NHŠ-ester
nay sé phần ứng dễ dàng với protein tạo nên cộng hợp hapten-protein (Hình 3) ° CC} + HaplenOOjH ——= OGD pec 4 ọ ` en) 9 o 4 On? + rr oni Dicyclohexylurea (DCU) NHS active ester | Protein-NH; a) + Hapten-CONH-Protein 6
Hình 3 Sơ đỗ phần ứng gắn hapten cổ nhóm -COOH lên protein nhờ DDC va NHS
2.3 Khảo sát các yếu tố Ảnh hưởng ~ Thiết kế bộ kit
Tính đặc hiệu và ái lực của kháng thể là yếu tố rất quan trọng để phát triển bộ kít ELISA Tuỳ theo chất cần phân tích là gì mà các hapten dùng cho gây miễn dịch và dùng cho tạo cộng hợp enzyme được lựa chọn cho phù hợp Thông thường người ta thiết kế được bộ kít có độ nhạy cao hơn khi hapten để gây miễn dịch và hapten để tạo công hợp
enzyme là hai hapten khác nhau
Trang 14chất thì phải tạo ra kháng thể nhận biết các chất trong nhóm, nhưng nếu yêu cầu là phát
hiện 1 chất riêng biệt thì cần phải có kháng thể có tứnh đặc hiệu cao
Hàng loạt yếu tố chất nên có thể ảnh hướng đến kết quả ELISA ví dụ như : các loại dung môi, nỗng độ dung môi, độ pH, nhiệt độ, nông độ các loại ion và đặc biệt là chất nền của mẫu, Các chất được chiết trong mẫu có thể là những chất ức chế enzyme, những chất biến đổi cấu trúc kháng thể hoặc cũng có thể ảnh hưởng cả bai Như vậy để áp dụng một bộ kit vào việc phân tích mẫu rất nhiều thí nghiệm phải được tiến hành để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng Thông thường ELISA dùng để phân tích nhanh nên không cần phải làm sạch mẫu trước khi đo bằng Mẫu nước nói chung có thể phân tích trực tiếp không cần làm sạch Các mẫu thực phẩm hoặc mẫu đất có thể trích bằng dung môi tan trong nước, đem pha loãng rồi phân tích bằng ELISA Tuy nhiên có một số mẫu chứa những chất có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả thì cần có những bước làm sạch trước khi phân tích Ví dụ như trong các mẫu trà có chứa nhiều tanin là chất ức chế enzyme rất mạnh do đó dung dịch mẫu cẩn qua cột hấp phụ để loại bớt tanin mới có thé ding phan tich bing ELISA
được
Để xác định khoảng định lượng của bộ kit ELISA, các thí nghiệm đo độ thu hổi cần phải được tiến hành Trên các mẫu, chất cân phân tích sẽ được gây nhiễm nhân tạo ở nồng độ đã biết Đo độ thu hổi của các mẫu này sau khi tiến hành ELISA sẽ cho ra
khoảng định lượng của bộ kit Ngoài ra b6 kit phải được đánh giá bằng cách so sánh với một phương pháp chuẩn đã được công nhận Ví dụ tiến hành song song ELISA và sắc ký trên một mẫu để so sánh mức độ tương quan của các kết quá thu được
Sau khi mọi thí nghiệm cẩn thiết đã được tiến hành, bé kit ELISA sẽ được đánh giá
để thiết kế cho việc phân tích định tính hay định lượng và một quy trình chuẩn sẽ được đưa
ra để có thể ứng dụng bộ kit ELISA trên thực tế
3 Các nghiên cứu phát triển ELISA cho nhóm thuốc trừ sâu cyclodiene e _ Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Riêng về ELISA phát hiện endosulfan và các thuốc trừ sâu thuộc nhóm cyclodiene có tác giả Dreher R.M và cộng sự công bố kết quả năm 1288 và Lee N năm 1995 và
1997 Ngoài ra có Brummel (1997) tạo kháng thể kháng thuốc trừ sâu này dùng cho việc
phát triển đầu đò sinh học đối với các cyclodiene So với Dreher, Lee và Brummel đã
tổng hợp các hapten khác và trong số đó có hapten giúp tạo ra những test có độ nhạy cao hơn Các test ELISA của Lee đạt IC50! đối với endosulfan là 5ppb so với 25ppb của
Dreher Nhóm tác giả Smith (1994) đã phát triển một hapten khác ứng dụng cho ELISA
cạnh tranh gián tiếp xác định aldrin và đieldrin trong sữa Độ nhạy của các test nay tất kém với IC50 là Ippm đối với dieldrin Trong các nghiên cứu của mình, tất cả các tác giả
vữa nêu đều phát triển ELISA cạnh tranh ding kháng thể đa dòng Năm 2004, nhóm của
Manclus J có công bố nghiên cứu các test cho cyclodiene với kháng thể đơn dòng Nhóm
Ì [C50: nỗng độ gây 50% ức chế trong đường chuẩn (xem phẩn Phương pháp)
Trang 15của Manclus cũng có sử dụng một số hapten giống Lee (Lee, 1995, 1997) và đồng thời tổng hợp các hapten khác Trong số các kháng thể đơn dòng Manclus thử nghiệm thì kháng thể cho độ nhạy tốt nhất được gây bởi cộng hợp hapten giống tài liệu của Lee Manclus cũng thử nghiệm đồng thời ELISA cạnh tranh trực tiếp và gián tiếp với những
kháng thể và cộng hợp thu được, kết quả là các test cạnh tranh gián tiếp phát hiện
endosulfan tốt hơn tuy vẫn kém hơn nhiều so với kết quả của Lee (C50 là khoảng 4ppm) Ngoài ra còn có một số công trình của các tác giá khác đi về vấn để ứng dụng ELISA cho
việc kiểm tra cyclodiene trên các mẫu nông sản thực phẩm (Ibrahim, 1995; Wang, 2004;
Singh, 2004)
Dựa trên các tài liệu đã công bố, có thể dựa trên kết quả của Lee và Brummel để
phát triển bộ kit ELISA cho cyclodiene với kháng thể đa dòng Trong các nghiên cứu của mình, các tác giả trên chỉ chú trọng đến độ nhạy tối đa của phương pháp khi khảo sắt với
chuẩn hoặc các mẫu đơn giản là nước và đất Do đó để có thể ứng dụng các kết quả trên chúng ta cần phải khảo sát thêm nhiều về ảnh hưởng chết nên của các loại mẫu rau quả
và xây dựng một quy trình kiểm mẫu phũ hợp thực tế Việt Nam
ø _ Tình hình nghiên cứu trong nước
Cũng như thế giới, ELISA được ứng dụng rất phổ biến tại Việt Nam trong các xét
nghiệm ÿ tế Viện Pasteur TPHCM cũng đã phát triển được bộ kit ELISA gitip chuẩn đoán sớm đị tật thai Hiện nay ngoài các Xét nghiệm y tế, ELISA được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp qua những phép thử xét nghiệm bệnh trên cây trồng, vật nuôi, phát hiện dư
lượng các chất độc hại v.v Trong nước đã có rất nhiều để tài nghiên cứu liên quan đến
phương pháp ELISA Tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc kháo sát các
tác nhân gây bệnh bằng cách dùng các xét nghiệm ELISA có sẵn Các để tài về phát triển
các bộ kit ELISA chưa được nhiều và đêu chú trọng vào việc phát triển ELISA cho cdc vi
khuẩn, virus gây bệnh Còn trong việc phát triển ELISA cho thuốc trừ sâu thì mới có bộ
kit ELISA phát hiện thuốc trừ cỏ 24D do Phòng Công nghệ gen động vật (Viện Công
nghệ Sinh học) được nghiên cứu thành công Do đó việc Phân viện Cơ điện NN & Công
nghệ Sau thu hoạch phát triển bộ kit ELISA phát hiện thuốc trừ sâu gốc cyclodiene là một để tài mới và có ý nghĩa thực tiễn góp phần kiểm soát đư lượng thuốc trừ sâu phục vụ
công tác vệ sinh an toàn thực phẩm tại Việt Nam
Trang 16UL VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP 1 Vậi liệu và thiết bị
- Giếng nhựa cho ELISA: Maxisorp™, Nunc Co an mach)
- Succinic anhydride; 6-Aminocaproic acid; Horseradish peroxidase (HRP), keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA) 335/5
tetramethybenzidine (TMB), N-hydroxysuccinimide (NHS); N,N-dicyclohexy! carbodiimide (DCC), 4-dimethylaminopyridine (DMAP), Silicagel TLC; Silicagel 90; ure hydrogen peroxide; Tween 20; dichloromethane; dimethy! formamide (DMF): Merck AG (Đức)
- 1-hydroxychlorden; chlorendic anhydride; Freund's complete va incomplete adjuvant,
goat anti-rabbit IgG-HRP, bao thẩm tich: Sigma (USA)
- Ngoài ra còn có các hóa chất và dung môi phổ thông khác
- Máy đọc ELISA (ELX 800- Lionheart): dùng đo mật độ quang các giếng ELISA - Máy ly tâm (Hettich 400)
- Spectrophotometer (Genesys 1200): chú yếu dùng đo nông độ các protein
- Máy sắc ký khí đầu dò ECD: Schimadzu GC 17A, cột mao quần: Alltech BPX50, 30mx0.32mm
3 Tóm tắt các phương pháp đã sử dụng 2.1 Phương pháp tổng hợp hapten
Các hapten dùng cho việc phát triển bộ kit ELISA cho cyclodiene được tổng hợp
dựa trên các tài liệu khoa học đã công bố (Lee, 1995, 1997 và Brummei, 1997) Các bước
thực biện sẽ được trình bày kết hợp trong phân kết quả 2.2 Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể đa dòng
Ref: Tijssen, P (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays Elsevier Science Publishers B.V
Chuẩn bị kháng nguyên: pha loãng cộng hợp kháng nguyên với nước muối sinh lý đến nồng độ 0.5mg/ml Cho lần tiêm đầu tiên dung dịch cộng hợp này được trộn nhũ lương
v6i Freund’s complete adjuvant, cda những lần tiếp theo cộng hợp được trộn với Freund’s incomplete adjuvant, t lệ trộn bel Hồn hợp nhũ tương kháng nguyên được phân chia
thành nhiều phân nhỏ được bảo quản tại -20°C
Trang 17Tiêm kháng nguyên cho thổ với liểu lượng 0.5rng kháng nguyén/con/lan tiêm
Lượng kháng nguyên trên được tiêm thành nhiễu mũi trên lung và 2 mũi vào bắp đùi
trong,
Khoảng cách giữa hai lần tiêm là một tháng Bất đầu từ lần tiêm thứ 2, mỗi 2 tuần sau khi tiêm thì thỏ được lấy một lượng máu nhỏ từ tai để kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA gián tiếp
2.3 Phương pháp ELISA gián tiếp kiểm tra mức độ đáp ứng miễn địch
Ref: Tijssen, P (1985) Practice and Theory of Enzyme immunoassays Elsevier Science Publishers B.V
- Pha cộng hợp giữa kháng nguyên trong đệm carbonate pH 9.6 vdi néng d6
Spl/ml
- Cho dung dich khang nguyên vào các giếng ELISA : 100ul/giếng, riêng các
giếng đối chứng thay vì dùng cộng hợp thì dùng protein không gần hapten
- Ủ các giếng tại nhiệt độ phòng qua đêm, sau đó rửa sạch bằng dung dịch 0.05%Tween20
- Pha dung dịch đệm cho kháng huyết thanh: pha 1% protein đã dùng gây miễn dịch (nhưng không có gắn hapten) trong đệm PBS
-_ Kháng huyết thanh thổ được pha loãng trong dung dịch đệm trên theo các nồng
độ khác nhau gồm 1/1000, 1/10.000 cho đến 1/1000.000 rồi cho vào mỗi giếng đã phủ cộng hợp, 100Hl/giếng
-_ Sau 30 phút rửa sạch bằng 0.05%Tween20 rồi cho 100 ki kháng thể kháng huyết thanh thỏ có gắn enzyme HRP vào tất cả các giếng
- _ Sau một thời gian ủ, rửa trôi tất cả các lượng còn dư rồi cho hỗn hợp cơ chất vào (TMB/ H;O;- đệm acetate pH 5.0) Dừng phản ứng bằng 10% H;SO¿ rỗi đọc mật
độ quang Xác định tỉ lệ pha loãng cho mật độ quang đạt khoảng 1.0 (sau khi đã
trừ mật độ quang của giếng đối chứng) Theo dõi quá trình tăng dần của lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh thỏ thông qua độ tăng dần của d lệ pha loãng để theo đối được mức độ đáp ứng miễn dịch của các thỏ thí nghiệm
2.4 Phương pháp tách thành phần lzG từ kháng huyết thanh bằng cách tủa trong
ammonium sulfate
Ref: Tijssen, P (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays Elsevier Science Publishers B.V.,
-_ Chuẩn bị dung dich ammonium sulfate bao hda tai nhiệt độ phòng (25°C)
- _ Kháng huyết thanh được ly tâm để loại bó hồng cầu
- Cho ty tit dung dich ammonium sulfate bao hda vao huyét thanh, vita cho vita
khuấy đều để nồng độ muối trong dung dịch tăng đều và từ từ, tránh tủa cục bộ
Trang 18-_ Tủa Bình thành trong dung dich chủ yếu là thành phan IgG
-_ Đem ly tâm ở 5000xg để loại bỏ phẩn nước ở trên và lấy tủa
- Hda cặn trong đệm PBS, nếu cần thiết có thể cho tủa lại theo quy trình trên - Cuối cùng sản phẩm được đem thẩm tích trong PBS ở nhiệt độ 4'C, thay nước
thật nhiều lần để loại bỏ hoan toan ammonium sulfate
-_ Cho thêm merthiolate 0.01% và bảo quản kháng thể tại nhiệt độ 4°C
2.5 Phương pháp ELISA cạnh tranh trực tiếp cho endosulfan
Ref: - Tijssen, P (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays Elsevier Science Publishers B.V
- Singh SB, Kulshrestha G (2004) Determination of endosulfan residues in eggplant
(Solanum melongena) by ELISA J Environ Sci Health B 39(3):411-8
ˆˆ Chuẩn bị các dung dịch sau: - Pém PBS (Phosphate-buffered saline): pH 7,4 13,8g Na;HPO 12HO 1.6g NaHPO,.H,0 9,0g NaCl Pha loãng trong | lit nudc cat, bdo quan tai 4°C - Bém carbonate: pH 9.6 1.6g Na;CO; 2.9g NaHCO3 Pha loãng trong 1 lít nước cất, bảo quần tại 4”C -_ Cơchất: gồm 2 thành phần
-A: 1% TMB pha trong DMF
- B:6,2g sodium acetate + 2.5 g B-cyclodextrin + 150 mg urea hydrogen
peroxide, pha trong 1 lít nước cất, chỉnh pH bang acid citric đến pH = 5.0, bảo quan tai 4°C
Trước khi dùng trộn A/B theo tỉ lệ 1/30
Cách tiến hành:
- Kháng thể được pha trong đệm carbonate pH 9.6, cho vào các giếng ELISA mỗi
giếng 100nl, để tại nhiệt độ phòng qua đêm (khoảng 12h)
~ Rửa sạch các giếng bằng 0.05% Tween20, cho vào mỗi giếng 20041 BSA 1% nhằm ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu, sau 1h để tại nhiệt độ phòng, rửa sạch bằng 0.05%
Tween20
- Cho 50nl methanol 10% có chứa chuẩn endosulfan nổng độ từ 0 đến 100 ppb, sau
đó cho 500! cộng hợp đã được pha với nêng độ thích hợp (là nồng độ cho mật độ quang tối
Trang 19
đa đạt 0.8 — 1.5) vào tất cả các giếng, riêng giếng blank được cho 50nl methanol 10% và 50y11 dung dịch đệm pha cộng hợp
- Cho phan ứng trong 30 phút, sau đó đổ ra và rửa sạch bằng 0.05% Tween20
- Cho 100.1 hỗn hợp cơ chất vào mỗi giếng, sẽ có xuất hiện màu xanh
- Sau 30 phút đừng phản ứng bằng 10% H;SOu, đọc mật độ quang tại bước sóng
450nm để dựng đường chuẩn:
% ức chế =(I —¬ 100 me
trong đó Ao : mật độ quang tại giếng đối chứng âm (không có thuốc trừ sầu)
Ax: mật độ quang tại giếng chuẩn Asia: mật độ quang tại giếng blank
Dựng đường chuẩn với trục X là logarith của nồng độ chất chuẩn IC50: được tính là nỗng độ chuẩn tạo ra 50% ức chế
2.6 Phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp cho endosulfan
Ref: Tijssen, P (1985) Pracrice and Theory of Enzyme Immunoassays Elsevier Science
Publishers B.V.,
- Chuẩn bị các dung dịch đệm tương tự như ELISA cạnh tranh trực tiếp
- Pha cộng hợp protein- hapten trong đệm carbonate, cho vào các giếng với
100U1/giếng, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng
-_ Rửa sạch các giếng bằng 0.05% Tween20, cho vào mỗi giếng 200w! BSA 1% nhằm ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu, sau 1h để tại nhiệt độ phòng, rửa sạch bằng
0.05% Tween20
- Cho chuẩn endosulfan từ 0-100ppb vào các giếng, 501 /giếng Cho kháng thể đã pha loãng tại một nổng độ tương ứng vào tất cả các giếng trừ giếng blank
~_ Sau khi ủ 30 mỉn tại nhiệt độ phòng, rửa sạch các giếng bằng 0.05% Tween20 - _ Cho kháng thé kháng kháng thể thỏ có gắn HRP vào tất cả các giếng
- Cho phan tng trong 30 phút, sau đó đổ ra và rửa sạch bằng 0.05% Tween20
-_ Cho 100ml hỗn hợp cơ chất vào mỗi giếng, sẽ có xuất hiện mầu xanh
-_ Sau 30 phút đừng phản ứng bằng 10% H;SOu, đọc mật độ quang tại bước sóng
450nm để dựng đường chuẩn tương tự như ELISA cạnh tranh trực tiếp 2.7 Phương pháp đo nồng độ protein
Ref: Harlow Ed, Lane D (1999) Using antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laborarory Press, Cold Spring Harbor, New York
Đây là phương pháp đo nhanh và đơn giần để xác định nông độ protein một cách tương
đốt
Trang 20Dung dịch protein / kháng thể (có độ tỉnh khiết cao) được pha loãng trong đệm PBS Đo mật độ quang của dung dich tại bước sóng 280nm
Hệ số chuyển đổi của phép đo được tính gần đúng như sau: Protein A2sonm (cho 1mg/ml) BSA 0.7 IgG 1.35 IgM 12
2.8 Phương pháp sắc ký khí xác định nhóm clo hữu cơ trong mẫu rau quả
Ref: - 10.101: AOAC Intemational Official Methods of Analysis (1995) 18" ed; Arlington - $19: Manual of pesticide analysis (1979), Deutshe Forchungsgemeinschafi Pesticide Comission - Xay 25g mẫu và khoảng 70ml aceton trong máy Xay mẫu, lọc qua phễu lọc áp suất kém, tráng rửa bằng 30m] aceton - Chuyển lượng dịch chiết vào phễu chiết, cho thêm 10ml nước muối NaCl 10% và 70ml đíchloromethane
-_ Loại bỏ phần nước bên dưới, làm khan dung dịch bằng Na;SO,
- Cho vao bình cô quay, tráng rửa bằng 5-10ml ethylacetate và cô quay đến khoảng 3ml -_ Cho vào cột silicagel (2g silicagel, đã sấy 2h tại 110°C, cho 5% nước), rửa cột bằng 10ml hexan ~_ Giải hấp bằng toluen, định mức tại 10ml, tiêm vào sắc ký khí tiầu dò BCD - _ Chương trình nhiệt: GC: Schimadzu GC 17A Column: Alltech BPX50, 30mx0.32mm Injector: 290 oC ECD-Detector: 300 oC Tổng thời gian chạy: 24min Nhiệt độ đâu cột: 120 oC
Giai đoạn 1: 10 °C/min to 240 oC, giữ 5min
Giai doan 2: 20 °C/min to 280 oC, gift 7min
16
Trang 21IV KẾT QUÁ
1 Tổng hợp hapten
Dựa theo tài liệu khoa học đã công, bố (Lee, 1995, 1997 và Brummel, 1997) các
bapren được lựa chọn để tổng hợp bao gồm các chất sau:
Hapten II: 4-Oxobutanoid acid, (4-(4,5,6,7,8,8-hexachloro-3a,4,7, 7a-tetrahydro- 4,7-methano-1H-indenyl-1-oxy}
Hapten IV: 6-(1,4,5,6,7,7-Hexachlorobicyclo {2.2.1} -heptane-2,3b-succinimido) caproic acid
Hapten II: Hòa tan I-hydroxychlorden va succinic anhydride voi tỉ lệ mol 1;2 rong
pyridin khan, tiếp đó cho thêm một lượng nhỏ DMAP Khuấy hỗn hợp trong môi trường
nitd, tại nhiệt độ phòng qua đêm, sau đó cô quay chân không loại bỏ pyridin và hòa cận
bing ethylacetate Lần lượt rửa hỗn hợp bằng dung dịch “HC 1M, nước và nước muối bão hòa, cuối cùng làm khan bằng MgSO Cô quay chân không để cô đặc hỗn hợp phản ứng
và làm sạch qua cột silicagel với hỗn hợp dung môi rửa giải là dichloromethane/methanol 97:3 Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký bản mông (TLC), lựa chọn một số phân đoạn
nghỉ ngờ là có sản phẩm mong muốn để kiểm tra bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy hapten Iĩ xuất hiện trong những phân đoạn đầu Dựa trên kết quả kiểm tra TLC lựa chọn những phân đoạn đầu có sản phẩm ở độ sạch cao nhất, thu hồi những phân đoạn này đuổi dung môi và kiểm tra lại bằng !H-NMR Kết quả thu được khoảng 1g sắn phẩm với độ tinh khiết của sắn phẩm đạt >95%
ch Ch Succinic anhydride
ol : OH
cl cl
1- hydroxy-chlordene Hapten II
Hình 4 Sơ đê phản ứng điều ché hapten I (Lee, 1995)
Hapten IV: Việc tổng hợp hapten [V dude tiến hành như sau: hoà tan 6-
Aminocaproic acid va chlorendic anhydride trong toluene có triethylamine (TEA) Dun
hoàn lưu hỗn hợp trên trong 8 h tại 140°C sau đó loại toluene bằng cô quay chân khong A xít hóa phần cặn còn lại bằng một lượng dư HCI 1%, vừa chườm lạnh vừa khuấy nhẹ nhàng, dung dịch sẽ có những tủa trắng Lọc áp suất kém lấy phần kết tủá, rửa bằng nước
lạnh Sau đó đem phần cặn hòa tan trong dung dich hexane/dichloromethan (5:1) néng
Làm nguội từ từ sau đó để trong tủ lạnh để sản phẩm kết tính Lọc lấy phần kết tỉnh và rửa sản phẩm bằng dichloromethan lạnh Kiểm tra bằng phổ !H NMR (Phụ lục 2) để
1?
Trang 22khẳng định cấu trúc của sản phẩm Kết quả thu được sau nhiều mề phần ứng là 1.3g sản
phẩm với độ tỉnh khiết trên 90% cl cL ci fl ci cl cl : ° NH;{CH:]¿COOH cụ _—————— 0 ch cl cl 5 cí N—{GH,),COOH ø a
Chlorendi¢ anhydride Hapten IV Hình 8 Sơ đồ phản ứng điêu chế hapten IV (Lee, 1997, Brummel, 1997)
, 2 Tạo cộng hợp hapten và protein
Các hapten trên được gắn lên phân tử protein theo sở đồ sau: DCC, DMAP HaN-protein R-COOH + NHS—-———-—_» R-NHS._ ester ——_——_» R-CO-NH-protein (active ester) DCC: N.N' Dicyclohexyl carbodiimide NHS: N-hydroxy succinimide
“Theo một số tài liệu, người ta cho phản ứng diễn ra trong dung môi hữu cơ tan được
trong nước nhu DMF khan Sau đó ly tâm hoặc lọc bỏ sản phẩm phụ kết tủa là
dicyclohexylisourea (DCU), réi cho toan bộ hỗn hợp phản ứng vào dung dịch protein Qua thử nghiệm cho thấy do hỗn hợp phần ứng còn quá nhiều sản phẩm phụ nên khi cho vào dung dịch protein sinh rất nhiều tủa và cũng làm protein bị kết tủa nên sau đó phải loại các tủa này bằng lọc hoặc bằng ly tâm Phương pháp này tuy gọn nhẹ nhưng rất khó kiểm
soát được lượng hapten phần ứng với protein Nó chỉ thích hợp với những trường hợp lượng
hapten có quá ít không thể tinh chế Do đó để hạn chế các nhược điểm trên succinimidyl
ester của các hapten sẽ được tỉnh chế từ hỗn hợp phản ứng sau đó mới cho phản ứng với
protein
Các bước tiến hành được thực hiện như sau (Lee, 1995): hda tan hapten, NHS và
DCC trong dichloromethane khan theo t lệ 1:2:2, sau đó cho một lượng nhỏ DMAP (có
vai trò làm xúc tác) vào Chườm lạnh và khuấy đều hỗn hợp trong môi trường nitơ trong 2h rồi tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm Lọc bỏ tất cả kết tủa, cô đặc và tỉnh chế lấy sản phẩm ester của các hapten trên qua cột siicagel với hỗn hợp dung môi
dichloromethane/ethylacetate Tang dân lượng cthylacetate trong hỗn hợp dung môi từ 5
đến 15% và theo dõi các phân đoạn bằng TLC, so sánh các vết hỗn hợp sản phẩm với
nguyên liệu là hapten Sản phẩm NH§ ester của các hapten do kém phân cực hơn sẽ ra
trong các phân đoạn đầu Lấy phân đoạn nghỉ ngờ.có nhiều khả năng chứa sản phẩm kiểm
18
Trang 23
tra NMR để kiểm chứng lại Sau đó thu thập những phân đoạn có chứa NHS-ester đem cô quay để lấy sản phẩm Vì không cẩn chú trọng đến hiệu suất phản ứng nên chỉ lấy những phân đoạn có độ tỉnh khiết cao và hiệu suất cuối cùng của phản ứng sau khi đã qua cột
làm sạch đạt trung bình khoảng 45% Kết quả từ những hapten đã tổng hợp ở trên đã thu được các succinimidyl ester của chúng với độ tính khiết 90% trở lên (Phụ lục 1,2)
Hòa tan protein keyhole limpet hemocyanin (KLH) hoặc bovine serum albumin
(BSA) trong đệm photphate 0.1M pH 9 với nông độ 2mg/ml NHS-ester của hapten II được
hòa tan trong DMF khan, tỉ lệ mol của hapten và protein được chọn là 40: 1 Cho nhỏ giọt
dung dich hapten II vào dung dịch protein đang khuấy đều và chườm lạnh Để hỗn hợp
phần ứng trong môi trường lạnh qua đêm sau đó đem thẩm tích trong phosphate buffer
salin (PBS) pH 7.4 Cộng hợp hapten II -KLH được dùng làm kháng nguyên để gây miễn địch
Hapten IV được gắn với enzyme hoseradish peroxidase (HRP) bằng phản ứng tương
tự như trên tuy nhiên NHS-ester của hapten IV được thử nghiệm cho vào dung dịch HRP với những tỉ lệ mol là 2:1; 5:1; 10:1, 20:1 và 40:1 Tất cá những công hợp enzyme trên đều
được thẩm tích trong PBS lạnh, dùng để cho các thử nghiệm thiết kế bộ kit về sau
Do theo tài liệu, phần ứng của succinimidyl ester voi protein rất để đằng xảy ra nên bầu như chắc chắn hỗn hợp phản ứng sẽ thu được cộng hợp hapten và protein Tuy nhiên một vấn để được đặt ra xác định hiệu suất gắn của các hapten này lên protein hoặc enzyme Qua tham khảo rất nhiều tài liệu, các tác giả đều không để cập đến việc đo hiệu suất gắn Riêng theo sách của Tijssen, P (1985) người ta có thể đo nỗng độ nhóm amin
của dung dịch protein trước và sau khi gắn bằng phương pháp đơn giản với 2.4,6-
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) Tuy nhiên thực sự khi thực hiện theo phương pháp
này thì độ chênh lệch quá nhỏ nên không thể xác định được Đồng thời lượng mẫu cũng
rất giới hạn nên không thể đủ để tiếp tục lặp lại phương pháp trên 3 Gây miễn dịch sản xuất kháng thể
Cộng hợp kháng nguyên hapten II-KLH đã được dùng để gây miễn dịch trên thỏ Bắt đầu từ lần tiêm thứ 2, mỗi 2 tuần sau khi tiêm thì thỏ được lấy một lượng máu nhỏ từ
tai để kiểm tra mức độ đáp ứng miễn dịch bằng ELISA gián tiếp
Xác định độ pha loãng tối đa của kháng huyết thanh cho OD đạt trong khoảng 1.2 +
0.5 Kết quả cho thấy 5 thỏ được gây miễn dịch đều có đáp ng, tuy nhiên mức độ có khác nhau Độ pha loãng kháng huyết thanh sau các mũi tiêm đã tăng lên cho thấy có sự gia tăng thành phần kháng thể kháng hapten II Đối với thỏ cho đáp ứng tốt nhất độ pha loãng
đo được sau mũi tiêm thứ 4 là khoảng 1/300.000 Từ mũi tiêm thứ 5 và 6 không còn thấy sự gia tăng đáng kể độ pha loãng do đó các thỏ được ngừng tiêm và được lấy một lượng
máu lớn để thu kháng huyết thanh Kháng huyết thanh của thỏ có mức độ đáp ứng miễn dịch tốt nhất được đem tinh chế bằng cách cho tủa với ammonium sulfatc để lấy thành phần kháng thể IgG dùng cho các phần ứng tiếp theo Lượng kháng thể thu được của thỏ có đáp ứng tốt nhất sau khi tỉnh chế bằng ammonium sulfate là22ml với nồng độ 15mg/ml Lưu ý đây là nổng độ của IgG tổng số thu được từ kháng huyết thanh, thực chất thành
phdn IgG dac hiệu cho kháng nguyên chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ tối đa là 10% (Tijssen,
1988)
19
Trang 244 Lựa chọn phương thức ELISA
Đối với thuốc trừ sầu là những chất có phân tử lượng nhỏ, người ta luôn áp dụng
ELISA cạnh tranh Tham khảo các tài liệu thì đa số các tác giả lựa chọn phương thức
ELISA cạnh tranh trực tiếp trong đó thuốc trừ sâu và cộng hợp enzyme canh tranh với
nhau để bám vào kháng thể Phương thức này có ưu điểm thời gian thực hiện ngắn, tuy nhiên có nhược điểm là cộng hợp enzyme dễ bị ảnh hưởng bởi các chất nền trong dịch chiết mẫu Một số tác giả lựa chọn phương thức ELISA cạnh tranh gián tiếp, trong đó kháng nguyên cố định trên giếng và thuốc trừ sâu cạnh tranh để gắn kết với kháng thể Phương thức này ít bị ảnh hưởng bởi chất nền của dịch chiết mẫu do dịch chiết chỉ tiếp xúc trực tiếp với kháng thé 1a thanh phan ít nhạy cảm hơn cộng hợp enzyme Tuy nhiên nó có
nhược điểm là thường cho độ nhạy kém hơn và bên cạnh đó thời gian thực hiện dài hơn vì phải thêm 1 bước sử dụng kháng thể thứ hai có đánh đấu enzyme
ELISA cạnh tranh trực tiếp
Endosulfan là thuốc trừ sâu đại điện được dùng để khảo sát theo quy trình ELISA cạnh tranh trực tiếp như sau:
Để tiến hành cẩn xác định néng độ phủ kháng thể trên giếng và nổng độ cộng hợp tương ứng là bao nhiêu để phép đo cho kết quả tốt nhất Trên các giếng ta phủ kháng thể ở một số nồng độ khác nhau đồng thời cho cộng hợp enzyme (lựa chọa sản phẩm gắn hapten IV với HRP tỉ lệ 10:1) với rất nhiều nồng độ vào các giếng Kết quá thu được là mật độ quang (OD) tối đa của mẫu đối chứng âm của các nghiệm thức Tóm tắt kết quả thu được trong đồ thị dưới đây: đã 3.0 25 —*— KT 20 ug/giếng —— KT 1.0 ug/giếng KT 0.5ug/giếng —— KT0.2 ug/giếng —— KT0.1ug/giếng 0.000 0.200 0.400 0,600 0.800 1.000 Néng 46 cong hgp (ug/ml)
Hình 6 ODmax của phân ting ELISA với các nông độ phủ kháng thể khác nhau
Kết quả cho thấy kháng thể phủ với nồng độ từ 1.0ug/giếng trở đi thì OD max sẽ đạt độ bão hòa là 3.0 khi tăng dân lượng cộng hợp Và như vậy chọn nông độ phủ kháng thể
20
Trang 25——————— là 1ug/giếng cùng néng độ cộng hợp hợp tương ứng là 0.02ng/ml để đạt OD trong khoảng từ 0.8-1.5 là phù hợp nhất vì đó là điểm mới đạt 1/ 2 độ bão hòa, thuận lợi cho phản ứng cạnh tranh Dựng đường chuẩn với endosulfan tại nông độ phủ kháng thể 1.0ug/giếng và néng
dé cong hgp enzyme (hapten IV-HRP) là 0.02ug/ml cho
thấy kháng thể thu được rất nhạy
với endosulfan Nông độ endosulfan gây ra 50% ức
chế mầu (gọi là 1Czø) là 1.0 # 0.5 ppb
(Hinh 2)
'Thử nghiệm tương tự với các sản phẩm công hợp enzyme
có tỉ tệ hỗn hợp phan ứng
hapten/HRP khác cho kết quả như sau: Tỉ lệ 2:Ì
: cộng hợp lên màu rất kém, nên cần
tượng cộng hợp lớn với nỗng độ khoảng 10pg/ml và từ
đó dẫn đến độ nhạy của phép thử giảm, cụ thể IC50 là 3ppb Tỉ lỆ 5:1; néng d6 cng hợp
yêu cầu là 0.2ug/ml Tỉ lệ 10:1 ;
20:1 và 40:1: đều yêu cầu nông độ công hợp tà 0.02ng/ml,
như vay khi cho hỗn hợp phần
ứng với tỉ lệ hapten: HRP từ 10:1 trở đi hiệu suất gắn
đã đạt độ bão hòa Từ tỉ lệ gin 5:1 trở đi IC50 đều không có gì thay đổi Từ các kết quả
trên cho thấy khi tiến hành gắn cộng hợp, tỉ 1é hapten: enzyme HRP 10:1 là hợp lý nhất
Và tất các thí nghiệm tiếp theo đêu xử dụng cộng hợp enzyme với tỉ lệ gắn này
Khảo sát sự ổn định của đường chuẩn cho thấy tại
những nông độ thấp hơn 1C50 là 1.0ppb mức độ sai số của các điểm chuẩn tương đối
cao có thể lên đến 32% nhưng tại những điểm lên hơn 1.5ppb thì lệ sai số có thể chấp
nhân được giao dong ty | đến 9% 50.00 Dé ức chế (®%` 25,00 0,00 0,10 100 10,00 100,00 Endosoltan technical (ppb)
Hinh 7 Dudng chudn ELISA déi voi endosulfan, tính
trung bình trong 3 ngày
ELISA cạnh tranh gián tiếp
Để thử nghiệm cạnh tranh gián tiếp cho endosulfan,
công hợp hapten IV-BSA được
cho vào các giếng ELISA với nhiều nông độ khác
nhau từ 0.1 đến 2ug/giếng trong đệm
carbonate để chúng phủ lên giếng Tương ứng
với từng mức độ phủ cộng hợp lựa chọn
nông độ kháng thể tối thiểu đạt ODmax từ 0.8- 1.5, Sau
đó tiến hành phần ứng cạnh tranh
Kết quả cho thấy khi sử dụng nông độ phủ công
hợp quá cao hoặc quá thấp đều cho độ nhạy kém Ở nồng độ phủ kháng thể 0.2 -0.50ø/giếng
thì độ nhạy của phản ứng cạnh
Trang 26tranh gián tiếp đạt kết quả tốt nhất Tùy nhiên, kết quả tốt nhất này vẫn kém xa kết quả
của cạnh tranh trực tiếp IC50 đối với endosulfan vào khoảng 85+10 ppb, như
vậy là kém
gần 100 lần so với cạnh tranh trực tiếp
Thử nghiệm trộn kháng thể (pha loãng tới nồng độ cần thiết cho ELISA cạnh tranh gián tiếp) và các chuẩn endosulfan trong các giếng bên ngoài trước, ủ 1h để phản ứng kháng nguyên kháng thể đạt độ cân bằng sau đó mới cho hỗn hợp này vào giếng phủ cộng hợp kháng nguyên, tuy nhiên kết quả không hể được cải thiện Điều này cho thấy ái lực của hapten IV trong cộng hợp đối với kháng thể gây bởi hapten IL vin còn quá cao Nếu
muốn tăng độ nhạy của phương pháp thì phải tim một hapten khác phù hợp hơn Nhưng vì do diéu kiện có hạn nên phương thức cạnh tranh gián tiếp trên không được tiếp tục được nghiên cứu thêm 100.00 75.00 50.00 We ché (%) 25.00 000 | —————— =———— tò io 1900 18000 Endosulfan (ppb)
Hinh 8 Dé thi ELISA cạnh tranh gián tiếp đối vdi endosulfan
5 Phản ứng chéo với các thuốc trừ sâu gốc cyclodiene khác
Khảo sát khả năng phát hiện các thuốc trừ sâu gốc cyclodiene khác được thực hiện
bằng cách dựng đường chuẩn ELISA cạnh tranh trực tiếp đối với từng chất, tương tự như
cách làm đối với endosulfan, thu được kết quả nhu bang 2
Trang 27Bảng 2 Phần ứng chéo với các cyclodiene khác 'Tên chất ICs» (ppb) Endosulfan technical (a:= 7:3) 1.0 œ -Endosutfan 19 B-Endosulfan 0.8 Endosulfan sulfate 0.6 Aldrin 0.6 Dieldrin 0.6 Chiordan 96 Heptachlor 3.1 Endrin s3 Lindane 68.0
6 Khảo sát các yếu tố ảnh hướng để thiết kế bộ kit
Để có thể sử dụng bộ kịt cho việc phân tích mẫu cần khảo sát các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phần ứng Các yếu tố có thể gây ảnh hưởng đã được khảo sát là độ pH, dung môi, các ion, một số chất dùng để pha cộng hợp và chất nên của mẫu
Độ pH: các dung dịch chuẩn được pha trong 10 % methanol! với các độ pH khác nhau
tir 3.0 dén 11.0 (dang acid citric va NaOH để chỉnh pH) Qua so sánh các đường chuẩn cho thấy pH từ 4 cho đến 10 không có sự ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của phần ứng
Một số ion: đã thử kiểm tra một số ion là Mg", Ca", Cl, Na* va Fe’*, Két qua cho
thấy khi cho NaCl với nổng độ đến 1000 mM cũng chưa thấy có sự thay đổi nào về kết
quả phần ứng Còn đối với MgCl; hoặc CaCl; , từ nông độ 50 mM trở đi đã thấy có sự
giảm độ hiện màu Riêng với Fe?" thì sự có mặt của ion này từ nông độ 5mM trở đi đã làm
giầm màu rõ rệt như vậy trong dung dịch mẫu nên tránh có sự xuất hiện của ion Fe”” hoặc nếu có cần giảm nỗng độ của ion này xuống dưới 5mM
Đối với các dung môi dùng để pha chuẩn, một số dung môi phổ thông dùng cho việc
tách chiết mẫu được thử nghiệm là methanol, aceton và acetonitril Khi cho dùng các dung
Trang 28—®— Mecthanol — — Acetonitril | | me 3 ODmax Néng d6 (%)
Hình 9 Ảnh hưởng của nông độ cdc dung méi lén OD max
Một số protein như fish gelatin, gelatin, BSA thường được rất nhiều các tài liệu
dùng để pha vào đệm pha cộng hợp cũng đã được khảo sát với các nông độ từ 0.1% cho đến 1% So sánh với cộng hợp chỉ pha trong PBS thì khi có mặt các protein trên màu đều
hiện lên đậm hơn hẳn Độ gia tăng mật độ quang thường đạt từ 30% đến 40% trong đó
BSA cho độ tăng màu nhiều nhất Tuy nhiên chúng không ảnh hưởng đến % ức chế nên
không ảnh hưởng đáng kể đến đường chuẩn Tác dụng của việc cho thêm các protein này
vào thể hiện rõ nhất ở việc bảo quản cộng hợp như sẽ nói ở phần sau
7 Khảo sát giầm ảnh hưởng chất nên của các mẫu rau quả
Một số loại mẫu đã được chọn để thử nghiệm gồm mẫu rau và trái cây sau: rau
muống, cải xanh, bắp cải: đại diện cho nhóm rau ăn lá; đậu cô ve và cà chua đại điện cho nhóm rau ăn trái; khoai tây và cà rốt đại diện cho nhóm rau củ, còn lê, táo, mận và nho
đại diện cho nhóm trái cây được ăn cả vô
Để xác định ảnh hưởng của địch chiết mẫu, các đường chuẩn của endosulfan pha trong dịch chiết mẫu (mẫu sạch không nhiễm thuốc trừ sâu) và pha trong 10% methanol được dựng và so sánh với nhau Kết quá cho thấy tuy mức độ có khác nhau nhưng dịch chiết của tất cả các mẫu trên đều có ảnh hưởng đến kết quả thông qua việc đường chuẩn của dịch chiết mẫu dịch chuyển về bên phải so với đường chuẩn trong dung môi methanol Nghĩa là chúng đều dẫn đến việc màu của mẫu bị giảm và như vậy đễ dẫn đến việc mẫu sẽ bị kết luận dương tính giả Trong đó rau muống, mận và nho là gây ảnh hưởng chất nền mạnh nhất Các mẫu này có thể gây ra độ giảm màu từ 30-40%
Trên nguyên tắc để loại bổ ảnh hưởng chất nên người ta dựng đường chuẩn trong dịch chiết của mẫu trắng (đã biết trước không bị nhiễm) Tuy nhiên với mục đích ứng
dụng bộ kit cho nhiều loại mẫu rau và trái cây khác nhau, việc pha chuẩn trong mẫu trắng
Trang 29sẽ rất bất tiện cho người sử dụng Do đó hàng loạt thử nghiệm được tiến hành để loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu
Pha loãng dịch chiết mẫu
Việc pha loãng mẫu sẽ giảm thiểu được mức độ ảnh bưởng rất nhiều nhưng khơng triệt tiêu hồn tồn ảnh hưởng này Tùy từng loại mẫu mà mức độ ảnh hưởng chất nền khác nhau tuy nhiên các mẫu đã khảo sát đều có đặc điểm chung là dù đã pha loãng mẫu đến rất loãng là 200 lần so với dịch chiết ban đâu, ảnh hưởng chất nền vẫn còn và vào khoảng 10% Anh hưởng chất nến giảm rõ rệt nhất khí pha loãng dịch chiết mẫu 10 đến
20 lần, còn sau đó giảm rất chậm
Theo tài liệu Wang (2004) việc pha loãng mẫu trong dung dịch fish gelatin 0.5% sẽ
giúp loại bổ ảnh hưởng chất nên Tuy nhiên các thử nghiệm đối với các mẫu rau và qua không khẳng định kết quả bài báo đã viết Việc cho thêm fish gelatin hoặc một vài protein khác như casein, BSA vào dung dịch pha lỗng mẫu khơng cho thấy sự cải thiện đáng kể
so với việc pha loãng mẫu trong nước cất hoặc 10% methanol Hơn nữa bản thân cộng hợp đã được pha trong đệm có chứa 0.5% fish gelatin nên việc dùng thêm fish gclatin để pha
loãng mẫu là không cần thiết Tuy nhiên pha loãng là một biện phát đơn giản nhất và kết quả cũng có thể chấp nhận được Tùy vào mẫu và nồng độ endosulfan mà ảnh hưởng của chất nền sẽ còn từ 10% đến 30% sau khi dịch chiết mẫu được pha loãng 20 lần, nói chung nồng độ càng thấp thì tỉ lệ sai số càng lớn
Qua cột làm sạch
Lựa chọn một loại mẫu đại diện là mẫu rau cải và áp dụng các quy trình làm sạch
mẫu cho sắc ký khí trên mẫu này Sau khi đã thứ làm sạch mẫu qua các cột chiết pha rắn gồm cột C18, cột florisil, cột silicagel, than hoạt tính Dịch giải hấp bằng dung môi hữu cơ
qua các cột sau khi thổi khô định mức lại trong methanol 10% cho kết quả rất tốt, hầu như không còn bị ảnh hướng bởi chất nền của mẫu Tuy nhiên việc sử dụng các cột làm sạch sẽ tốn kém và mất nhiều thời gian Do đó biện pháp này không có ưu thế trong việc Ứng dụng trên thực tế
Trích lâng-lẳng
Với dự đoán các chất gây ảnh hưởng chất nền thường là các chất làm ảnh hưởng
hoạt tinh cha enzyme hodc kháng thé là những chất tan tốt trong nước nên thử nghiệm trích lỏổng- lồng được tiến hành
Mẫu được trích đâu tiên trong methanol 100%, sau đó địch chiết được pha loãng 5 lẩn, cho thêm NaCl réi được thử trích trong một số dung môi kém phân cực là
ethylacetate, dichloromethane va hexan Sau khí trích thổi khô các dung môi và hòa cặn
trong methanol 10% So sánh kết quả thu được khi trích với các dung môi trên cho thấy hexan cho kết quả rất tốt Ảnh hưởng chất nễn hầu như không còn đáng kể vì nằm trong
khoảng sai số của bản thân phương pháp Tuy nhiên biện pháp này cũng tốn thời gian và công sức hơn biện pháp pha loãng mẫu
Trang 30Kết luận
Sau khi đã thứ một số các biện pháp làm giảm thiểu ảnh hưởng chất nển, biện pháp pha loãng mẫu tuy làm giám độ nhạy nhưng là biện pháp kinh tế nhất Vì IC 50 của phép thứ đối với endosulfan khá nhỏ, vào khoảng Ippb, như vậy đù pha loãng đến độ pha
loãng cuối cùng là 100 lần thì 0.Lppm vẫn ở dưới du lượng, tối đa cho phép của endosulfan (MRL cia endosulfan 14 0.5-2ppm, tiy loại rau quả, Codex)
Với tiêu chí thiết lập phương pháp kiểm tra nhanh, thực hiện đơn giản, thì cách pha
loãng mẫu sẽ là cách hợp lý nhất Khảo sát trên hàng loạt mẫu rau quả khác nhau bao
gồm: rau muống, cải xanh, bắp cải, đậu cô ve, cà chua, khoai tây, cà rốt, lê, táo, mận và
nho, cho thấy độ sai số do nhiễn của nền mẫu tuy có khác nhau nhưng bắt đầu từ nồng độ
của IC50 trở lên thì mức sai số của dung dich đã pha loãng của các mẫu trên sẽ vào khoảng từ 20% -10% (nồng độ càng cao tỉ lệ sai số càng giảm) (Hình 10) Đối với những
mẫu như bắp cải, đậu cô ve, lê và táo thì sai số đạt <10% nghĩa là sai số trên nằm trong khoảng sai số của bản thân phép thử.,Đối với những mẫu còn lại tuy sai số lên tới 20% sẽ có thể dẫn đến một số dương tính giả ở những nồng độ gần nồng độ của C50 nhưng nếu
dùng bộ kít thử ELISA vào việc sàng lọc mẫu vẫn đem lại hiện quả do số lượng mẫu âm
tính thường chiếm một phần lớn
Như vậy biện pháp pha loãng mẫu để làm giảm ảnh hưởng chất nền rất nên được lựa chọn Tuy nhiên trong trường hợp cần nâng cao hơn nữa độ chính xác thì có thể dùng
biện pháp trích lồng lỏng với dung môi hexan 180 tức chế % ° 3 01 1 10 100 Endosulfan (ppb)
—©— Cà chua —+—Rho xanh —#—Nhođỏ —D— Rau cải —X—- Địu có ve —®~ 10% MeOH
Hinh 10 So sdnh đường chudn endosulfan pha trong 10% methanol va dung dich chiết
mẫu đã pha loãng 20 lần trong 10% methanol
Trang 318 Kiểm tra độ thu hôi - xây dựng quy trình phân tích
Do phương pháp pha loãng mẫu là phương pháp kinh tế và phù hợp với mục đích
phân tích một số lượng mẫu lớn, nên chỉ có độ thu hổi của phương pháp này được tiến
hành khảo sát
Trước hết chọn một loại mẫu đại diện là rau cải để kiểm tra độ thu hồi Các bước tiến hành cụ thể như sau: mẫu trắng (không nhiễm thuốc trừ sâu) được xay nhỏ, lấy 5 g một mẫu, gây nhiễm nhân tạo bằng endosulfan với nồng độ là 200ppb, lặp lại 3 lần Trích
trong methanol 100%, tỉ lệ mẫu: methanol là 1:5, thời gian trích 30 phút Dịch chiết mẫu pha loãng 1/20 lần trong methanol 10% đem phân tích Kết quả như sau: nếu sau khi trích
không lọc mẫu mà chỉ hút lớp nước nổi đem pha loãng rồi phần tích thì độ thu hôi khá
kém chỉ đạt <60% và không ổn định Nhưng nếu mẫu sau khi trích được lọc, tráng rửa tiếp
bằng methanol thì độ thu hồi được cải thiện nhiều, đạt >85%
Ap dung quy trình phân tích trên để thử độ thu hồi của các mẫu sau: rau muống, cải xanh, bắp cải, đậu cô ve, cà chua, khoai tây, cả rốt, lê, táo, mận và nho Các mẫu rau quả nêu trên được gây nhiễm endosulfan với ba nồng độ là: 200; 400 và 800ppb, lặp lại 3
mẫu mỗi nỗng độ Tổng kết kết quả thu được được thể hiện trong đồ thị hình 11, Như vậy
nhìn chung độ thu hồi của các mẫu trên đều có thể chấp nhận được D6 thu hoi (%)
BD yo? Oe ới eh Ee? apt
Ha gor" Moh “wees
Hình 11 Độ thu hỗi của một số mẫu
Qua các kết quả trên, ta thấy độ thu hổi của phương pháp đối với các mẫu tương đối tốt, nhưng độ lặp lại chưa được tốt lắm Nguyên nhân chủ yếu bởi 3 lý do sau:
-_ Các mẫu tuy được pha loãng nhưng ảnh hưởng của chất nền vẫn cịn khơng hồn
tồn triệt tiêu nên cũng ảnh hưởng đến kết quả
- Do sai s6 cha ban than phương pháp như trong phần khảo sát đường, chuẩn đã trình
bày
27
Trang 32
~ Do theo quy trình phân tích, áp dụng cách pha loãng mẫu để hạn chế ảnh hưởng của
chất nền đối với mẫu (tổng hệ số pha loãng là 100) nên các sai số sẽ nhân lên Tuy nhiên nếu xét trên góc độ áp dụng ELISA cho việc phân tích sàng lọc mẫu nhanh
thì những nhược điểm trên có thể chấp nhận được Do đó người sử dụng cẩn nấm rõ
những ưu nhược điểm này để quyết định phạm vì áp dụng thích hợp
9 So sánh mức độ tương đồng giữa phương pháp ELISA và sắc ký khí
Để tiến tới dùng sắc ký khí đánh giá kết quá từ các mẫu thực được kiểm tra bằng ELISA, mức độ tương đồng của hai phương pháp cẩn phải được xác định Chọn 2 loại mẫu đại diện là mẫu rau cải xanh và mẫu nho Các mẫu này được gây nhiễm nhân tạo bằng endosulfan với nổng độ 200, 400 và 800ppb, mỗi mẫu lặp lại 3 lần Các mẫu được phân tích bằng ELISA và sắc ký khí, so sánh mức độ tương đồng của các kết quả thu được cho thấy mặc dù không thể so với sắc khí về độ chính xác và độ lặp lại (độ lệch chuẩn tương đối của ELISA là từ 12% đến 39% tùy nồng độ, còn của GC chỉ trong khoản từ 1.2% đến 2.1%) nhưng các kết quả ELISA cũng có sự tương đồng khá tốt đối với kết quả của sắc ký khí Như trong đường hồi quy trong đổ thị hình 12 cho thấy có sự tương quan giữa kết quả của GC và ELISA 1000 1000 2 B 800 ậ 300 H | «600 “ 6001 a y= LIẢ14x «31673 2 y =0.9415x + 107.88 & 400 RỶ=0.9388 E400 RÌ =0.9003 ã Š 200 ầ Z 200 4 0 9 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000 Cải- GC (ppb) Nho- GC (ppb)
Hình 12 So sánh mức độ tương đông giữa phương pháp GC và ELISA
10 Bảo quản các thành phần của bộ kit
Để tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng, các thành phần của bộ kit déu phải được cung cấp dưới dạng chuẩn bị sẵn, có thể dùng ngay được Trong đó bao gồm kháng
thể phũ sẵn trên giếng, cộng hợp pha sẩn ở nỗng độ cân thiết, chuẩn pha sẵn, cơ chất cũng chuẩn bị sẵn sàng Muốn vậy các thành phần trên đều phải có độ ổn định trong một thời
gian hợp lý
28
Trang 33
Bảo quân kháng thể
Để bảo quần kháng thể và tăng tính tiện lợi trong việc kiểm mẫu, kháng thể sau khi
đã được phủ lên các giếng được làm khô theo hai cách: sấy khô tại 37°C và đông khô
Kháng thể sau khi sấy khô tại 372C vẫn cho đường chuẩn không đổi nhưng cần một lượng cộng hợp có nổng độ gấp 10 lần so với kháng thể tươi
Kháng thể sau khi phủ xong đem đông khô ngay kết quá cũng tương tự Riêng kháng thể sau khi phủ được ủ trong dung dịch đông khô có 1% lactose, 1% saccharose và 1% BSA trong 2h, sau đó đổ dung dịch trên ra vàđem đông khô thì cho kết quả hầu như không
khác gì mấy so với kháng thể tươi Thử thay BSA bằng các protein khác là gelatin, casein vào dung địch đông khô thì màu của các giếng giảm đi nhiễu, do đó cho dén nay BSA 1a tựa chọn tốt nhất để pha dung dịch đông khô kháng thể
Kháng thể sau khi đông khô hoặc sấy khô đều có thể bảo quản rat dé dang và hầu như không thay đổi hoạt tính và sau 1 tuần bảo quản ở 372C Hiện nay các mẫu khẩng thể
đông khô bảo quản tại nhiệt độ phòng hay nhiệt độ lạnh 4°C được 1 năm nhưng vẫn không
thay đối hoạt tính
Bảo quân cộng hợp
Để thử nghiệm độ ổn định, cộng hợp đã được pha trong dung dịch đệm PBS và có thêm một số thành phân khác, được bảo quản tại các điều kiện sau: 4°C, nhiệt độ phòng
(25 - 30°C) va 37°C sau đó theo dõi biến đổi hoạt tính của cộng hợp theo thời gian bằng
cách so sánh với cộng hợp được pha mới từ cộng hợp gốc đậm đặc 300.000 lần Các thông số dùng để so sánh là OD max và [C50
Theo các tài liệu đã công bố việc cho thêm một số protein như fish gelatin, gelatin,
casein, BSA khoảng từ 0.5 đến 1% giúp cho dung dịch cộng hợp ổn định hoạt tính lâu hơn Ngoài ra một số chất khác như glycin, polypropylen, CaC1; cũng được thử nghiệm nhưng không xác định được bất cứ tác động tốt nào từ những chất này Qua thử nghiệm fish gelatin với nỗng độ 0.5% giúp ổn định hoạt tính cộng hợp khá tốt so với những protein còn
lại tuy nhiên vẫn chưa đủ để báo quần cộng hợp 1 cách lầu dài Cộng hợp pha sấn ở dung
dich này mất hoạt tính hoàn toần sau 1 tuân tại 37°C còn tại 4°C sau 8 tháng hoạt tính
cộng hợp giảm còn <50% so với cộng hợp pha mới từ cộng hợp gốc
Với dự đoán TMB trong vai trò là cơ chất của enzyme HRP nên sẽ có tương tác với trung tâm hoạt tính của enzyme nay va có thể sẽ giúp tăng độ ổn định của ezyme nên
dung dịch đệm pha cộng hợp có 0.5% fish gelatin dude thử nghiệm cho thêm TMB với
nỗng độ từ 0.01 đến 0.1% Kết quả thu được cho thấy chỉ một lượng nhỏ TMB có mặt
trong dung dịch đệm đã làm cộng hợp đã pha loãng tăng đáng kể thời hạn bảo quản Sau
gần 12 tháng được bảo quần tại nhiệt độ 4°C dung dịch cộng hợp trên vẫn giữ được 87%
ODmax Ngoài ra các kết quả thí nghiệm cũng cho thấy mặc dù ODmax có thể có những
thay đổi lớn nhưng IC50 và đường chuẩn nói chung hầu như không bị ảnh hưởng, với ODmax từ 0.5 đến 2.5 những thay đổi của IC50 hầu như thuộc phạm vĩ sai số của bản thân
phương pháp (Hình 13) Vì lẽ đó nếu OD max của cộng hợp có thể giảm chút đỉnh trong
thời gian bảo quần cũng sẽ không ảnh hưởng đến kết quả của phép đo Tuy nhiên kinh nghiệm thực tế cho thấy ODmax trong khoảng 0.8 đến 1.5 là thích hợp nhất cho việc bán
Trang 34định lượng bằng mắt thường do đó OD max cần phải được giữ trong khoảng này trong quá trình bảo quần 20 _—— 20 , + opmax/PBS+FG 30 | Pee SRG = -@ -ODmaxPBSHFG-TMB | — — PBS10.5%PG+0,01%TMB, 1s = ae = 1C50/PBS+FG+TMB (C50/PBSSEG Laos pao g ; a ; ` & 2 10 3 3 ° a 3 2 = 05 5 00 +— 1 + 08 ớ 1 2 3 4 o 2 4 6 8 10 12 183
Số tuần bảo quản tại 37°C ++ $6 thing bảo quản tại ŒC
Hình 13 Tóm tắt kết quả thử nghiệm tăng độ ổn định của cộng hợp
Ngoài ra cộng hợp cũng đã được thử nghiệm cho đông khô như sau: pha các dung
dịch cộng hợp đậm đặc 1000 lần (so với néng độ yêu cầu khi sử dụng bộ kiD trong các
dung dịch đông khô có chứa BSA hoặc gelatin ở các nêng độ khác nhau, từ 2-10%, sau đó đem đông khô So sánh với dung dịch đông khô là PBS thì việc cho thêm các protein có
tác dụng tốt hơn hẳn Trong khi cộng hợp pha trong PBS bị mất hoạt tính hoàn toàn sau khi
đông khô thì các dung địch đệm có thêm các protein giúp cộng hợp chỉ mất 1/10 hoạt tính enzyme Thử nghiệm cho thêm các phụ gia khác như TMB, lactose, saccharose, glycin
tuy nhiên đến nay kết quả tốt nhất đạt được vẫn như trên Như vậy nếu sử dụng việc đông khô cộng hợp thì cẩn ¡ lượng cộng hợp gấp 10 lần để bù lại việc mất hoạt tính sau khi đông khô
Như vậy cộng hợp có thể bảo quản bằng việc đông khô hoặc chọn thành phần pha
đệm thích hợp Hai biện pháp trên đều bảo đâm giữ được cộng hợp ổn định từ 1 năm trở
lên
Độ ổn định của chất chuẩn
Chuẩn endosulfan Ippb, 3ppb và 10ppb pha trong 10% methanol có thêm 0.01% merthiolate đã được kiểm tra độ ổn định tại các nhiệt độ sau 4°C, -20°C va nhiét độ
phòng Cứ sau 2 tuần các mẫu được lấy một lượng cố định, trích lỏng — lồng trong hexan, thổi khô hòa cặn trong Imi dung môi để tiêm vào sắc ký khí và so sánh với chuẩn nồng độ tương đương mới được pha từ chuẩn gốc 100ppm bảo quản trong methanol ở -20°C Kết quả cho thấy chuẩn endosulfan tổ ra khá bẻn, riêng kết quả của dung địch chuẩn tại nhiệt độ phòng không rõ ràng còn lại dung dịch chuẩn bảo quản tai 4°C, -20°C cho kết quá không đổi sau 12 tháng
Trang 35Độ ổn định của cơ chất
Sử dụng urea hydrogen peroxide theo tài liệu Singh (2004) thay thể HO; giúp hỗn
hợp cơ chất rất bền khi bảo quản tại 4°C Qua thử nghiệm cho thấy hỗn hợp cơ chất này ẩn
định trong 12 tháng tại nhiệt độ trên
11 Kết quả thử nghiệm kiểm tra trên mẫu thực
Sau khi quy trình sử dụng của bộ kit đã được khảo sát cho kết quả tốt, các bộ kiL
thử nghiệm đã được Phân viện Cơ Điện NN và CNSTH hợp tác với 2 đơn vị để kiểm tra trên mẫu rau quả thực tế là: Chi cục bảo vệ thực vật TPHCM và Đại học Nông Lâm
Kết quả kiểm tra mẫu rau
„ Chỉ Cục Bảo Vệ Thực Vật TPHCM do chưa từng có kinh nghiệm thực hành phương
pháp ELISA nên đã được Phân viện hướng dẫn cách sử dụng bộ kit và thực hành trong 2
ngày Sau đó Chỉ Cục đã được chuyển giao các bộ kít ELISA để kiểm tra 50 mẫu rau do
Chỉ Cục thu thập trên thị trường Kết quả ELISA từ 50 mẫu rau là phát hiện 2 dương tính
và 48 mẫu âm tính 1/10 số mẫu rau từ tập hợp mẫu trên đã được gửi đến TT Kiểm Định Thuốc BVTV Phía Nam để kiểm tra lại bằng sắc ký khí Kết quả thu được như sau:
Bắng 3 Kết quả so sánh mẫu rau kiểm tra bằng 2 phương pháp
STT Tên mẫu Endosulfan (ppm) GC ELISA 1 Khổ qua 0.50 0.40 3 Củcảitrắng 0.13 0.40 3 Raudếển KPH Am tinh 4 Rau muống KPH Am tinh 5 Bi dao KPH Am tinh Ghi chú: các mẫu ELISA có nông độ dưới điểm chuẩn thấp nhất là Ippb được gọi là âm tinh KPH: không phát hiện
Qua đối chiếu thì tất cá các mẫu âm dính với ELISA đều không phát hiện có
endosulfan và các mẫu dương tính thì phát hiện có endosulfan bằng phương pháp sắc ký khí Như đã phân tích ở trên khả năng định tượng của ELISA không thể chính xác bằng
sắc ký khí nên chuyện có sự khác biệt giữa kết quả GC va ELISA 1a diéu có thể dự đoán trước được Ngoài ra có thể mẫu có nhiễm endosulfan sulfate một dẫn xuất rất phổ biến của endosutfan trong môi trường mà khi phân tích bằng GC không chú ý kiểm tra thành phần này nên kết quả của ELISA cao hon GC nhiều vì ELIS®% có độ nhạy rất cao với
endosulfan sulfate
Kết quả kiểm tra mẫu quả
TT Phân Tích thuộc Đại Học Nông Lâm đã có kinh nghiệm phân tích bằng ELISA
cũng như sắc ký khí nên đã thực hiện đông thời 2 phương pháp Do endosulfan đã từng
Trang 36được sử dụng rất nhiều trên nho ở vùng trồng nho Ninh Thuận -Việt Nam, Phân viện đã thu thập 50 mẫu nho Việt Nam trên thị trường để kiểm tra trước bằng bộ kit ELISA sau đó 1/10 số mẫu sẽ được gửi lên Đại học Nông Lâm kiểm tra lại bằng bộ kit ELISA và sắc ký khí Kết quả: trong số 50 mẫu nho mà Phân viện thu thập ngoài thị trường không có mẫu
ELISA dương tính và sau đó Đại Học Nông Lâm đã kiểm tra lại 6/50 mẫu nho trên bằng 2 phương pháp cũng cho kết quả như trên (âm tính đối với endosulfan)
Tổng kết kết quả kiểm tra trên mẫu thực:
Như vậy bộ kit ELISA do Phân viện CĐNN&CNSTH đã được sử dụng để Phân
viện, Chỉ Cục BVTV và Đại Học Nông Lâm kiểm tra 100 mẫu thực bao gồm rau quả các loại 1⁄10 số mẫu trên gầm 2 mẫu dương tính và 9 mẫu âm tính đã được kiểm tra lại bằng sắc ký khí đã cho kết quá tương đồng khá tốt với ELISA (Xem chỉ tiết trong phần phụ
lục)
Trang 37Y KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Thuốc trừ sâu gốc cyclodiene thuộc họ clo hữu cơ, ngoại trừ endosulfan mới bị cấm từ cuối năm 2005, các thuốc còn lại như endrin, dieldrin, aldrin, heptachlor đều đã bị cấm sử dụng ở nước ta từ lâu Nhưng do độ bên của loại thuốc này cộng với việc kiểm soát của nhà nước cũng như ý thức của người nông dần trong việc sử dụng thuốc chưa
được cao nên nguy cơ tổn dư các thuốc trên trong môi trường và nông sản vẫn chưa hoàn
toàn triệt tiêu ngay được Chính vì vậy Phân viện Cơ Điện NN và Công Nghệ Sau Thu
Hoạch kết hợp với TT Ứng Dụng Dịch Vụ KHKT, đại học Nông Lâm và Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật TPHCM đã nghiên cứu chế tạo bộ kit ELISA phát hiện nhanh nhóm thuốc trừ
sâu này trên các mẫu rau quả
Hai thành phần chính cho một bộ kit ELISA cạnh tranh sẽ bao gồm kháng thể và
cộng hợp giữa một hapten đại diện và một enzyme/protein Dựa trên tài liệu khoa học đã công bố (Lee 1995, 1997 và Brummel 1997) hai hapten được lựa chọn cho việc phát triển
bộ kít đã được tổng hợp thành công và cấu trúc của chúng đã được kiểm tra bằng phổ
cộng hưởng từ hạt nhân là Hapten ÏI: 4-oxobutanoid acid, (4-(4,5,6,7,8,8-hexachloro-
3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-methano- 1 H-indenyl-1-oxy) và Hapten IV: 6-(1,4,5,6,7,7-
Hexachlorobicyclo [2.2.1 ]-heptane-2,3b-succinimido) caproic acid Các hapten trên đã
được ester hóa để tạo ra các succinimidyÌ ester dễ dàng gắn được lên các protein Kháng thể được gây miễn dịch trên thỏ bởi cộng hợp HaptenII-KLH đã cho kết quả tốt Ngoài độ
nhạy cao đổi với endosulfan và endosulfan sulfate, kháng thể có thể nhận biết được endrin, dieldrin, aldrin, heptachlor va chlordan Để phát triển bộ kit hai phương thức ELISA cạnh tranh: gián tiếp và trực tiếp đã được khảo sát, trong đó ELISA cạnh tranh trực tiếp đã cho độ nhạy cao hơn nên đã được sử dung cho bộ kit BG kit đã cho IC50 là 1.0 + 0.5 ppb đối với endosulfan là một độ nhạy rất tốt hoàn toàn có khảẩ năng ứng dụng để
kiểm tra các mẫu
Tất cả các yếu tố chính gồm độ pH, dung môi, các ion và đặc biệt là ảnh hưởng của nên mẫu đã được khảo sát để xây dựng một quy trình kiểm mẫu rất đơn giản và có độ chính xác chấp nhận được Trong đó mẫu chỉ cần trích trong methanol, pha loãng 1⁄20 lần với methanol 10% là có thể phân tích Do tại những néng độ <ICSO sai số do ảnh hưởng chất nền khá lớn nên bộ kit xây dựng khoảng xác định với các điểm chuẩn từ 1.0 đến
10ppb cho endosulfan
Bo kit 44 được kiểm tra độ thu hổi đối với các mẫu rau và quả sau: rau muống, cải
xanh, bắp cải, đậu cô ve, cà chua, khoai tây, cà rốt, lê, táo, mận và nho Kết quả độ thu
hồi của những mẫu gây nhiễm nhân tạo đạt từ 87% đến 128% So sánh với một số kết quả từ sắc ký khí trên mẩu nhiễm nhân tạo cho thấy mac di ELISA khong đạt độ chính xác và độ lặp lại cao như sắc ký khí nhưng vẫn có sự tương, đồng khá tốt giữa 2 phương pháp
Để tạo thuận lợi cho việc sử dụng, bộ kit ELISA sẽ được cung cấp dưới dạng đã
được chuẩn bị sẵn Các thành phần của bộ kit gầm giếng phủ kháng thể đông khô, cộng
hợp enzyme pha sấn ở nồng độ sử dụng, các chuẩn endosulfan Ippb, 3ppb và 10ppb, cơ
chất 2 thành phần và dịch hãm đều đã được thử nghiệm để giữ hoạt tính ổn định trong quá trình bảo quản Kết quả bộ kỉt có thể bảo quản được tối thiểu 1 năm tại 4°C
33
Trang 38
Bộ kit đã được dùng thử nghiệm để kiểm tra trên 100 mẫu rau và quả được thu thập
trên thị trường và chỉ phát hiện có 2 mẫu rau dương tính Từ kết quả ELISA chọn ra
khoảng 1/10 số mẫu (trong đó có 2 mẫu rau đương tính) kiểm tra lại bằng sắc ký khí Kết qua là tất cả những mẫu âm tính với ELISA thì đều không phát hiện thấy endosulfan vàmẫu ELISA đương tính thì có thấy endosulfan Tuy kết quả phân tích định lượng 2 mẫu
dương tính này khơng hồn toàn trùng khớp nhau giữa hai phương pháp nhưng từ kết quả
trên cũng cho thấy bộ kit ELISA đã giúp phân tích sàng lọc rất tốt các mẫu và rõ rằng có sự tương đồng giữa ELISA và phương pháp chuẩn là sắc ký khí Trong quá trình chuyển
giao cho các đơn vị kiểm tra trên mẫu thực, bộ kit ELISA cũng đã được nhận xét rất tốt từ
một đơn vị chưa từng có kinh nghiệm về ELISA là Chí Cục Bảo Vệ Thực Vật TPHCM về
kha năng phát hiện cũng như tính đơn giản dễ sử dụng của nó
Tổng kết từ tất cả các kết quả đã thu được cho thấy, bộ kit ELISA phát hiện nhóm
thuốc trừ sâu gốc cyclodiene đã được chế tạo thành cơng và hồn tồn có thể ứng dụng trên thực tế để kiểm tra các mẫu rau quả Ngoài ra do khả năng tổn tại khá lâu trong môi trường của các thuốc trừ sâu họ clo hữu cơ, nên bộ kít sẽ rất hữu ích nếu dùng cho công tác kiểm tra các mẫu môi trường là đất và nước Để làm điều này chỉ cẩn đầu tư thêm một số ít khảo sát thử nghiệm trên mẫu đất và nước do bản chất hai loại mẫu này không phức tạp so với mẫu rau quả và các tài liệu đo Lec công, bố năm 1995 và 1997 cũng cho thấy khả năng ứng dụng rất tốt của bộ kít trên 2 loại mẫu này Do tính chất đơn giản dễ sử dụng và cho kết quả nhanh thích hợp cho công tác điểu tra, kiểm soát, chúng tôi để nghị
Sở Khoa Học và Công Nghệ TPHCM sẽ đứng ra giới thiệu rộng rãi để bộ kit sớm được
đưa vào ứng dụng tại các đơn vị kiểm tra an toàn thực phẩm và kiểm soát chất lượng môi
trường ví dụ các Chỉ cục Báo Vệ Thực Vật, các TT Y Tế Dự Phòng, các TT Môi Trường,
VV
Trang 39TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 1, 13 14 AOAC International Official Methods of Analysis (1995) 18" ed.; Arlington, VA,; Section 970.52
Brummel, K.E., Wright, J., Edelfrawi, M E (1997) Fiber optic biosensor for cyclodiene Insecticides J Agric Food Chem.45: 3292-3298
Dankwardt, A B., Hock, (1997) Enzyme immunoassays for the analysis of pesticides
in water and food, J Food Technol Biotechnol 35: 165-174
Deshpande, S.S (1996) Enzyme immunoassays: from concept to product development Publisher New York : Chapman & Hall
Dreher R.M and Podratzki B (1988) Development of an enzyme immunoassay for endosulfan and its degradation products, J Agric Food Chem, 36: 1072 — 1075
Harlow Ed, Lane D (1999) Using antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laborarory Press, Cold Spring Harbor, New York
Hammock, B.D., Gee, S.J Cheng, P.Y.K., Miyamoto, T., Goodrow, M.H and
Seiber, J.N (1986) Utility of Immunoassay in pesticide trace analysis In: The Sixth International Congress of Pesticide Chemistry Proceedings, Ottawa, Canada 11-15 August, 309 - 316
Harison, R O., Goodrow, M.H., Gee, S.J., Hammock, B.D (1991) Hapten synthesis for pesticide immunoassay development Immunoassay for trace chemical analysis
451, American Chemical Society, Washington DC, USA, 14-27
Hermanson, G (1996) Bioconjugate Techniques Academic Press ISBN: 0-12- 342336-8
Hennion M.C and Barcelo D (1998) Strengths and limitations of immunoassays for effective and efficient use for pesticide analysis in water samples: A review
Analytica Chimica Acta 362, 1: 3-34
Hock, B., Dankwardt A., Kramer K., Marx, A (1995) Immunochemical techniques: antibody production for pesticide analysis A review, Analytica Chimica Acta 311,
393-405
Ibrahim, A.M.A., Ragab, A.A., Hewedi M.M and Smith C.J (1995) Development of an indirect competitive ELISA for aldrinédieldrin in human milk samples collected in Egypt Food & Agricultural Immunology.7: 3-8
Lee, N., Skerrit, J H and McAdam, D P (1995) Hapten synthesis and
development of ELISA for detection of endosulfan in water and soil J Agric Food Chem 43: 1730 - 1739
Lee, N., Beasley H.L, Kimber S W L et al (1997) Application of immunoassay to studies of the environmental fate of endosulfan 3 Agric Food Chem 45: 4147 —
Trang 4018 20 21 22 23 24 25 2%
Manclus JJ, Abad A, Lebedev MY, Mojarrad F, Mickova B, Mercader JV, Primo J,
Miranda MA, Montoya A (2004) Development of a monoclonal immunoassay selective for chlorinated cyclodiene insecticides ] Agric Food Chem 2004 May 19; 52(10):2776-84
Nunes G S., Toscano I A., Barceli D (1998) Analysis of pesticides in food and
environmental samples by enzyme-linked immunosorbent assays TrAC Trends in Analytical Chemistry, 17, 2: 79-87
Stanker, L.H., Watkins, B-E and Vanderlaan, M (1988) Environmental monitoring
by immunoassay Environmental Science and Technology 22: 387 — 407
Singh SB, Kulshrestha G (2004) Determination of endosulfan residues in eggplant (Solanum melongena) by ELISA J Environ Sci Health B 39(3):411-8
Smith, C.J., Ibrahim A.M.A and Hewedi MLM (1994) Detection of aldrin/dieldrin in milk by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Food &
Agricultural Immunology.6: 385-393
The Pesticide Manual: A World Compendium (1997) 11” ed.; Tomlin, C D S., Ed.;
The British Crop Protection Council: Farnham, Surrey, U.K
‘Thier, H.P; Kirchhoff, J (1979) Manual of pesticide analysis Deutshe Forchungs- gemeinschaft Pesticide Comission
Tijssen, P (1985) Practice and Theory of Enzyme Immunoassays Elsevier Science
Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands
Torres CM, Pico Y, Manes J.(1996) Determination of pesticide residues in fruit and vegetables J Chromatogr Ana 754(1-2): 301-31
Vũ Triệu Mân, Hà Viết Cường, Ngô Bích Hảo, Trần Thị Như Hoa, và ctv Nghiên cứa sản xuất kháng huyết thanh va kit ELISA chuẩn đoán một số bệnh virus hại thực
vật ở Việt Nam— Hội thảo quốc gia bệnh cây và sinh học phân tử- ĐH Nông nghiệp 1 Hà nội, 23-25/10/2003
Wang S, Zhang J, Yang Z, Wang J, Zhang Y (2005) Development of two enzyme-
linked immunosorbent assays for detection of endosulfan residues in agricultural products J Agric Food Chem.;53(19):7377-84