ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG THỤ THỂ TSH TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM BÌNH THƯỜNG BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP RIA VÀ ELISA doc

ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG THỤ THỂ TSH TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM BÌNH THƯỜNG BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP RIA VÀ ELISA TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện định lượng TRAb bằng hai phương pháp

ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG THỤ THỂ TSH TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM BÌNH THƯỜNG BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP

RIA VÀ ELISA

TÓM TẮT

Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện định lượng TRAb bằng hai phương

pháp RIA và ELISA Tìm giá trị TRAb trên người Việt nam bình thường

Phương pháp nghiên cứu: thiết kế nghiên cứu là cắt ngang, tiền cứu

Đối tượng nghiên cứu: 118 người bình thường khỏe mạnh tình

nguyện (tuổi từ 20 – 52) được loại trừ các bệnh lý tuyến giáp

Kết luận: Qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy đã có đủ điều kiện và

độ tin cậy để thực hiện việc định lượng TRAb Giá trị TRAb bình thường trên người Việt nam khỏe mạnh đối với phương pháp RIA 1,08 0,9 U/L

và ELISA 1,14 0,57 U/L

ABSTRACT

Objectives: Measuring TRAb by RIA (RadioImmunoAssay) and

ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) methods Then, determining normal value of TRAb on healthy Vietnamese

Method: prospective cross-sectional study

Results: 118 Vietnamese healthy donator (20-52 age) excluded

thyroid disease

Conclusion: By the study, we recognize that there are enough conditional and confidential technique in order to perform the measure

of TRAb Normal value of TRAb of healthy Vietnamese are: RIA method: 1.08 ± 0.9 U/L ELISA method: 1.14 ± 0.57 U/L

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lý tự miễn tuyến giáp ngày nay được xem như là rối loạn miễn dịch cơ quan đặc hiệu, gồm có hai nhóm bệnh chính: bệnh BASEDOW và viêm giáp tự miễn

Định lượng kháng thể tự miễn tuyến giáp rất có ích trong việc xác định bệnh lý tự miễn của tuyến giáp và thường được ứng dụng trong thực tế lâm sàng để chẩn đoán và theo dõi bệnh(19,20)

Có ba kháng nguyên liên quan đến bệnh lý miễn dịch tuyến giáp đã được xác định, Thyroglobulin (Tg), Thyroperoxidase (TPO) và thụ thể TSH (TSH-R) tương ứng với ba loại kháng thể TgAb, TPOAb và TRAb (TSH receptor antibodies)(4,14)

Tại Việt Nam kháng thể kháng thyroglobulin (TgAb) và kháng TPO (TPOAb) là những tự kháng thể được xác định đầu tiên Xét nghiệm định lượng các kháng thể tuyến giáp này, ngày nay được sử dụng rộng rãi trong một số bệnh lý tuyến giáp, riêng kháng thể kháng thụ thể TSH (TRAb) do có phức tạp về kỹ thuật và chi phí xét nghiệm cao, cho nên hiện tại chỉ có một

số ít trung tâm thực hiện và còn trong vòng nghiên cứu

Chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này nhằm mục đích:

- Định lượng TRAb bằng hai phương pháp RIA (radioimmunoassay)

và ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

- Định lượng TRAb trên người Việt Nam bình thường để làm giá trị

so sánh đối chiếu trên lâm sàng

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế là nghiên cứu cắt ngang, tiền cứu

Đối tượng nghiên cứu

Người bình thường khỏe mạnh, không có tiền sử gia đình về các bệnh

lý tuyến giáp Không dùng corticoid trong khoảng 2 tháng trước đó Độ tuổi

từ 18 đến 60 tuổi Tự nguyện tham gia nghiên cứu

Cỡ mẫu

Cỡ mẫu được tính dựa trên công thức sau

n = C2αf(1- f)/ε2

Trong đó C2α = 1,96 với α = 0,05

f: tỉ lệ ước đoán 7%

ε: sai số chọn mẫu 1,6%

n = 73

Phương pháp nghiên cứu

+ Phương pháp tiến hành

Hỏi tiền sử và thăm khám lâm sàng để loại trừ các trường hợp bệnh

lý Tất cả các đối tượng đáp ứng với yêu cầu đề ra được thử FT4, FT3, TSH

để phát hiện các bất thường bệnh lý tuyến giáp, đồng thời được định lượng TRAb bằng hai phương pháp RIA và ELISA, theo qui trình như sau:

++ Qui trình định lượng TRAb bằng RIA

Kit TR-AB-CT của hãng Cis bio international

NGUYÊN LÝ

Trong Kit TR-AB-CT các TRAb trong huyết thanh bệnh nhân được cho tương tác với thụ thể TSH tráng ở đáy các ống nghiệm Phần TRAb gắn kết được phát hiện bởi khả năng ức chế độ gắn của TSH – I125 với các thu thể tráng trong ống nghiệm, nồng độ TRAb được xác định trên đường cong chuẩn Ngoài ra, có thể diễn giải kết quả bằng sự ức chế tỷ lệ gắn TSH

QUI TRÌNH KỸ THUẬT:

1 Đưa các gói chứa tubes và các loại thuốc thử ra nhiệt độ phòng

(18-250C) trước khi tiến hành xét nghiệm khoảng 30 phút Sau khi mở gói chưa

tubes, các ống có tráng kháng thể đáy ống phải được dùng trong ngày, các ống còn thừa cho vào túi nhựa hút ẩm trữ 2-80C tối đa 1 tuần

2 Đánh số các ống kép cho total (tổng hoạt tính)(T), chứng 0-1-2-3-4, chứng dương, mẫu huyết thanh Riêng total thì dùng ống nghiệm thông thường Nếu tính kết quả bằng % độ gắn TSH binding thì có thể không cần dùng đến các chuẩn 1-4

3 Cho 50 l start buffer vào tất cả coated tubes (giai đoạn này nên dùng multipipette eppendorf (ống hút đa thể tích)

4 Cho 100 l chứng, chứng âm, chứng dương và các mẫu huyết thanh vào mỗi coated tubes tương ứng

5 Ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng (20-250C), trên máy lắc 200 vòng/phút

6 Cho 1 ml dung dịch đệm rửa vào mỗi tube, trừ ống T, rồi đổ đi Lặp lại lần 2

7 Cho 100 l 125 I-labelled TSH (TSH gắn I 125) vào tất cả các ống,

kể cả ống T, bằng multipipette eppendorf Đậy ống và ủ nhiệt độ phòng trên

1 máy lắc 200 vòng/phút

8 Cho 1 ml dung dịch đệm rửa vào tất cả các ống, trừ ống T, đổ đi Lặp lại lần 2

9 Đếm mỗi ống 1-2 phút bằng máy đếm gamma

10 Vẽ đồ thị tỷ lệ B/Bo (Bo la số đếm của chứng âm, tức standard 0) nghịch với log của hàm lượng standard) Đọc hàm lượng TRAb của mẫu huyết thanh và chứng dương trên đồ thị chuẩn (Có thể diễn giải kết quả bằng tỷ lệ ức chế gắn TSH)

Inhibition TSH binding % = 100-B/Bo x 100

Đặc trưng của phương pháp định lượng

Tính đặc hiệu

TR-AB-CT xét nghiệm đặc hiệu với tự kháng thể kháng TSH Không

có hiện tượng giao thoa với các tự kháng thể khác và cho kết quả âm tính đối với kháng thể kháng thyroglobulin, kháng TPO, các yếu tố thấp khớp, thụ thể acetylcholine Hơn nữa, không có hiệu quả với người có nồng độ LH cao khoảng 10 U/ml, TSH khoảng 30 U/L, FSH khoảng 70 U/ml, HCG đến 160U/L)

Test hồi qui:

Thêm 1 lượng biết trước TRAb vào huyết thanh người, tỷ lệ % hồi qui trong mẫu nằm trong dãy từ 94% đến 111%

Test pha loãng

Các mẫu có nồng độ đậm đặc cao phải được pha loãng Tỷ lệ % hồi qui nằm trong dãy từ 83% đến 120%

Giới hạn phát hiện

Được định nghĩa như là lượng tối thiểu có thể phát hiện được tương đương với giá trị huyết thanh âm bằng cpm (số xung đếm trong một phút) +2SD là 0,3 U/L

++ Qui trình định lượng TRAb bằng ELISA

Sử dụng kit thử TSH Receptor Autoantibody ELISA của hãng DRG Instruments GmbH Germany

Đây là phương pháp miễn dịch men được đo ở bước sóng λ 450 nm

Thực hiện trên máy tự động

- Xử lý số liệu

Tất cả số liệu được tính toán bằng mềm SPSS 10.0 (Statistical Package for Social Sciences) for window Đối với các test thống kê lấy ngưỡng ý nghĩa là 5%

- Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian nghiên cứu từ tháng 11/2002 đến kháng 11/2004 Đề tài này được thực hiện tại bệnh viện đa khoa tỉnh Đồng Nai, Khoa Y học hạt nhân Bệnh viện Chợ rẫy và Trung tâm chẩn đoán y khoa MEDIC

KẾT QUẢ

Tổng số người tình nguyện đáp ứng yêu cầu là 118 người, với đặc điểm như sau

Bảng 1: Đặc điểm mẫu nghiên cứu

(tuổi)

Tối thiểu (tuổi)

Tối

đa (tuổi)

± 7,3

± 9,4

± 8,4

p = 0,45 không có sự khác biệt giữa hai giới

Trong 118 người tình nguyện tham gia nghiên cứu trong đó nam 55 người nữ 63 người, độ tuổi trung bình nam: 32,6 ± 7,3 tuổi, nữ 33,8 ± 9,4 Không có sự khác biệt giữa hai giới p = 0,45

Bảng 2: Kết quả định lượng TRAb bằng phương pháp RIA

TB 1,00 ± 1,02 0,99 0,46

+ ĐLC

(U/ L)

0,62 ± 0,63 ± 0,62

Tối thiểu

Tối

đa

Tất cả 118 người tình nguyện được định lượng TRAb bằng phương pháp RIA, kết quả giá trị trung bình chung cho cả hai giới là 1,08 ± 0,9 U/L trong đó thấp nhất là 0,00 và cao nhất là 1,89 Nếu tính riêng cho từng giới

là nam: 1,02 ± 0,63 U/L, nữ: 1,14 ± 1,1 Giữa hai giới không có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê với p = 0,46

Bảng 3: Kết quả định lượng TRAb bằng phương pháp ELISA

Chung Nam Nữ p

TB + ĐLC

1,14 ± 0,57

1,16

± 0,55

1,11

± 0,6

0,74

Tối thiểu

Tối

đa

Trong 118 người có 73 người được định lượng cả hai phương pháp RIA và ELISA Kết quả TRAb bằng phương pháp ELISA của 73 người như sau: tính chung cả hai giới 1,14 ± 0,57 U/L thấp nhất 0,00 cao nhất 2,2 U/L

Nam (n = 39) 1,16 ± 0,55 U/L

Nữ (n = 34) 1,11 ± 0,6 U/L

Giữa hai giới không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,74

BÀN LUẬN

Định lượng TRAb đã được thực hiện ở những nước tiên tiến vào những năm đầu của thập niên 1990 Tại nước ta cho đến năm 2002 mới có một số công trình được báo cáo với cỡ mẫu nhỏ được tiến hành tại Bệnh viện Bạch Mai và Bộ môn Y học Hạt nhân Trường Đại học Y Hà Nội Tất cả các đề tài kể trên thực hiện định lượng TRAb bằng phương pháp RIA với kỹ thuật kết tủa PEG (Polyethylene glycol) và chưa có báo cáo nào về định lượng TRAb bằng phương pháp ELISA(2,25).

Đề tài nghiên cứu của chúng tôi tiến hành nhằm mục đích hoàn thiện

kỹ thuật định lượng TRAb bằng phương pháp RIA với kỹ thuật kháng thể

phủ đáy ống và thực hiện định lượng TRAb bằng phương pháp ELISA

Đồng thời chúng tôi muốn xác định giá trị TRAb trên người Việt Nam bình thường nhằm mục đích so sánh đối chiếu với các giá trị bệnh lý khác

Đối với phương pháp RIA nhà sản xuất kit thử đưa ra khuyến cáo, qua

141 trường hợp người bình thường khoẻ mạnh người ta thấy rằng có 140 người chiếm 99% các trường hợp có giá trị TRAb nhỏ hơn 1U/L, giá trị dưới 1U/L được xem là TRAb âm tính Từ 1,1 đến 1,5 được xem là vùng giới hạn

và lớn hơn 1,5U/L được xem là TRAb dương tính Tuy nhiên nhà sản xuất cũng khuyến cáo các phòng xét nghiệm nên đưa ra chỉ số bình thường cho

riêng mình Như vậy số liệu trung bình của chúng tôi đưa ra là 1,08 ± 0,9 U/L phù hợp với khuyến cáo của nhà sản xuất

So với số liệu của hai đề tài đã được công bố

Tác giả Bùi T Huyền(2) Đại học Y Hà nội tổng số 20 người chỉ có một trường hợp có TRAb = 0,38 mU/mL còn 19 trường hợp còn lại âm tính

Tác giả Trần Xuân Trường(25) qua 30 trường hợp đưa ra kết quả giá trị trung bình TRAb: 1,4 ± 0,6U/L

Các tác giả này tuy cùng dùng phương pháp RIA nhưng sử dụng kỹ thuật tủa PEG Đây là một kỹ thuật phức tạp vì thế chúng tôi chọn kỹ thuật kháng thể phủ đáy ống để thực hiện đề tài, kỹ thuật này dễ thực hiện, sai sót

do kỹ thuật thấp Qua 118 trường hợp trong đó có 30 trường hợp chúng tôi thực hiện mẫu kép, chúng tôi nhận thấy hệ số thay đổi giữa các mẫu kép CV% (Coefficience of variation) nhỏ hơn 5%, đồ thị thu được có dạng đồ thị chuẩn TRAb và so với huyết thanh chuẩn nằm trong giới hạn của nhà sản xuất cho phép Qua đó chúng tôi nhận định kết quả thu được là đáng tin cậy

có thể ứng dụng để so sánh và đối chiếu trên lâm sàng

Đối với phương pháp định lượng TRAb bằng ELISA, cho đến nay tại Việt Nam chưa có báo cáo nào ghi nhận Theo khuyến cáo của nhà sản xuất

nếu giá trị TRAb nhỏ hơn 1U/L thì được xem là âm tính, lớn hơn 1,5U/l là dương tính và từ 1 – 1,5U/L là nghi ngờ, kết quả chúng tôi thu được ở 73 người Việt Nam bình thường là 1,14 ± 0,57 là phù hợp

Kết quả nghiên cứu kể trên của chúng tôi nhằm mục đích hoàn thiện

kỹ thuật định lượng TRAb, tìm giá trị TRAb trên người Việt nam bình thường nhằm mục đích so sánh đối chiếu với các giá trị bệnh lý khác, đóng góp một phần công ích trong việc chẩn đoán những bệnh lý tự miễn tuyến giáp

KẾT LUẬN

Qua 118 người Việt nam bình thường tự nguyện, chúng tôi nhận

thấy:

- Về mặt kỹ thuật đã đủ điều kiện và độ tinh cậy để triển khai định lượng TRAb

- Giá trị TRAb bình thường trên người Việt nam khỏe mạnh, đối với phương pháp RIA (Kit TR-AB-CT của hãng Cis bio international) 1,08 ± 0,9 U/L Với phương pháp ELISA (Kit TSH Receptor Autoantibody ELISA của hãng DRG Instruments GmbH Germany) 1,14 ± 0,57 U/L