Nghiên cứu được thực hiện nhằm tuyển chọn, định danh chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme B-galactosidase có hoạt tính transgalactosyl và xác định đặc tính của enzyme để định hướng ứng dụng trong sản xuất Galactooligosacchride (GOS).B-galactosidase của chủng vi khuẩn FV4 phân lập từ dưa cải lên men được xác định có hoạt tính transgalactosyl, chuyển hóa lactose thành GOS thông qua phân tích sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký bản mỏng (TLC).
Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 6: 745-755 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(6): 745-755 www.vnua.edu.vn –GALACTOSIDASE CỦA CHỦNG Lactobacillus fermentum FV4: TỪ TUYỂN CHỌN CHỦNG ĐẾN XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH TẠO GALACTO-OLIGOSACCHARIDE CỦA ENZYME Nguyễn Tiến Thành2, Trần Thị Na3, Nguyễn Thị Lâm Đồn1, Nguyễn Hồng Anh1* Khoa Cơng nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội Công ty TNHH Yakult Việt Nam * Tác giả liên hệ: hoanganhcntp@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 01.03.2021 Ngày chấp nhận đăng: 04.05.2021 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm tuyển chọn, định danh chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme -galactosidase có hoạt tính transgalactosyl xác định đặc tính enzyme để định hướng ứng dụng sản xuất Galactooligosacchride (GOS) -galactosidase chủng vi khuẩn FV4 phân lập từ dưa cải lên men xác định có hoạt tính transgalactosyl, chuyển hóa lactose thành GOS thơng qua phân tích sản phẩm chuyển hóa sắc ký mỏng (TLC) Chủng FV4 xác định đặt tên Lactobacillus fermentum FV4 dựa việc so sánh trình tự đoạn gen mã hố 16S rRNA Kết xác định đặc tính -galactosidase kỹ thuật chủng enzyme có hoạt độ cao dải pH từ 6,5-8,5 bền pH 7,5, sau 24 pH7,5 hoạt tính enzyme cịn 92,8% Enzyme có hoạt độ tối ưu 50C bền nhiệt độ 30C 24 Thêm vào đó, K+, Na+, DTT với nồng độ 10mM, Mg2+ với nồng độ 1mM làm tăng hoạt tính xúc tác enzyme Sản phẩm chuyển hóa lactose thành GOS enzyme -galactosidase phân tích TLC HPLC cho thấy enzyme -galactosidase chuyển hóa 65% lactose thành 8% GOS thời gian phân giải Từ khóa: -galactosidase, transgalactosyl, galacto-oligosaccharides –galactosidase from Lactobacillus fermentum FV4: from Strain Identification to Characterization of Galacto-oligosaccharide Production of Enzyme ABSTRACT This study was conducted to select, identify lactic acid bacteria strain producing enzyme -galactosidase with trans-galactosylation activity and determine the characteristics of enzyme applied in Galacto-oligosacchride (GOS) production -galactosidase of lactic bacterial strain FV4 isolated from the fermented mustard has been recorded as trans-galactosylation enzyme which converts lactose to GOS via the conversion product by using thin-layer chromatography (TLC) FV4 strain was identified and named Lactobacillus fermentum FV4 based on the comparison of sequence encoding for 16rRNA gene Characterization of technical –galactosidase from this strain indicated that enzyme activity was the highest in the pH ranged from 6.5 to 8.5 and the most stable was at pH 7.5, after 24h of incubation in pH 7.5, the enzyme activity has still remained 92.8% The optimal temperature of enzyme was 50C and + + 2+ enzyme was very stable at 30C in 24h of incubation In addition, K , Na , DTT 1mM, 10mM, and Mg 1mM activated the enzyme activity Products of lactose conversion by using enzyme β-galactosidase were analyzed based on TLC and HPLC showed that 65% lactose was converted to 8% GOS within 6h Keywords: -galactosidase, transgalactosylation, galacto-oligosaccharides ĐẶT VẤN ĐỀ -galactosidase hay gọi Lactase (E.C 3.2.1.23) loại enzyme ứng dụng nhiều ngành công nghiệp chế biến sữa (Nakayama & Amachi, 1999) -galactosidase có khả xúc tác cho hai kiểu phản ứng: thủy phân lactose thành glucose 745 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme galactose phản ứng transgalactosyl hóa để biến đổi lactose thành galacto-oligosachharide (GOS) Hiện nay, giá trị dinh dưỡng lactose bị hạn chế khoảng 70% người trưởng thành giới thiếu enzyme -galactosidase hệ tiêu hóa, gây triệu chứng khó tiêu khơng dung nạp lactose (Corgneau & cs., 2015) Tuy nhiên, điều tạo thị trường tiềm cho việc nghiên cứu sản xuất, ứng dụng -galactosidase cơng nghiệp chế biến sữa Ngồi ra, khả thủy phân lactose enzyme mang lại nhiều lợi ích khác cơng nghiệp thực phẩm làm tăng độ ngọt, giảm tượng kết tinh lactose sản phẩm sữa Hơn nữa, việc áp dụng galactosidase quan trọng việc chuyển đổi lactose whey, sản xuất sữa có hàm lượng lactose thấp ngành công nghiệp sữa để đáp ứng nhu cầu phần lớn dân số không dung nạp lactose, nhạy cảm với lactose thiếu lactase đường ruột (Corgneau & cs., 2015) Quá trình thủy phân lactose tạo GOS nhờ khả chuyển hóa gốc galactosyl Sản phẩm chứng minh prebiotics, giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, sức đề kháng cho người bổ sung vào thực phẩm, đặc biệt sản phẩm chế biến từ sữa (Torres & cs., 2010) Hiện nay, việc kết hợp prebiotic GOS với probiotics nguồn thực phẩm chứng minh mang lại lợi ích mạnh mẽ cho sức khỏe tổng thể người (Sanders & cs., 2019) Ngày nay, việc sử dụng hóa chất ngành thực phẩm khơng khuyến khích, vậy, việc nghiên cứu -galactosidase sinh từ vi khuẩn an tồn thực phẩm (GRAS) có hoạt tính transgalactosyl để sản xuất GOS xu hướng tất yếu Hầu hết nghiên cứu tập trung vào vi khuẩn sinh axit lactic (LAB), đặc biệt Lactobacillus Bacillus sp Một số chủng số chúng liệt kê L plantarum, B polymyxa, B licheniformis, B pumilus, B subtilis… (Miller & cs., 1995), L acidophilus (Nguyen & cs., 2007), L reuteri (Nguyen & cs., 2006) Hầu hết phân tử enzyme có nguồn gốc từ nhóm vi khuẩn lactic dị hợp tử bao gồm hai tiểu phần khác LacL (tiểu phần lớn) LacM (tiểu phần nhỏ); trừ enzyme từ L bulgaricus có cấu tạo đồng 746 phân tử bao gồm hai tiểu phần giống LacZ Khối lượng phân tử -galactosidase từ L delbruekii subsp bulgaricus, L delbruekii subsp lactis L casei subsp Casei phân lập từ sữa phomat có đơn phân với kích thước ~ 116kDa ~ 35kDa với -galactosidase từ L.reuteri có kích thước đơn phân lớn ~ 72kDa, -galactosidase từ L.helveticus có kích thước ~ 65kDa (Nguyen & cs., 2006) Enzyme từ Lactobacillus thường có giá trị pH tối ưu khoảng trung tính 6-7 Nhiệt độ tối ưu khoảng 50-60C, nhiên hầu hết không bền khoảng nhiệt độ (Nguyen & cs., 2006) Trong nghiên cứu này, 10 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dưa cải muối lên men truyền thống Việt Nam sử dụng để tuyển chọn chủng có khả sinh enzyme -galactosidase có đặc tính transgalactosyl, định hướng ứng dụng enzyme sản xuất GOS từ lactose PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Mười chủng vi khuẩn Lactic spp phân lập từ dưa cải muối ký hiệu FV (fermented vegetable) định danh sơ phương pháp hình thái, sinh hố, có khả sinh enzyme -galactosidase sử dụng để tuyển chọn chủng sinh enzyme -galactosidase có hoạt tính transgalactosyl 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xác định hoạt độ enzyme Hoạt độ -galactosidase xác định cách sử dụng o-nitrophenyl--Dgalactopyranoside (oNPG) làm chất mô tả Nguyen & cs (2006), tóm tắt sau: Phản ứng enzyme - chất bắt đầu cách thêm 20l mẫu enzyme vào 480l 22mM oNPG pha đệm 50mM phosphate pH 6,5, sau ủ 10 phút 30C, tốc độ lắc 600 vòng/phút Phản ứng dừng cách cho thêm 750l 0,4M Na2CO3, o-nitrophenol (oNP) tạo xác định cách đo độ hấp Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh thụ 420nm Một đơn vị hoạt độ -galactosidase định nghĩa lượng enzyme giải phóng 1mol oNP/1 phút điều kiện phản ứng nêu 2.2.2 Lựa chọn chủng dựa đặc tính transgalactosyl Các chủng vi khuẩn Lactic nuôi cấy môi trường lỏng MRS (pH 6,5) chứa 1% (w/v) lactose 37C, lắc 200 vịng/phút Sau 24 ni cấy, dịch ni cấy ly tâm 4C, 4.000 vòng/phút để thu sinh khối Lượng sinh khối 0,1g hòa tan tan 0,5ml đệm phosphate, pH 6,5 phá vỡ siêu âm (trong phút với thời gian siêu âm/nghỉ 30s/30s) với hệ thống Vibra Cell VCX 130 Dịch thu đem ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút 4C để loại xác tế bào thu dịch enzyme thô Hỗn hợp enzyme nội bào (0,6U oNPG) đường lactose 600mM với tỷ lệ 1:1 ủ 30C, lắc 600 vòng phút máy ổn nhiệt khô (Eppendorf) 24h Sản phẩm thủy phân (2l) đưa lên sắc ký mỏng TLC mô tả Nguyen & cs (2006), với dung môi phân tách oligosaccharide hỗn hợp Butanol: propanol: etanol: dH2O 2: 3: 3: Bản TLC sau chạy sấy khô, phun dung dịch nhuộm chứa 0,5g thymol: 95ml etanol: 5ml H2SO4, màu cách sấy 130C Sự xuất vạch sắc ký ứng với galactooligosaccharide dấu hiệu cho thấy enzyme chủng quan tâm có đặc tính transgalactosyl 2.2.3 Định danh chủng tuyển chọn phương pháp xác định trình tự gen mã hóa vùng 16S rRNA Vùng mã hố cho 16S rRNA chủng vi khuẩn sinh -galactosidase có đặc tính transgalactosyl nhân lên kỹ thuật PCR với cặp mồi 27F (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 1492R (5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) (Chen & cs., 2008) giải trình tự gen hãng First-base, Malaysia Trình tự so sánh mức độ tương đồng di truyền với loài ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST 2.2.4 Xác định đặc tính -galactosidase kỹ thuật từ chủng lựa chọn Enzyme thô chuẩn bị phần 2.2 sử dụng để tinh sơ phương pháp kết tủa sulfat amon phân đoạn 20-70% bão hoà Thành phần muối kết tủa loại bỏ màng cut-off 10kDa Amicon (Milipore) Dịch enzyme kỹ thuật sau sử dụng để xác định đặc tính Xác định pH tối ưu độ bền pH enzyme -galactosidase: pH tối ưu xác định theo phương pháp xác định hoạt độ enzyme (mục 2.1) với chất pha đệm Britton Robinson với giá trị pH từ đến Để xác định độ bền pH, enzyme ủ dung dịch đệm có pH từ 5,5-7,5 30C Ở thời gian khác nhau, mẫu enzyme lấy để xác định hoạt độ lại theo mục 2.1 Xác định nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt enzyme -galactosidase: Nhiệt độ tối ưu nhiệt độ hoạt độ enzyme cao xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.1 nhiệt độ 20-90C Tương tự, để xác định độ bền nhiệt, enzyme ủ nhiệt độ 30, 40, 50C Tại thời gian ủ khác nhau, enzyme lấy để xác định hoạt độ lại (theo phương pháp mô tả mục 2.2.1) Độ bền nhiệt enzyme xác định cách so sánh % hoạt độ lại enzyme thời điểm đo với thời điểm bắt đầu ủ Ảnh hưởng ion kim loại DTT đến hoạt độ -galactosidase: Ảnh hưởng ion kim loại (K+, Na+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+) DTT xác định theo Nguyen & cs (2012) Enzyme ủ 30C vòng 10 phút với 20mM oNPG (10mM Bis-Tris, pH 6,5) chất với bổ sung ion kim loại/DTT để nồng độ cuối ion kim loại/DTT khác (1-10mM) Hoạt độ enzyme khơng có ion kim loại thêm vào coi hoạt động 100% để so sánh với hoạt độ enzyme mẫu có bổ sung ion kim loại/DTT Xác định khả chuyển hóa lactose thành galacto-oligosaccharide -galactosidase: 747 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme Hỗn hợp phản ứng lactose (600mM): enzyme (6 UoNPG) = 3:7 ủ nhiệt độ 30°C 600 vòng/ phút Tại thời gian trình thuỷ phân (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 giờ), 20µl mẫu thu, xử lý nhiệt 99°C phút để bất hoạt enzyme, sử dụng để phân tích TLC (như mục 2.2.2) sắc ký lỏng hiệu cao HPLC với cột phân tích HPX87C (Aminex Biorad, US) mô tả Nguyen & cs (2012) Lượng GOS tính tốn dựa lượng lactose ban đầu trừ lactose lại lượng glucose, galactose tạo thành KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định hoạt độ enzyme thô -galactosidase 10 chủng vi khuẩn lactic Mười chủng vi khuẩn lactic phân lập từ rau lên men xác định có hoạt tính enzyme -agalactosidase ni cấy điều kiện môi trường MRS với 1% lactose 30C 24 Sinh khối tế bào từ trình lên men 10 chủng phân lập phá vỡ siêu âm để giải phóng -galactosidase nội bào Hoạt độ enzym nội bào xác định mục 2.2.1 thể bảng Bảng Hoạt độ -galactosidase nội bào từ 10 chủng vi khuẩn lactic Tên chủng U/l % so với chủng cao FV1 360 78,3 FV2 230 50 FV3 280 60 FV4 460 100 FV5 330 71,8 FV6 40 8,7 FV7 120 26,1 FV8 110 23,9 FV9 150 32,6 FV10 80 17,4 GOS Glc Gal Lac FV1 FV2 FV3 FV4 FV5 Ghi chú: Glc = glucose, Gal = galactose, Lac = lactose Hình Kết phân tích định tính sản phẩm chuyển hóa lactose enzyme -galactosidase TLC 748 Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh Kết bảng cho thấy, chủng FV4 có hoạt độ enzyme cao đạt 460 U/l Để so sánh hoạt độ chủng với nhau, chủng có hoạt độ cao (FV4) coi 100% Kết so sánh theo % hoạt độ rằng, chủng FV4 cao nhiều so với 05 chủng FV6, FV7, FV8, FV9, FV10, hoạt độ chủng đạt từ 8,7% đến 32,6% so với chủng FV4 Cụ thể, chủng FV6 đạt 8,7%, chủng FV7 đạt 26,1%, chủng FV8 đạt 23,9%, chủng FV9 đạt 32,6% chủng FV10 đạt 17,4% so với chủng FV4 Các chủng FV1, FV2, FV3, FV4 FV5 có hoạt độ enzyme cao sử dụng để tuyển chọn chủng tạo beta-galactosidase có hoạt tính transgalactosyl 3.2 Tuyển chọn chủng tạo enzyme -galactosidase có đặc tính transgalactosyl Phương pháp thực mục 2.2.2 áp dụng cho chủng FV1, FV2, FV3, FV4 FV5 cho kết thể hình Kết TLC cho thấy có enzyme từ chủng FV4 làm giảm độ đậm vạch ứng với lactose (sau 24h), điều có nghĩa có phân giải lactose Kèm với xuất vạch ứng với galactooligosaccharide Trong đó, sản phẩm chuyển hóa lactose enzyme -galactosidase từ chủng gồm FV1, FV2, FV3, FV5 chứa 1-2 dải galacto - oligosaccharide sản phẩm mờ, vạch ứng với lactose cịn đậm (Hình 1) Enzyme -galactosidase từ chủng FV4 có hoạt tính transgalactosyl chuyển hóa lactose thành hỗn hợp GOS cao nhiều loại oligosaccharide chọn lựa cho việc định danh xác định đặc điểm enzyme beta-galactosidase thu nhận từ chủng 3.3 Định danh chủng vi khuẩn FV4 phương pháp xác định trình tự gen mã hóa vùng 16S rRNA 3.3.1 Kết khuếch đại sản phẩm PCR Để định danh xác chủng vi khuẩn lactic FV4, phản ứng PCR thực với cặp mồi 27F 1492R để nhân vùng gen mã hóa tiểu phần 16S RNA ribosome Kết thu băng sản phẩm PCR có kích thước ~1.500bp theo dự kiến (Hình 2) 2.000bp 1.500bp 1.500bp 1.000bp Giếng số 1: Thang DNA chuẩn 100bp DNA ladder, New England Biolabs, Giếng số 2: sản phẩm PCR Hình Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa vùng 16SrRNA chủng FV4 749 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme CTATACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGAT TTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCG GGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAAC GCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTG GTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCA CAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAA AGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAA CCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGT TATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGC CTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTA GTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAA GGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGC CCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA AGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCG TTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGG GCACTCTAGTGAGACTGCCGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATC ATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAA CTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTC GCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGG GGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAG Hình Trình tự vùng gen mã hóa 16S rRNA FV4 Hình Kết Blast so sánh trình tự nucleotide 16S rRNA chủng FV4 với trình tự nucleotide 16S rRNA chủng vi khuẩn Genbank 750 Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh 3.4 Xác định đặc tính enzyme kỹ thuật 3.3.2 Kết giải trình tự nucleotide 16S rRNA 3.4.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ độ bền -galactosidase từ L fermentum FV4 Trình tự nucleotide thu từ vùng gen mã hóa 16S rRNA có kích thước 1.500bp, tín hiệu rõ khơng nhịe, khơng bị trùng đỉnh tín hiệu Sau tiến hành xử lý tín hiệu nhiễu, trình tự nucleotide 16S rRNA chủng FV4 so sánh với trình tự nucleotide 16S rRNA chủng vi khuẩn Genbank sử dụng công cụ BLAST Kết so sánh cho thấy vi khuẩn FV4 có độ tương đồng 100% với gen tương ứng từ loài Lactobacillus fermentum đặt tên Lactobacillus fermentum FV4 Enzyme -galactosidase thu nhận từ chủng L fermentum FV4 hoạt động tối ưu pH 6,5; hoạt độ tương đối đạt 80% so với hoạt độ cực đại biểu khoảng pH 6-8 Enzyme hoạt động yếu pH có tính axit nhiên có khoảng 30% hoạt độ tương đối pH 15% pH (Hình 5) Enzyme có khoảng pH hoạt độ tối ưu mơi trường trung tính tương tự nhiều chủng chi Lactobacillus như: L fermentum K4, L plantarum WCFS1, L bulgaricus DSM20081 (Liu & cs., 2011) Hình pH tối ưu -galactosidase từ L fermentum FV4 C C C Hình Độ bền pH enzyme -galactosidase từ L fermentum FV4 751 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ -galactosidase từ L fermentum FV4 C C C Hình Độ bền nhiệt -galactosidase từ L fermentum FV4 Trong nghiên cứu này, độ bền pH xác định giá trị pH 6,5 7,5 Kết hình rằng, enzyme bền pH có tính axit, pH 5,5 hoạt độ enzyme giảm nhanh chóng khoảng 10% so với hoạt độ ban đầu sau 15 phút Trong đó, enzyme lại bền pH trung tính, trì hoạt độ sau 24 pH 7,5 Đối với pH 6,5 enzyme trì 50% hoạt độ sau 24 ủ pH 6,5 pH hoạt động tối ưu enzyme So sánh với chủng tái tổ hợp L fermentum K4 cho thấy enzyme từ chủng có tính bền pH tương tự chủng FV4 (Liu & cs., 2011) Do để bảo quản tốt enzyme, khuyến nghị bảo quản pH 7,5 điều kiện nhiệt độ thấp 752 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ độ bền -galactosidase từ L fermentum FV4 Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới hoạt độ độ bền enzyme Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme thể hình Kết thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu -galactosidase từ L fermentum FV4 50°C Kết đánh giá độ bền nhiệt enzyme từ -galactosi@dase từ L fermentum FV4 nhiệt độ 30C, 40C, 50C thể hình Mặc dù enzyme có nhiệt độ tối ưu 50C, nhiên enzyme bền nhiệt nhiệt độ Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hồng Anh này, giảm nhanh xuống cịn khoảng 10% hoạt độ sau 45 phút Đối với điều kiện ủ nhiệt 40C 30C, hoạt độ enzyme giảm nhanh xuống 65% sau 1,5 giờ, sau giảm chậm thời gian 23 Sau 24 giờ, hoạt độ enzyme khoảng 38% nhiệt độ 40C 50% nhiệt độ 30C, tương tự enzyme từ chủng L fermentum K4 (Liu & cs., 2011) Như vậy, enzyme từ L fermentum FV4 đánh giá hoạt động nhiệt độ cao thời gian dài 3.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại DTT đến hoạt độ -galactosidase thô Các ion kim loại DTT sử dụng để bổ sung vào với chất oNPG để đánh giá tác động chúng tới hoạt độ enzyne, từ lựa chọn ion kim loại có khả kích thích hoạt động xúc tác -galactosidase Nồng độ ion kim loại DTT sử dụng 10 mM mô tả phần 2.5 DTT Na+ Mg2+ K+ 2+ Cu Zn 2+ Chuẩn Hình Ảnh hưởng ion kim loại/DTT (nồng độ 1mM 10mM) đến hoạt độ -galactosidase GOS Glc Gal Lac 0,5h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h 11h 12h 24h Hình 10 Chuyển đổi lactose thành GOS -galactosidase từ L fermentum FV4 điều kiện pH 6,5 753 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme Hình 11 Khảo sát chuyển hóa lactose tạo GOS enzyme -gal từ chủng L fermentum FV4 phương pháp HPLC Kết cho thấy, ảnh hưởng ion kim loại nồng độ khác khác nhau, nồng độ tăng mức độ ảnh hưởng tăng, nhiên nhận định mang tính tương đối cho phần lớn chất Bên cạnh có mặt ion Zn2+ Cu2+, enzyme hoạt độ hoàn toàn Trong ion K+, Na+, DTT làm tăng hoạt độ enzyme Ion K+ nồng độ 10mM tăng hoạt độ enzyme đến 130% Đối với ion Mg2+, nồng độ 1mM làm tăng hoạt độ enzyme đến 112% khơng có ảnh hưởng nồng độ cao 10mM So sánh với kết nghiên cứu enzyme từ chủng L fermentum K4 L plantarum WCSF1 nhận thấy rằng, mức độ ảnh hưởng ion kim loại lên enzyme có nguồn gốc khác khác nhau, nhiên ảnh hưởng ức chế hay hoạt hóa ion nguồn enzyme khác lại tương đương, ví dụ ion Zn2+ Cu2+ có ảnh hưởng chất ức chế hoạt động enzyme -galactosidase (Liu & cs., 2011; Iqbal & cs., 2010) 3.4.4 Xác định khả chuyển hóa lactose thành galacto-oligosaccharide -galactosidase Với điều kiện phân giải lactose enzyme thơ, dịch thuỷ phân phân tích 754 TLC HPLC (Hình 10 Hình 11) Từ kết TLC (Hình 10), thấy có giảm độ đậm vạch lactose theo thời gian tăng dần vạch ứng với glucose galactose GOS Ngay sau 0,5h cho thấy tạo thành GOS Điều minh chứng khả chuyển gốc galactosyl -galactosidase từ FV4 Tương tự giảm lactose hay tăng lên đường đơn GOS minh chứng kết phân tích HPLC (Hình 11) Tuy nhiên, điều kiện thuỷ phân chưa đảm bảo độ bền enzyme (pH chưa phù hợp với độ bền), hoạt độ enzyme chưa đủ lớn nên sau 6h phân giải, giá trị thành phần hỗn hợp gần khơng có thay đổi Lactose chuyển hoá khoảng 65%, ứng với giảm này, glucose galactose đạt mức khoảng 38% 20% tương ứng Lượng GOS tạo tính tốn mức khoảng 8% (ứng với khoảng 11% lượng lactose chuyển hoá, tỷ lệ công bố số tác giả giới Mặc dù, hiệu phân giải lactose thử nghiệm cần khảo sát tối ưu tiếp, tạo thành GOS với nhiều vạch kích thước khác (Hình 10) cho thấy tiềm lớn của enzyme -galactosidase từ FV4 để ứng dụng tạo prebiotic Nguyễn Tiến Thành, Trần Thị Na, Nguyễn Thị Lâm Đoàn, Nguyễn Hoàng Anh KẾT LUẬN Chủng vi khuẩn lactic FV4 có đặc tính transgalactolsyl, chuyển hóa lactose thành GOS định danh đặt tên Lactobacillus fermentum FV4 Kết phân tích chuyển hóa lactose thành GOS enzyme -galactosidase sử dụng phương pháp TLC HPLC enzyme -galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4 chuyển hóa 65% lactose thành 8% GOS thời gian phân giải LỜI CẢM ƠN Nhóm tác giả xin trân trọng cảm ơn Dự án Việt Bỉ, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tài trợ kinh phí để thực đề tài “betagalactosidase of food grade bacteria: from screening to production and preliminary application” Kết nghiên cứu báo phần đề tài Việt Bỉ TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen W., Chen H., Xia Y., Zhao J., Tian F & Zhang H (2008) Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus J Dairy Sci 91(5): 1751-58 Corgneau M., Scher J., Ritie-Pertusa L., Le D.t.l., Petit J., Nikolova Y., Banon S & Gaiani C (2015) Recent advances on lactose intolerance: Tolerance thresholds and currently available answers Critical Reviews in Food Science and Nutrition 57(15): 3344-3356 Iqbal S., Nguyen T.H., Nguyen T.T., Maischberger T & Haltrich D (2010) -Galactosidase from Lactobacillus plantarum WCFS1: biochemical characterization and formation of prebiotic galacto- oligosaccharides Carbohydrate research 345: 1408-1416 Liu X., Koong Lu W., Tian H & Tian Y (2011) -galactosidase with trans glycosylation activity from Lactobacillus fermentum K4, American Dairy Science Association 94(12): 5811-5820 Miller G., Jarvis J & McBean L.D (1995) Lactose Intolerance Handbook of Dairy Foods and Nutrition CRC Press, Boca Raton FL pp 187-220 Nakayama T & Amachi T (1999) Beta-galactosidase, Enzymology In Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation; Flickinger M.C., Drew S.W., Eds.; John Willey: New York pp 1291-1305 Nguyen T.H., Splechtna B., Steinb€ock M., Kneifel W., Lettner H.P., Kulbe K.D & Haltrich D (2006) Purification and Characterization of Two Novel Galactosidases from Lactobacillus reuteri, Journal of Agricultural and Food Chemistry: 54: 4989-4998 Nguyen T.H., Splechtna B., Krasteva S., Kneifel W., Kulbe K.D., Divne C & Haltrich D (2007) Characterization and molecular cloning of a heterodimeric -galactosidase from the probiotic strain Lactobacillus acidophilus R22 FEMS Microbiology Letters 269: 136-144 Nguyen T.T., Nguyen H.A., Lozel Arreola R., Mlynek G., Djinovic-Carugo K., Mathiesen G., Nguyen T.H & Haltrich D (2012) Homodimeric -galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus DSM 20081: expression in Lactobacillus plantarum and biochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry 7: 1713-172 Sanders M.E., Merenstein D.J., Reid G., Gibson R & Robert A (2019) Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic Nature Reviews Gastroenterology and hepatology 16: 605-616 Torres D.P.M., Gonc-alves M.P.F., Teixeira J.A & Rodrigues L.R (2010) Galacto Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics Comprehensive reviews in food science and food safety 755 ... –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme Hình 11 Khảo sát chuyển hóa lactose tạo GOS enzyme -gal từ chủng L fermentum. .. –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ -galactosidase từ L fermentum FV4... đoạn gen mã hóa vùng 16SrRNA chủng FV4 749 –galactosidase chủng Lactobacillus fermentum FV4: từ tuyển chọn chủng đến xác định đặc tính tạo Galactooligosaccharide enzyme CTATACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGAT