Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 6: 745-755 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(6): 745-755 www.vnua.edu.vn –GALACTOSIDASE CỦA CHỦNG Lactobacillus fermentum FV4: TỪ TUYỂN CHỌN CHỦNG ĐẾN XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH TẠO GALACTO-OLIGOSACCHARIDE CỦA ENZYME Nguyễn Tiến Thành2, Trần Thị Na3, Nguyễn Thị Lâm Đồn1, Nguyễn Hồng Anh1* Khoa Cơng nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội Công ty TNHH Yakult Việt Nam * Tác giả liên hệ: hoanganhcntp@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 01.03.2021 Ngày chấp nhận đăng: 04.05.2021 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm tuyển chọn, định danh chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme -galactosidase có hoạt tính transgalactosyl xác định đặc tính enzyme để định hướng ứng dụng sản xuất Galactooligosacchride (GOS) -galactosidase chủng vi khuẩn FV4 phân lập từ dưa cải lên men xác định có hoạt tính transgalactosyl, chuyển hóa lactose thành GOS thơng qua phân tích sản phẩm chuyển hóa sắc ký mỏng (TLC) Chủng FV4 xác định đặt tên Lactobacillus fermentum FV4 dựa việc so sánh trình tự đoạn gen mã hố 16S rRNA Kết xác định đặc tính -galactosidase kỹ thuật chủng enzyme có hoạt độ cao dải pH từ 6,5-8,5 bền pH 7,5, sau 24 pH7,5 hoạt tính enzyme cịn 92,8% Enzyme có hoạt độ tối ưu 50C bền nhiệt độ 30C 24 Thêm vào đó, K+, Na+, DTT với nồng độ 10mM, Mg2+ với nồng độ 1mM làm tăng hoạt tính xúc tác enzyme Sản phẩm chuyển hóa lactose thành GOS enzyme -galactosidase phân tích TLC HPLC cho thấy enzyme -galactosidase chuyển hóa 65% lactose thành 8% GOS thời gian phân giải Từ khóa: -galactosidase, transgalactosyl, galacto-oligosaccharides –galactosidase from Lactobacillus fermentum FV4: from Strain Identification to Characterization of Galacto-oligosaccharide Production of Enzyme ABSTRACT This study was conducted to select, identify lactic acid bacteria strain producing enzyme -galactosidase with trans-galactosylation activity and determine the characteristics of enzyme applied in Galacto-oligosacchride (GOS) production -galactosidase of lactic bacterial strain FV4 isolated from the fermented mustard has been recorded as trans-galactosylation enzyme which converts lactose to GOS via the conversion product by using thin-layer chromatography (TLC) FV4 strain was identified and named Lactobacillus fermentum FV4 based on the comparison of sequence encoding for 16rRNA gene Characterization of technical –galactosidase from this strain indicated that enzyme activity was the highest in the pH ranged from 6.5 to 8.5 and the most stable was at pH 7.5, after 24h of incubation in pH 7.5, the enzyme activity has still remained 92.8% The optimal temperature of enzyme was 50C and + + 2+ enzyme was very stable at 30C in 24h of incubation In addition, K , Na , DTT 1mM, 10mM, and Mg 1mM activated the enzyme activity Products of lactose conversion by using enzyme β-galactosidase were analyzed based on TLC and HPLC showed that 65% lactose was converted to 8% GOS within 6h Keywords: -galactosidase, transgalactosylation, galacto-oligosaccharides ĐẶT VẤN ĐỀ -galactosidase hay gọi Lactase (E.C 3.2.1.23) loại enzyme ứng dụng nhiều ngành công nghiệp chế biến sữa (Nakayama & Amachi, 1999) -galactosidase có khả xúc tác cho hai kiểu phản ứng: thủy phân lactose thành glucose 745 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme galactose phản ứng transgalactosyl hóa để biến đổi lactose thành galacto-oligosachharide (GOS) Hiện nay, giá trị dinh dưỡng lactose bị hạn chế khoảng 70% người trưởng thành giới thiếu enzyme -galactosidase hệ tiêu hóa, gây triệu chứng khó tiêu khơng dung nạp lactose (Corgneau & cs., 2015) Tuy nhiên, điều tạo thị trường tiềm cho việc nghiên cứu sản xuất, ứng dụng -galactosidase cơng nghiệp chế biến sữa Ngồi ra, khả thủy phân lactose enzyme mang lại nhiều lợi ích khác cơng nghiệp thực phẩm làm tăng độ ngọt, giảm tượng kết tinh lactose sản phẩm sữa Hơn nữa, việc áp dụng galactosidase quan trọng việc chuyển đổi lactose whey, sản xuất sữa có hàm lượng lactose thấp ngành công nghiệp sữa để đáp ứng nhu cầu phần lớn dân số không dung nạp lactose, nhạy cảm với lactose thiếu lactase đường ruột (Corgneau & cs., 2015) Quá trình thủy phân lactose tạo GOS nhờ khả chuyển hóa gốc galactosyl Sản phẩm chứng minh prebiotics, giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, sức đề kháng cho người bổ sung vào thực phẩm, đặc biệt sản phẩm chế biến từ sữa (Torres & cs., 2010) Hiện nay, việc kết hợp prebiotic GOS với probiotics nguồn thực phẩm chứng minh mang lại lợi ích mạnh mẽ cho sức khỏe tổng thể người (Sanders & cs., 2019) Ngày nay, việc sử dụng hóa chất ngành thực phẩm khơng khuyến khích, vậy, việc nghiên cứu -galactosidase sinh từ vi khuẩn an tồn thực phẩm (GRAS) có hoạt tính transgalactosyl để sản xuất GOS xu hướng tất yếu Hầu hết nghiên cứu tập trung vào vi khuẩn sinh axit lactic (LAB), đặc biệt Lactobacillus Bacillus sp Một số chủng số chúng liệt kê L plantarum, B polymyxa, B licheniformis, B pumilus, B subtilis… (Miller & cs., 1995), L acidophilus (Nguyen & cs., 2007), L reuteri (Nguyen & cs., 2006) Hầu hết phân tử enzyme có nguồn gốc từ nhóm vi khuẩn lactic dị hợp tử bao gồm hai tiểu phần khác LacL (tiểu phần lớn) LacM (tiểu phần nhỏ); trừ enzyme từ L bulgaricus có cấu tạo đồng 746 phân tử bao gồm hai tiểu phần giống LacZ Khối lượng phân tử -galactosidase từ L delbruekii subsp bulgaricus, L delbruekii subsp lactis L casei subsp Casei phân lập từ sữa phomat có đơn phân với kích thước ~ 116kDa ~ 35kDa với -galactosidase từ L.reuteri có kích thước đơn phân lớn ~ 72kDa, -galactosidase từ L.helveticus có kích thước ~ 65kDa (Nguyen & cs., 2006) Enzyme từ Lactobacillus thường có giá trị pH tối ưu khoảng trung tính 6-7 Nhiệt độ tối ưu khoảng 50-60C, nhiên hầu hết không bền khoảng nhiệt độ (Nguyen & cs., 2006) Trong nghiên cứu này, 10 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dưa cải muối lên men truyền thống Việt Nam sử dụng để tuyển chọn chủng có khả sinh enzyme -galactosidase có đặc tính transgalactosyl, định hướng ứng dụng enzyme sản xuất GOS từ lactose PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Mười chủng vi khuẩn Lactic spp phân lập từ dưa cải muối ký hiệu FV (fermented vegetable) định danh sơ phương pháp hình thái, sinh hố, có khả sinh enzyme -galactosidase sử dụng để tuyển chọn chủng sinh enzyme -galactosidase có hoạt tính transgalactosyl 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xác định hoạt độ enzyme Hoạt độ -galactosidase xác định cách sử dụng o-nitrophenyl--Dgalactopyranoside (oNPG) làm chất mô tả Nguyen & cs (2006), tóm tắt sau: Phản ứng enzyme - chất bắt đầu cách thêm 20l mẫu enzyme vào 480l 22mM oNPG pha đệm 50mM phosphate pH 6,5, sau ủ 10 phút 30C, tốc độ lắc 600 vòng/phút Phản ứng dừng cách cho thêm 750l 0,4M Na2CO3, o-nitrophenol (oNP) tạo xác định cách đo độ hấp Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh thụ 420nm Một đơn vị hoạt độ -galactosidase định nghĩa lượng enzyme giải phóng 1mol oNP/1 phút điều kiện phản ứng nêu 2.2.2 Lựa chọn chủng dựa đặc tính transgalactosyl Các chủng vi khuẩn Lactic nuôi cấy môi trường lỏng MRS (pH 6,5) chứa 1% (w/v) lactose 37C, lắc 200 vịng/phút Sau 24 ni cấy, dịch ni cấy ly tâm 4C, 4.000 vòng/phút để thu sinh khối Lượng sinh khối 0,1g hòa tan tan 0,5ml đệm phosphate, pH 6,5 phá vỡ siêu âm (trong phút với thời gian siêu âm/nghỉ 30s/30s) với hệ thống Vibra Cell VCX 130 Dịch thu đem ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút 4C để loại xác tế bào thu dịch enzyme thô Hỗn hợp enzyme nội bào (0,6U oNPG) đường lactose 600mM với tỷ lệ 1:1 ủ 30C, lắc 600 vòng phút máy ổn nhiệt khô (Eppendorf) 24h Sản phẩm thủy phân (2l) đưa lên sắc ký mỏng TLC mô tả Nguyen & cs (2006), với dung môi phân tách oligosaccharide hỗn hợp Butanol: propanol: etanol: dH2O 2: 3: 3: Bản TLC sau chạy sấy khô, phun dung dịch nhuộm chứa 0,5g thymol: 95ml etanol: 5ml H2SO4, màu cách sấy 130C Sự xuất vạch sắc ký ứng với galactooligosaccharide dấu hiệu cho thấy enzyme chủng quan tâm có đặc tính transgalactosyl 2.2.3 Định danh chủng tuyển chọn phương pháp xác định trình tự gen mã hóa vùng 16S rRNA Vùng mã hố cho 16S rRNA chủng vi khuẩn sinh -galactosidase có đặc tính transgalactosyl nhân lên kỹ thuật PCR với cặp mồi 27F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 1492R (5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) (Chen & cs., 2008) giải trình tự gen hãng First-base, Malaysia Trình tự so sánh mức độ tương đồng di truyền với loài ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST 2.2.4 Xác định đặc tính -galactosidase kỹ thuật từ chủng lựa chọn Enzyme thô chuẩn bị phần 2.2 sử dụng để tinh sơ phương pháp kết tủa sulfat amon phân đoạn 20-70% bão hoà Thành phần muối kết tủa loại bỏ màng cut-off 10kDa Amicon (Milipore) Dịch enzyme kỹ thuật sau sử dụng để xác định đặc tính Xác định pH tối ưu độ bền pH enzyme -galactosidase: pH tối ưu xác định theo phương pháp xác định hoạt độ enzyme (mục 2.1) với chất pha đệm Britton Robinson với giá trị pH từ đến Để xác định độ bền pH, enzyme ủ dung dịch đệm có pH từ 5,5-7,5 30C Ở thời gian khác nhau, mẫu enzyme lấy để xác định hoạt độ lại theo mục 2.1 Xác định nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt enzyme -galactosidase: Nhiệt độ tối ưu nhiệt độ hoạt độ enzyme cao xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.1 nhiệt độ 20-90C Tương tự, để xác định độ bền nhiệt, enzyme ủ nhiệt độ 30, 40, 50C Tại thời gian ủ khác nhau, enzyme lấy để xác định hoạt độ lại (theo phương pháp mô tả mục 2.2.1) Độ bền nhiệt enzyme xác định cách so sánh % hoạt độ lại enzyme thời điểm đo với thời điểm bắt đầu ủ Ảnh hưởng ion kim loại DTT đến hoạt độ -galactosidase: Ảnh hưởng ion kim loại (K+, Na+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+) DTT xác định theo Nguyen & cs (2012) Enzyme ủ 30C vòng 10 phút với 20mM oNPG (10mM Bis-Tris, pH 6,5) chất với bổ sung ion kim loại/DTT để nồng độ cuối ion kim loại/DTT khác (1-10mM) Hoạt độ enzyme khơng có ion kim loại thêm vào coi hoạt động 100% để so sánh với hoạt độ enzyme mẫu có bổ sung ion kim loại/DTT Xác định khả chuyển hóa lactose thành galacto-oligosaccharide -galactosidase: 747 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme Hỗn hợp phản ứng lactose (600mM): enzyme (6 UoNPG) = 3:7 ủ nhiệt độ 30°C 600 vòng/ phút Tại thời gian trình thuỷ phân (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 giờ), 20µl mẫu thu, xử lý nhiệt 99°C phút để bất hoạt enzyme, sử dụng để phân tích TLC (như mục 2.2.2) sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với cột phân tích HPX87C (Aminex Biorad, US) mô tả Nguyen & cs (2012) Lượng GOS tính tốn dựa lượng lactose ban đầu trừ lactose lại lượng glucose, galactose tạo thành KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định hoạt độ enzyme thô -galactosidase 10 chủng vi khuẩn lactic Mười chủng vi khuẩn lactic phân lập từ rau lên men xác định có hoạt tính enzyme -agalactosidase ni cấy điều kiện môi trường MRS với 1% lactose 30C 24 Sinh khối tế bào từ trình lên men 10 chủng phân lập phá vỡ siêu âm để giải phóng -galactosidase nội bào Hoạt độ enzym nội bào xác định mục 2.2.1 thể bảng Bảng Hoạt độ -galactosidase nội bào từ 10 chủng vi khuẩn lactic Tên chủng U/l % so với chủng cao FV1 360 78,3 FV2 230 50 FV3 280 60 FV4 460 100 FV5 330 71,8 FV6 40 8,7 FV7 120 26,1 FV8 110 23,9 FV9 150 32,6 FV10 80 17,4 GOS Glc Gal Lac FV1 FV2 FV3 FV4 FV5 Ghi chú: Glc = glucose, Gal = galactose, Lac = lactose Hình Kết phân tích định tính sản phẩm chuyển hóa lactose enzyme -galactosidase TLC 748 Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh Kết bảng cho thấy, chủng FV4 có hoạt độ enzyme cao đạt 460 U/l Để so sánh hoạt độ chủng với nhau, chủng có hoạt độ cao (FV4) coi 100% Kết so sánh theo % hoạt độ rằng, chủng FV4 cao nhiều so với 05 chủng FV6, FV7, FV8, FV9, FV10, hoạt độ chủng đạt từ 8,7% đến 32,6% so với chủng FV4 Cụ thể, chủng FV6 đạt 8,7%, chủng FV7 đạt 26,1%, chủng FV8 đạt 23,9%, chủng FV9 đạt 32,6% chủng FV10 đạt 17,4% so với chủng FV4 Các chủng FV1, FV2, FV3, FV4 FV5 có hoạt độ enzyme cao sử dụng để tuyển chọn chủng tạo beta-galactosidase có hoạt tính transgalactosyl 3.2 Tuyển chọn chủng tạo enzyme -galactosidase có đặc tính transgalactosyl Phương pháp thực mục 2.2.2 áp dụng cho chủng FV1, FV2, FV3, FV4 FV5 cho kết thể hình Kết TLC cho thấy có enzyme từ chủng FV4 làm giảm độ đậm vạch ứng với lactose (sau 24h), điều có nghĩa có phân giải lactose Kèm với xuất vạch ứng với galactooligosaccharide Trong đó, sản phẩm chuyển hóa lactose enzyme -galactosidase từ chủng gồm FV1, FV2, FV3, FV5 chứa 1-2 dải galacto - oligosaccharide sản phẩm mờ, vạch ứng với lactose cịn đậm (Hình 1) Enzyme -galactosidase từ chủng FV4 có hoạt tính transgalactosyl chuyển hóa lactose thành hỗn hợp GOS cao nhiều loại oligosaccharide chọn lựa cho việc định danh xác định đặc điểm enzyme beta-galactosidase thu nhận từ chủng 3.3 Định danh chủng vi khuẩn FV4 phương pháp xác định trình tự gen mã hóa vùng 16S rRNA 3.3.1 Kết khuếch đại sản phẩm PCR Để định danh xác chủng vi khuẩn lactic FV4, phản ứng PCR thực với cặp mồi 27F 1492R để nhân vùng gen mã hóa tiểu phần 16S RNA ribosome Kết thu băng sản phẩm PCR có kích thước ~1.500bp theo dự kiến (Hình 2) 2.000bp 1.500bp 1.500bp 1.000bp Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 100bp DNA ladder, New England Biolabs, Giếng số 2: sản phẩm PCR Hình Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa vùng 16SrRNA chủng FV4 749 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme CTATACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGAT TTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCG GGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAAC GCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTG GTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCA CAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAA AGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGC CTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTA GTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAA GGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGC CCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA AGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCG TTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGG GCACTCTAGTGAGACTGCCGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATC ATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAA CTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTC GCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGG GGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAG Hình Trình tự vùng gen mã hóa 16S rRNA FV4 Hình Kết Blast so sánh trình tự nucleotide 16S rRNA chủng FV4 với trình tự nucleotide 16S rRNA chủng vi khuẩn Genbank 750 Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh 3.4 Xác định đặc tính enzyme kỹ thuật 3.3.2 Kết giải trình tự nucleotide 16S rRNA 3.4.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ độ bền -galactosidase từ L fermentum FV4 Trình tự nucleotide thu từ vùng gen mã hóa 16S rRNA có kích thước 1.500bp, tín hiệu rõ khơng nhịe, khơng bị trùng đỉnh tín hiệu Sau tiến hành xử lý tín hiệu nhiễu, trình tự nucleotide 16S rRNA chủng FV4 so sánh với trình tự nucleotide 16S rRNA chủng vi khuẩn Genbank sử dụng công cụ BLAST Kết so sánh cho thấy vi khuẩn FV4 có độ tương đồng 100% với gen tương ứng từ loài Lactobacillus fermentum đặt tên Lactobacillus fermentum FV4 Enzyme -galactosidase thu nhận từ chủng L fermentum FV4 hoạt động tối ưu pH 6,5; hoạt độ tương đối đạt 80% so với hoạt độ cực đại biểu khoảng pH 6-8 Enzyme hoạt động yếu pH có tính axit nhiên có khoảng 30% hoạt độ tương đối pH 15% pH (Hình 5) Enzyme có khoảng pH hoạt độ tối ưu mơi trường trung tính tương tự nhiều chủng chi Lactobacillus như: L fermentum K4, L plantarum WCFS1, L bulgaricus DSM20081 (Liu & cs., 2011) Hình pH tối ưu -galactosidase từ L fermentum FV4 C C C Hình Độ bền pH enzyme -galactosidase từ L fermentum FV4 751 ...? ?galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme galactose phản ứng transgalactosyl hóa để biến đổi lactose thành galacto- oligosachharide... so với chủng FV4 Các chủng FV1, FV2, FV3, FV4 FV5 có hoạt độ enzyme cao sử dụng để tuyển chọn chủng tạo beta -galactosidase có hoạt tính transgalactosyl 3.2 Tuyển chọn chủng tạo enzyme -galactosidase. .. độ enzyme mẫu có b? ?? sung ion kim loại/DTT Xác định khả chuyển hóa lactose thành galacto- oligosaccharide -galactosidase: 747 ? ?galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng