Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN MINH GIANG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành: Hồi sức cấp cứu chống độc Mã số: 62720122 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa đƣợc công bố nơi Tác giả luận án Trần Minh Giang MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Bảng từ viết tắt đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ, sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Định nghĩa 1.2 Tỉ lệ mắc viêm phổi thở máy .5 1.3 Tỉ lệ tử vong .6 1.4 Bệnh nguyên .8 1.5 Các yếu tố nguy 25 1.6 Chẩn đoán .28 1.7 Thực kháng sinh đồ vi khuẩn phân lập đƣợc từ VPTM 29 1.8 Ứng dụng sinh học phân tử phát gene kháng thuốc 30 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thiết kế nghiên cứu 32 2.2 Địa điểm nghiên cứu 32 2.3 Thời gian nghiên cứu .32 2.4 Đối tƣợng nghiên cứu .32 2.5 Cỡ mẫu cơng thức tính cỡ mẫu 32 2.6 Tiêu chuẩn chọn mẫu .33 2.7 Phƣơng pháp tiến hành .34 2.9 Thu thập số liệu phân tích liệu .45 2.10 Đạo đức nghiên cứu 46 2.11 Liệt kê định nghĩa biến số 46 2.12 Sơ đồ nghiên cứu 47 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Đặc điểm chung 48 3.2 Định danh vi khuẩn dựa vi sinh kinh điển 50 3.3 Định danh vi khuẩn dựa giải trình tự gene 16S-rRNA .51 3.4 Tổng số loài vi khuẩn phát đƣợc mẫu dịch rửa phế quản phế nang 55 3.5 So sánh giải trình tự gene 16S-rRNA vi sinh kinh điển định danh vi khuẩn 56 3.6 Thời gian nằm ICU tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy 59 3.7 Kết kháng sinh đồ 60 3.8 Kết kháng sinh đồ MIC dựa E-test 66 3.9 Kết PCR tìm gene kháng thuốc 73 3.10 Kết điều trị .75 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 76 4.1 Định danh vi khuẩn 77 4.2 Kết kháng sinh đồ 91 4.3 Xác định gene kháng thuốc mối liên quan với đề kháng kháng sinh 99 KẾT LUẬN 105 KIẾN NGHỊ 108 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BẢNG VIẾT TẮT VÀ ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt APACHE Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Thang điểm lƣợng giá bệnh lý cấp tính mạn tính ARDS Acute Respiratory Distress Hội chứng nguy ngập hô hấp ATS BA BAL Syndrome American Thoracic Society Blood agar Bronchial-alveolar lavage cấp Hội Lồng Ngực Hoa Kỳ Đĩa thạch máu Rửa phế quản phế nang BN Bp BVCR BVNDGĐ Base pair Bệnh nhân Cặp base Bệnh viện Chợ Rẫy Bệnh viện Nhân Dân Gia Định CAHI Chocolate agar Haemophilus influenzae Thạch chocolate cho Haemophilus influenzae CDC Centers for Disease Control and Prevention Colony-Forming Unit Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ Đơn vị tạo khuẩn lạc CMV COPD Cytomegalovirus Chronic Obstructive Pulmonary Disease Virus cytomegalovirus Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính CPIS Clinical pulmonary infection score CRP DRPQPN EBM EPIC C - reactive protein Thang điểm viêm phổi lâm sàng Protein C phản ứng Dịch rửa phế quản phế nang Thạch eosin methylene blue Tỉ lệ mắc nhiễm khuẩn ICU bệnh nhân Châu Âu ESBL Extended-Spectrum BetaLactamase CFU Eosin methylene blue agar The European Prevalence of Infection in Intensive Care Men β-lactamase phổ rộng Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt FiO2 Fraction of inspired oxygene Phân suất oxy khí thở vào HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn ICU Intensive care unit dịch ngƣời Khoa săn sóc đặc biệt IDSA Infectious Diseases Society of Hội bệnh lý truyền nhiễm America Hoa Kỳ Interquartile range Infection-related ventilator associated complication Khoảng tứ phân vị Biến chứng liên quan nhiễm khuẩn bệnh nhân thở Kligler iron agar máy Thạch kligler iron Confidence interval MacKonkey agar Kháng sinh đồ Khoảng tin cậy Thạch MacKonkey IQR IVAC KIA KSĐ KTC MA Mueller Hinton agar Minimal inhibitory concentration Medical intensive care unit Methycillin-Resistant Staphylococcus aureus Methycillin-Sensitive Staphylococcus aureus Thạch Mueller Hinton Nồng độ ức chế tối thiểu Khoa ICU nội Tụ cầu vàng kháng methycillin Tụ cầu vàng nhạy methycillin Nghiên cứu NCBI National center for biotechnology information NGS NKQ NNIS Next generation sequencing Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ Giải trình tự hệ Nội khí quản Hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ MH MIC MICU MRSA MSSA NC National Nosocomial Infections Surveillance System Nội soi phế quản Ngƣng tim ngƣng thở NSPQ NTNT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt OR Odds ratio Tỉ số số chênh PCT PEEP PGM Procalcitonin Positive end-expiratory pressure Personal genome machine Procalcitonin Áp lực dƣơng cuối thở Máy gene cá thể PK/PD pharmacokinetic/pharmacodynamic Dƣợc động/dƣợc lực Possible possible ventilator - associated Có thể viêm phổi thở máy VAP PPI pneumonia Proton pump inhibitors Ức chế bơm proton Probable VAP PSB Probable ventilator - associated pneumonia Protected Specimen Brush Có thể có khả viêm phổi thở máy Chải phế quản có nịng bảo vệ RR SaO2 Risk ratio Arterial oxygene Saturation Tỉ số nguy Độ bảo hòa oxy động mạch SICU SpO2 Surgical intensive care unit Pulse oximetric saturation Khoa hồi sức ngoại Độ bão hòa oxy theo mạch đập SSĐB TBMMN Săn sóc đặc biệt Tai biến mạch máu não THA T0 VAC Tăng huyết áp Nhiệt độ Biến chứng liên quan thở VAE VK VP VPTM Ventilator - associated condition Ventilator-associated event máy Biến cố liên quan thở máy Vi khuẩn Viêm phổi Viêm phổi thở máy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban đầu:…………………………….7 Bảng 1.2 Bệnh nguyên viêm phổi thở máy:……………………………………8 Bảng 1.3 Tần suất vi khuẩn phân lập đƣợc từ ICU bệnh viện Fatmawati:……… 11 Bảng 1.4 Tần suất vi khuẩn phân lập đƣợc từ bệnh nhân viêm phổi khoa ICU Việt Nam:…………………………………………………………… 12 Bảng 1.5.1 Tác nhân vi khuẩn phân lập đƣợc từ bệnh nhân thở máy ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh:……………………… 13 Bảng 1.5.2 Tác nhân vi khuẩn phân lập đƣợc từ bệnh nhân thở máy ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh (tiếp theo):…………… 14 Bảng 1.6 Tính đa dạng vi khuẩn phát đƣợc giải trình tự gene:…….25 Bảng 1.7 Các yếu tố nguy VPTM:……………………………………… 26 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tạo amplicon - phản ứng tạo “bản sao” vùng V3, V6, V7 V9 gen 16S-rRNA:………………………………38 Bảng 2.2 Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa việc tinh phản ứng PCR khuếch đại vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA:… 39 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh - tạo “đầu bằng” cho vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA:……………… 40 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng tạo “thƣ viện” - phản ứng gắn Adapter trP1 vào đầu “đầu bằng” vùng V3, V6, V7 V9 gene 16SrRNA:……………………………………………………………………… 40 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo “bản sao” thƣ viện:………….………41 Bảng 2.6 Thành phần dung dịch sử dụng cho việc gắn “thƣ viện” gene vào hạt ISP:………………………………………………………………………… 42 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng chuẩn bị gắn “thƣ viện” gene vào hạt ISP:…… 43 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng tách mạch “thƣ viện” gene khỏi gắn hạt SP:….…………………………………………………………………… 43 Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu:……………………… 49 Bảng 3.2 Phân bố vi khuẩn phân lập đƣợc định danh truyền thống:……… 51 Bảng 3.3 So sánh hai phƣơng pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy giải trình tự hệ thống PGM:……………… ………………… 57 Bảng 3.4 Kết kháng sinh đồ khuếch tán chung:………………………………60 Bảng 3.5 Kháng sinh đồ khuếch tán Acinetobacter spp:………………….61 Bảng 3.6 Kháng sinh đồ khuếch tán Klebsiella spp:… .62 Bảng 3.7 Kháng sinh đồ khuếch tán Pseudomonas spp:………………….63 Bảng 3.8 Kết kháng sinh đồ MIC Acinetobacter baumannii:……… 66 Bảng 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC K Pneumoniae:………………… 67 Bảng 3.10 Kết kháng sinh đồ MIC Pseudomonas aeruginosa:………68 Bảng 3.11 Kết kháng sinh đồ MIC Escherichia coli:……………… 69 Bảng 3.12 Kết kháng sinh đồ MIC Burkholderia cepacia:………… 70 Bảng 3.13 Phân bố gene kháng thuốc phát đƣợc:……………………………73 Bảng 3.14 Mối liên quan gene kháng thuốc đề kháng kháng sinh:……….74 Bảng 3.15 Kết ngƣời bệnh khỏi khoa chung:………………………………75 Bảng 3.16 Kết điều trị:……………………………………………………… 75 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tạo thƣ viện cho kỹ thuật NGS:………………………….………38 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu:………………………………………………………47 Biểu đồ 3.1 Phân tích cụm 99 lồi vi khuẩn định danh giải trình tự 16SrRNA:………………………………………………………………………………53 Biểu đồ 3.2 Số loài vi khuẩn phát đƣợc mẫu DRPQPN: ………….55 Biểu đồ 3.3 Mối liên quan vi khuẩn phân lập đƣợc số ngày nằm ICU:… 59 Biểu đồ 3.4 Mạng lƣới đa kháng kháng sinh A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa: ……………………………………………………65 Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ số kháng sinh bị đề kháng:…………………………………… 72 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 26 VPTM đƣợc liệt kê Bảng 1.7 Trong NC cho thấy VP BN nằm hồi sức ngoại cao ICU nội với RR = 2,2 Sử dụng kháng sinh bệnh viện liên quan với gia tăng nguy VP bệnh viện [41], [42] Bảng 1.7 Các yếu tố nguy VPTM "Nguồn: Chastre, 2013" [42] Các yếu tố nguy độc lập VPTM Các yếu tố từ ngƣời bệnh Các yếu tố can thiệp Albumin huyết tƣơng < 22g/L Ƣc chế H2, kháng axít Tuổi ≥ 60 tuổi Thuốc dãn cơ, dùng an thần liên tục ARDS Truyền > đơn vị máu COPD, bệnh phổi Theo dõi liên tục áp lực nội sọ Hôn mê, rối loạn tri giác Thở máy > ngày Bỏng chấn thƣơng Cài PEEP Suy tạng Thay dây thở máy thƣờng xuyên Bệnh nặng Đặt lại nội khí quản Hít sặc Ni ăn qua ống mũi dày pH dịch dày Nằm ngửa Hiện diện VK hô hấp Di chuyển BN Viêm xoang Sử dụng kháng sinh trƣớc Mùa thu mùa đơng Để thiết lập yếu tố nguy cơ, nhà lâm sàng thực nhiều NC có thiết kế phù hợp nhiều quốc gia khác Nhƣ NC 320 BN kết cho thấy dùng kháng sinh trƣớc bốn yếu tố nguy độc lập gây VPTM, với suy tạng, tuổi > 60, nằm đầu thấp (< 300) [70] Kết tƣơng tự quan sát 250 BN xảy VPTM sớm (≤ 48 thở máy) xác định đƣợc yếu tố nguy VPTM nhƣ hồi sức tim phổi, dùng an thần liên tục dùng kháng sinh trƣớc có OR lần lƣợt 5,13, 4,4 0,29 Việc sử dụng kháng sinh trƣớc cho kết tƣơng tự gây chọn lọc số tác nhân gây VPTM Nhƣ NC đa trung tâm Canada cho thấy điều Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 27 trị kháng sinh trƣớc yếu tố bảo vệ chống lại VPTM [38] Tuy nhiên tƣợng khơng cịn hiệu tiếp tục dùng kháng sinh kéo dài tới tuần thứ Theo NC Fagon cộng 567 BN thở máy, kết cho thấy có tới 65% BN bị VPTM Pseudomonas Acinetobacter spp, so với 19% nhóm khơng có dùng kháng sinh trƣớc [41], [42] Độ pH dịch vị đƣợc xem yếu tố nguy cho VPTM Một phân tích dựa 153 BN ICU dùng kháng axít cimetidine, đếm tổng số khuẩn lạc dày tăng cao với VK Gram âm hiếu khí (p < 0,001) Khi dịch vị có pH < 2, dịch vị vô khuẩn tới 65%, nhƣng pH tăng lên dịch vị vơ khuẩn cịn 60% [41], [42] Một NC đa trung tâm, mù đơi, ngẫu nhiên có nhóm chứng so sánh sucralfate (1000mg giờ), ranitidine (50mg giờ) để phòng ngừa chảy máu đƣờng tiêu hóa giả dƣợc, 1.200 BN thở máy Kết cho thấy khơng có khác biệt xuất huyết tiêu hóa VPTM [39], [42] Đặt nội khí quản, đặt lại nội khí quản khai khí quản đƣợc cho yếu tố nguy VPTM Chính ống nội khí quản làm chế bảo vệ, gây chấn thƣơng viêm chỗ, tăng nguy hít VK hầu họng quanh bóng chèn Khi quan sát kính hiển vi điện tử 25 ống nội khí quản cho thấy 96% phát triển khuẩn lạc, 84% VK đƣợc bao phủ màng sinh học glycat hóa (biofilm or glycalyt) [41] Hút liên tục ngắt quãng dịch tiết vùng hầu họng giữ đủ áp lực bóng chèn phịng ngừa đƣợc VPTM [42] Trong NC 145 BN thở máy, nhóm BN đƣợc hút bóng chèn dƣới hai dây có tỉ lệ VPTM dƣới 13% so với 29% nhóm chứng (p < 0,05), ngày khởi phát VPTM 16,2 so với 8,3 ngày Sự diện ống nội khí quản, đặt lại nội khí quản yếu tố nguy cho VPTM [41] Tƣ nằm BN ảnh hƣởng đến tỉ lệ gây VPTM Trong NC ngẫu nhiên có nhóm chứng 86 BN thở máy đƣợc chia làm hai nhóm: nằm đầu tƣ đầu cao > 30o Kết thúc NC sớm dự kiến phân tích thấy tỉ lệ VPTM giảm đáng kể nhóm nằm đầu cao [41] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 28 Chính dụng cụ hơ hấp nguồn lây đáng kể cho VPTM Hút đàm kín hở, tỉ lệ VPTM lần lƣợt 7,3% so với 15,9%, p = 0,007 [37] Máy thở, dây máy thở, bình làm ẩm lọc khí nguồn lây nhiễm gây VPTM Kết NC BN dùng lọc có chức làm ẩm khí hít vào cho thấy giảm đáng kể VPTM so với hệ thống làm ẩm cổ điển [42] Di chuyển BN khỏi khoa ICU yếu tố nguy độc lập VPTM (OR = 3,8, p < 0,001) [64] 1.6 Chẩn đoán Theo khuyến cáo hiệp hội bệnh lý truyền nhiễm Hoa Kỳ Hội Lồng Ngực Hoa Kỳ 2016 Việc chẩn đoán VPTM lâm sàng tiếp tục nhƣ theo hƣớng dẫn năm 2005 hiệp hội Tức chẩn đoán BN nghi ngờ VPTM dựa vào bệnh cảnh lâm sàng Các tiêu chuẩn bao gồm thâm nhiễm phổi xuất kèm theo chứng lâm sàng Thâm nhiễm phổi có nguồn gốc từ phổi gồm có khởi phát sốt, khởi phát tiết đàm mủ, khởi phát tăng bạch cầu máu khởi phát giảm oxy hóa máu BN thở máy sau 48 Chẩn đoán BN nghi ngờ VPTM dựa vào lâm sàng không kết hợp với CRP, PCT sTREM-1 dạng hịa tan [61] Một cách điển hình, nghi ngờ VPTM BN có thâm nhiễm mới, tiến triển X-quang ngực kèm dấu hiệu gợi ý nhiễm khuẩn nhƣ sốt, đàm mủ, tăng bạch cầu máu, tăng thơng khí và/hoặc giảm oxy hóa máu động mạch [42] Khi áp dụng nội soi ống mềm có nịng bảo vệ (PSB) với cấy đàm định lƣợng làm tiêu chuẩn vàng để so sánh Một NC 84 BN đƣợc chẩn đoán VPTM dựa vào lâm sàng, X-quang ngực xét nghiệm sinh hóa khác Chỉ có 27 BN có VPTM thật giá trị tiên đốn xác 62% Giá trị trung bình nhiệt độ, tăng bạch cầu máu, PaO2/FiO2 thang điểm X-quang ngực khơng có khác biệt hai nhóm [49] Một NC sau dựa mơ hình tƣơng tự, chẩn đoán VPTM dựa vào thâm nhiễm phổi tồn kéo dài kèm theo hai ba tiêu chuẩn sau: To > 38,3o C, bạch cầu > 12.000/mm3, tăng tiết đàm mủ Kết độ nhạy độ đặc hiệu 69% 75% Chỉ dựa vào lâm sàng, chẩn đốn VPTM có âm tính giả 30 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 29 - 35%, dƣơng tính giả 20 - 25% Thậm chí chẩn đoán VPTM dựa vào lâm sàng, nhuộm Gram cấy đàm qua hút khí quản cho kết khơng xác, dẫn đến lạm dụng kháng sinh [41] Để hạn chế việc sử dụng kháng sinh mạnh, phổ rộng không cần thiết, bác sĩ lâm sàng thƣờng phải dựa vào kết nuôi cấy vi sinh kháng sinh đồ 1.7 Thực kháng sinh đồ vi khuẩn phân lập đƣợc từ VPTM 1.7.1 Kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy có tẩm kháng sinh Hiện nay, phƣơng pháp kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy có tẩm kháng sinh nồng độ định đƣợc áp dụng rộng rãi Phƣơng pháp dễ thực hiện, rẻ tiền Đây phƣơng pháp định tính, khơng cho biết xác VK phân lập đƣợc kháng với kháng sinh dự định điều trị nồng độ Đồng thời không cho biết liều lƣợng cách dùng kháng sinh thực có hiệu BN hay không [21] 1.7.2 Thực kháng sinh đồ xác định MIC Kỹ thuật định lƣợng đo nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) VK một, cho nồng độ định kháng sinh Kết cho biết xác độ nhạy cảm kháng sinh VK Phƣơng pháp MIC giúp điều chỉnh liều kháng sinh dự định điều trị nồng độ bao nhiêu, nhƣ cách sử dụng kháng sinh cho BN [21] Thông qua MIC, nhà vi sinh lâm sàng xác định đƣợc FIC Từ đó, giúp cho bác sĩ lâm sàng chọn lựa phối hợp kháng sinh cho thích hợp hiệu việc điều trị VPTM Với kết MIC, bác sĩ điều trị tiên đốn đƣợc hiệu kháng sinh mà điều trị BN Theo khuyến cáo cách so sánh nồng độ hữu dụng kháng sinh đạt đƣợc dịch thể BN (đƣợc gọi điểm gãy PK/PD) với MIC kháng sinh VK Nếu điểm gãy PK/PD hay cao MIC VK nhạy với kháng sinh điều trị kháng sinh hiệu Nếu điểm gãy PK/PD thấp MIC VK đề kháng với kháng sinh thất bại điều trị Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 30 Ngồi ra, dựa vào kết MIC bác sĩ điều chỉnh liều cách cho kháng sinh cho BN nhằm đƣa điểm gãy PK/PD kháng sinh lên hay cao MIC kháng sinh VK để đạt đƣợc hiệu điều trị [21] Hiện việc thực thí nghiệm kháng sinh đồ theo phƣơng pháp tìm MIC trở nên dễ dàng phịng thí nghiệm đƣợc cung cấp que thử E-test phƣơng tiện làm MIC phƣơng pháp vi pha loãng [21] Que thử E-test loại giá cứng có tẩm kháng sinh nồng độ từ cao đến thấp que có ghi số cho phép đọc kết MIC dựa vào điểm dừng vịng vơ khuẩn vị trí que Thử nghiệm kháng sinh đồ loại kháng sinh cụ thể lâm sàng kỹ thuật cần thiết giúp cho bác sĩ lâm sàng thực hành hàng ngày Tuy nhiên, ngày nay, sinh học phân tử đƣợc áp dụng rông rãi nhiều lĩnh vực, có vi sinh lâm sàng Ngồi việc định danh VK, sinh học phân tử có khả phát đƣợc gene kháng thuốc mà VK mang theo 1.8 Ứng dụng sinh học phân tử phát gene kháng thuốc Men β – lactamase VK Gram âm tiết ra, thủy phân hệ kháng sinh β – lactam chế thƣờng gặp tạo đề kháng kháng sinh lâm sàng Sự diện đặc tính men đóng vai trị quan trọng việc lựa chọn điều trị kháng sinh thích hợp Ngày nay, đối mặt với VK Gram âm lúc đặt vấn đề VK có sinh men β – lactamase gây đề kháng kháng sinh β – lactam có chứng ngƣợc lại Do trƣớc việc tiếp cận cấu trúc phân tử men β – lactamase phức tạp, gây khó khăn lớn việc xếp loại men β – lactamase, chí bị trùng lắp nhóm Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học phân tử, việc tiếp cận dễ dàng đến trình tự a xít amin, xác định đƣợc gene mã hóa men lâm sàng [33] Do đó, ấn phẩm gần ghi nhận yếu tố định phát đề kháng kháng sinh dựa phân tử xác định gene β - lactamase [73] Các kỹ thuật dựa vi đa giếng (microarrays) nhƣ: Check KPC/ extended-spectrum β- Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 31 lactamase (ESBL) (Check-Points) dùng để phát gene β-lactamase (bla) từ VK phân lập đƣợc Các xét nghiệm không cung cấp thông tin để định danh VK mà cho biết chế kháng thuốc Kỹ thuật sử dụng khuếch đại lai PCR thực nghiệm vi đa giếng DNA mật độ thấp (low-density DNA microarray) Một vài tài liệu nhấn mạnh khả xét nghiệm để phát gene bla tƣơng ứng nhƣ: TEM, SHV, CTX-M KPC β-lactamases Các sản phẩm có độ nhạy độ đặc hiệu tƣơng đƣơng nhau, lên tới 100% [73] Một sản phẩm khác thực số lƣợng lớn chất đánh dấu chuyên biệt để xác định gene bla ESBL (TEM, SHV CTX-M), plasmid-mediated cephalosporinase (pAmpC) carbapemenases (KPC, OXA-48, VIM, IMP NDM) Các NC khác phát trình tự kháng kháng sinh sử dụng multiplex realtime PCR hạt phát huỳnh quang xen vào (intercalating fluorophores) (nhƣ: SYBR Green) đầu dò lai (or hybridization probes) (các đèn phân tử: molecular beacons) để xác định nhiều biến thể gene carbapenemase (blaKPC) [73] Phƣơng pháp MS đƣợc thực nghiệm phát kháng thuốc Gần đây, xét nghiệm phát men β – lactamase dựa MALDI-TOF MS đƣợc mô tả nhƣ xét nghiệm Xét nghiệm giúp phát gene kháng thuốc kháng với nhiều kháng sinh β - lactam khác nhau, bao gồm carbapenem [73] Khi đánh giá kết liên quan tới đề kháng kháng sinh, điều đáng ý phƣơng pháp phân tử cung cấp độ nhạy thí nghiệm cho kháng sinh đặc hiệu Khi kết bao gồm gene kháng thuốc trình tự có liên quan Cịn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh chuẩn mực tiếp tục thực chủng phân lập từ cấy [73] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 32 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang 2.2 Địa điểm nghiên cứu Khoa Hồi Sức Tích Cực Chống Độc (ICU nội), khoa Phẫu Thuật Gây Mê Hồi Sức (ICU ngoại) phòng Đột quị khoa Nội Thần Kinh bệnh viện Nhân Dân Gia Định 2.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 11/2014 đến 9/2015 2.4 Đối tƣợng nghiên cứu Dân số mục tiêu: Bệnh nhân nằm khoa bệnh nặng có thở máy Dân số chọn mẫu: Bệnh nhân nằm điều trị khoa Hồi Sức Tích Cực Chống Độc, khoa Phẫu Thuật Gây Mê Hồi Sức phòng Đột quị khoa Nội Thần Kinh bệnh viện Nhân Dân Gia Định 2.5 Cỡ mẫu cơng thức tính cỡ mẫu Cơng thức tính cỡ mẫu: n Z (21 / 2)  p(1  p) d2 Cỡ mẫu nghiên cứu: Z: trị số từ phân phối chuẩn (Z = 1,96); α = 0,05; p: tỉ lệ VK gây VPTM từ nghiên cứu trƣớc p = 0,69 [5]; d: sai số ƣớc lƣợng (d = 0,07) Với tỉ lệ VPTM Acinetobacter 69% [5], sau tính tốn đƣợc làm trịn n = 168 mẫu cấy dƣơng Do số bệnh nhân cần đƣợc tuyển chọn 244 (168:0,69) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 33 Tuy nhiên tỉ lệ VPTM đồng nhiễm hai VK lúc ƣớc tính khoảng 10% [32] Nhƣ số bệnh nhân cần đƣợc tuyển chọn tối thiểu 219,17 làm tròn 220 Kỹ thuật chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện, chọn tất bệnh nhân nhập vào khoa ICU nội, ICU ngoại phòng Đột quị khoa Nội Thần Kinh từ tháng 11 năm 2014 đến 30 tháng năm 2015, có thở máy qua ống nội khí quản (NKQ) qua ống khai khí quản (KKQ) thỏa tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu 2.6 Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.6.1 Tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu Bệnh nhân thở máy qua NKQ qua KKQ ≥ 48 khoa ICU nội, ICU ngoại Nội Thần Kinh BV NDGĐ Bệnh nhân có VP lâm sàng: thâm nhiễm mới, lan tỏa tiến triển X-quang ngực kèm ≥ tiêu chuẩn: + T0 ≥ 38oC, ≤ 36oC + Tăng tiết đàm đàm đổi màu + Tăng tiêu thụ oxy: tăng FiO2 ≥ 20%/ngày ≥ ngày liền, tăng PEEP ≥ cmH2O/ngày, ≥ ngày liền + BC máu ≥ 12.000/mm3 hay ≤ 4.000/mm3 2.6.2 Tiêu chuẩn loại ra: + Bệnh nhân < 18 tuổi + Đã có VP xảy trƣớc 48 + Bệnh nhân bị nhồi máu tim 24 đầu, rối loạn nhịp thất nguy hiểm chƣa kiểm soát đƣợc + Tiểu cầu dƣới 60.000/mm3 + Phụ nữ có thai, bệnh nhân ghép tạng bệnh nhân nhiễm HIV + Thân nhân không đồng ý tiếp tục tham gia NC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 34 2.7 Phƣơng pháp tiến hành 2.7.1 Thỏa thuận với ngƣời thân bệnh nhân Giải thích lợi ích NC cho thân nhân ngƣời bệnh kí vào đồng ý tham gia NC (phụ lục 2, 3) 2.7.2 Cách thức tiến hành Đánh giá theo dõi bệnh nhân: tất bệnh nhân nhập vào khoa tham gia thực NC đƣợc ghi nhận tên, tuổi, giới, ngày nhập vào khoa, địa chỉ, lý nhập viện, tiền bệnh lý Dấu hiệu sinh tồn: mạch (lần/phút), huyết áp (mmHg), nhiệt độ (oC), độ bão hòa oxy theo mạch đập (SpO2), thang điểm hôn mê Glasgow đƣợc ghi nhận lúc nhập khoa Bệnh nhân đƣợc khám chi tiết quan làm xét nghiệm thƣờng qui Các xét nghiệm bao gồm CTM, ure máu, creatinin máu, đƣờng huyết, điện giải đồ máu, điện tâm đồ, X-quang ngực thẳng, khí máu động mạch xét nghiệm chuyên biệt theo bệnh lý bệnh nguyên Những bệnh nhân có thở máy đƣợc cài đặt máy thở ban đầu: thể tích khí lƣu thơng 10ml/kg, tần số thở 14 lần/phút, phân suất oxy khí thở vào 100%, thời gian hít vào 1,2 giây, chế độ thở kiểm sốt có hỗ trợ [6] Đánh giá lại tình trạng bệnh nhân sau 30 phút Tất bệnh nhân thở máy đƣợc đặt ống hút đàm kín Sau 48 thở máy, đánh giá lại tình trạng bệnh nhân Các thông số cần đánh giá bao gồm lâm sàng nhƣ nhiệt độ, tiêu thụ oxy, tăng tiết đàm màu sắc đàm qua nội khí quản qua khai khí quản Cận lâm sàng bao gồm CTM, X-quang ngực thẳng Ghi nhận loại kháng sinh sử dụng số ngày sử dụng kháng sinh trƣớc nội soi phế quản 2.7.3 Nội soi phế quản giƣờng (Phụ lục 4) Dịch rửa phế quản phế nang đƣợc chia làm hai mẫu: mẫu đƣợc gởi tới phòng vi sinh vòng 30 phút Mẫu lại đƣợc giữ môi trƣờng đông lạnh < 40C gởi tới phòng sinh học phân tử Trung Tâm Pháp Y thành phố Hồ Chí Minh vịng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 2.7.4 Tại khoa vi sinh Dịch rửa phế quản phế nang đƣợc xử lý, nuôi cấy định danh theo qui trình ni cấy định danh khoa Vi Sinh bệnh viện Nhân Dân Gia Định 2.7.4.1 Cấy định lượng dịch rửa phế quản phế nang (phụ lục 5) 2.7.4.2 Định danh vi khuẩn: theo qui trình định danh vi khuẩn khoa vi sinh bệnh viện Nhân Dân Gia Định (phụ lục 6) Các hộp môi trƣờng phân lập sau ủ đƣợc lấy ra, tiến hành: (1) Quan sát khuẩn lạc; (2) Nhuộm Gram định danh loại khuẩn lạc phản ứng sinh hóa chuyên biệt cho loại VK: (a) Tụ cầu khuẩn: tiến hành phản ứng catalase, coagulase, chapman, ure, polymycin novobiocin (b) Liên cầu khuẩn: tiến hành phản ứng sinh hóa nhƣ: taxo A, taxo P, natrichlorua 6,5%, bile esculin, CAMP test (c) Trực khuẩn Gram (-): thử oxidase Oxidase (-): VK đƣờng ruột: thực phản ứng khảo sát tính lên men đƣờng glucose, lactose, sinh hơi, sinh H2S môi trƣờng KIA, di động, Indol môi trƣờng SIM, Citrate, Urease, Methyl red (MR) Oxidase (+): VK thuộc họ VK đƣờng ruột, thực phản ứng sinh hóa tƣơng tự VK đƣờng ruột kết hợp với định danh API 20NE 2.7.4.3 Kỹ thuật khuếch tán kháng sinh đồ thạch từ đĩa kháng sinh theo phương pháp Kirby – Bauer (kháng sinh đồ khuếch tán) Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh VK theo phƣơng pháp Kirby – Bauer Các đĩa kháng sinh đồ đƣợc sử dụng có chứa hàm lƣợng kháng sinh nhƣ sau: amikacin 30 μg, genetamycin 10 μg, ceftriaxone 30 μg, ceftazidime 30 μg, cefepime 30 μg, cefoperazone 75 μg, cefoperazone/sulbactam 75/30 μg, piperacillin /tazobactam 100/10 μg, ertapenem 10 μg, imipenem 10 μg, meropenem 10 μg, ciprofloxacin μg, levofloxacin μg, doxycyllin 30 μg, vancomycin 30 μg and colistin 10 μg đƣợc cung cấp Oxoid (Oxoid ltd Basingstoke Hampshire England) Các chủng chứng bao gồm: Acinetobacter baumannii ATCC 19606, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 36 Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Liofilchem, Italia) Biện luận kết kháng sinh đồ theo CLSI (2014) [35] Tiến hành lƣu chủng mơi trƣờng thích hợp 2.7.4.4 Kháng sinh đồ xác định MIC que E-test Que E-test que giấy Nitrocellulose, có tẩm kháng sinh thành dãy có hàm lƣợng giảm dần Khi đặt que E-test lên mặt môi trƣờng trải VK, kháng sinh từ que E-test khuếch tán mơi trƣờng theo nồng độ giảm dần Nhờ mà phát triển VK chung quanh que E-test bị ức chế hình thành vùng vơ khuẩn có hình elip Điểm cắt vùng vơ khuẩn tiếp xúc với que E-test cho biết giá trị MIC kháng sinh đƣợc đọc số ghi que điểm dừng Mỗi đĩa thạch với đƣờng kính 90mm đặt tối đa hai que E-test ngƣợc chiều Đối với đĩa thạch đƣờng kính 150mm đặt tối đa sáu que E-test hƣớng tâm với đầu kí hiệu kháng sinh quay ngồi Việc chuẩn bị mơi trƣờng, trải huyền dịch, ni ủ giống nhƣ kỹ thuật khuếch tán kháng sinh đồ thạch [22] Biện luận kết xem phần 2.7.4.5 2.7.4.5 Biện luận kết kháng sinh đồ theo CLSI 2014 [35] (phụ lục 7) 2.7.5 Tại phòng sinh học phân tử Một cơng việc yếu để thực đề tài NC định danh VK mẫu dịch rửa phế quản phế nang giải trình tự gene hệ thống NGS 2.7.5.1 Ly trích DNA VK phương pháp sốc nhiệt (ngay tiếp nhận mẫu) Nguyên tắc: sử dụng hóa chất Dithiothreitol (DTT) làm gãy liên kết disulphide, giúp tan đàm đồng hóa mẫu DRPQPN Sau đó, dùng phƣơng pháp sốc nhiệt để ly trích DNA vi khuẩn Dùng nhiệt độ cao để thay đổi cấu trúc màng vách tế bào vi khuẩn Sau đó, q trình làm lạnh nhanh hình thành tinh thể nƣớc tế bào dẫn đến việc phá vỡ tế bào chất, giúp giải phóng DNA vi khuẩn Bƣớc ly tâm cho mảnh vỡ tế bào lắng xuống đáy, thu phần dịch chứa Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 37 DNA Các bƣớc thực hiện: Bơm 200 µl TE 1X vào tube 1,5 ml vô khuẩn, ghi rõ tên mẫu lên nắp thân tube Dùng đầu tip nhựa vô trùng hút 200 µl DRPQPN đồng cho vào tube với tên mẫu tƣơng ứng, hút nhả nhiều lần để hịa trộn dung dịch, đóng nắp, vortex 10 giây Gắn vào phao thả vào nƣớc sôi cho phần huyền dịch ngập nƣớc Để sôi 10 phút Nhanh chóng lấy tube khỏi phao, ngâm vào khay đá vụn để ngăn lạnh -20oC 10 phút Lấy tube khỏi khay đá ly tâm 13.000 rpm 10 phút Hút 100 µl dịch bên chuyển sang tube (có ghi tên mẫu tƣơng ứng) tránh làm khuấy động lớp cắn dƣới đáy tube Dịch DNA thu đƣợc đem giữ -30oC cho vào mix PCR 2.7.5.2 Đo nồng độ DNA Dùng máy đo Qubit® 2.0 Fluorometer hóa chất Qubit™ dsDNA HS Assay Kits (hãng Thermo Scientific) Nguyên tắc: Thuốc nhuộm hóa chất Qubit™ dsDNA HS Assay Kits có khả phát huỳnh quang cực thấp, nhƣng tạo liên kết với DNA phát huỳnh quang mạnh Tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng độ DNA mẫu đƣợc ghi nhận máy đọc huỳnh quang Hai tube dung dịch DNA với nồng độ khác biết đƣợc dùng để dựng đƣờng chuẩn thể tƣơng quan nồng độ DNA mức tín hiệu huỳnh quang ghi nhận đƣợc Do đó, máy Qubit® 2.0 Fluorometer đọc tín hiệu huỳnh quang từ mẫu cần đo tự động chuyển đổi thành nồng độ DNA Quy trình thực hiện: Chuẩn bị tube 0,5ml, ghi tên mẫu S1, S2 lên nắp tube (S1 S2 hai dung dịch để dựng đƣờng chuẩn) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (A) cách pha lỗng dung dịch Qubit® dsDNA HS Reagenet dung dịch Qubit® dsDNA HS Buffer với tỉ lệ 1:200 Vortex trộn hỗn hợp, sau ly tâm nhẹ Thêm 190 µl hỗn hợp A vào tube 0,5ml chuẩn bị Lần lƣợt cho 10 µl dung dịch S1, S2 mẫu vào tube tƣơng ứng, vortex trộn ly tâm nhẹ Ủ nhiệt độ phòng phút Thực dựng đƣờng chuẩn với S1, S2 Sau đó, đo ghi nhận nồng độ DNA mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 38 2.7.5.3 Phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA kỹ thuật NGS (a) Chuẩn bị thƣ viện Các bƣớc chuẩn bị thƣ viện kỹ thuật NGS tóm tắt theo sơ đồ sau: Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tạo thƣ viện cho kỹ thuật NGS (i) Thực phản ứng PCR để khuếch đại vùng trình tự 16S rDNA: sử dụng kít Ion 16S™ Metagenomics Kit-Thermo Fisher Scientific mục đích: tạo số lƣợng lớn trình tự vùng biến đổi V3, V6 -7 V9 thuộc gene 16SrRNA nhờ vào hoạt động enzyme DNA polymerase mồi đặc hiệu cho vùng trình tự Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tạo amplicon - phản ứng tạo “bản sao” vùng V3, V6, V7 V9 gen 16S-rRNA Nồng độ cuối Phản ứng 30 μl - thành 30 μl 2X Enviromental Master Mix 1x 15 μl 16S Primer Set 1x μl Template DNA 10 – 100 ng - Water Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR: chu kỳ: 95oC 10 phút; 25 chu kỳ gồm: 95oC 30 giây, 58oC 30 giây, 72oC 30 giây; chu kỳ: 72oC phút; chu kỳ: 4oC giữ dùng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 39 (ii) Tinh sản phẩm sau PCR: Sử dụng hóa chất PCR GeneJET NGS Cleanup Kit để tinh sản phẩm khuếch đại Nguyên tắc: hóa chất kết hợp kỹ thuật ly tâm cột đặc điểm bám có chọn lọc vào màng silica để thu nhận DNA, đồng thời loại bỏ đƣợc tạp chất cịn sót lại sau phản ứng PCR nhƣ mồi, enzym, dNTP Đầu tiên, trộn hỗn hợp sau phản ứng PCR với dung dịch có nồng độ muối cao tủa DNA ethanol DNA dạng tủa bám vào màng silica, tạp chất khác qua cột sau ly tâm Qua 2-3 bƣớc rửa, tạp chất đƣợc loại bỏ cách hiệu DNA tinh đƣợc thu nhận dung dịch thoi (elution buffer – EB) nƣớc cất Quy trình thực hiện: Chuẩn bị hóa chất (cho 50 thử nghiệm): Trƣớc sử dụng, cần thêm Ethanol (96-100%) vào chai Prewash Buffer Wash Buffer nhƣ sau: thành phần dung dịch cho tinh sản phẩm Bảng 2.2 Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa việc tinh phản ứng PCR khuếch đại vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA Prewash Buffer Wash Buffer Thể tích ban đầu (ml) 20 Thể tích Ethanol (96-100%) thêm vào (ml) 35 Tổng (ml) 25 42 Đánh dấu lên thân chai thêm Ethanol, lắc lƣu trữ nhiệt độ phịng thí nghiệm (15-25oC) Các bƣớc tiến hành: thêm dung dịch Binding Buffer vào tube chứa sản phẩm PCR theo tỉ lệ 5:1 Bảo quản sản phẩm PCR tinh -20oC (iii) Thực phản ứng “End repair” để tạo đoạn DNA có hai đầu bằng: sử dụng hóa chất NEBNext® Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent (hãng New England Biolabs) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 40 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh - tạo “đầu bằng” cho vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA Thành phần Phản ứng 60 μl Water thành 60 μl NEBNext End Repair Reaction Buffer μl NEBNext End Repair Enzyme Mix μl Fragmented DNA 30 μl (iv) Thực phản ứng gắn Adapter vào đoạn DNA: Sử dụng hóa chất NEBNext® Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent (hãng New England Biolabs) Công thức pha mix cho mẫu: (thành phần phản ứng gắng nhãn) Bảng 2.4 Thành phần phản ứng tạo “thƣ viện” - phản ứng gắn Adapter trP1 vào đầu “đầu bằng” vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA Thành phần Phản ứng 100 μl Water thành 100 μl T4 DNA Ligase Buffer for Ion Torrent 10 μl Adapter μl trP1 μl Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase μl T4 DNA Ligase μl End Repair DNA 60 μl Chƣơng trình chạy máy luân nhiệt: chu kỳ: 25 oC 15 phút; chu kỳ: 65oC phút; chu kỳ: 4oC giữ dùng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn