Bước đầu ứng dụng công nghệ enzyme để trích ly các hoạt chất thứ cấp từ rễ cây Đảng sâm (Codonopsic javanica)

Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook.f. phân bố chủ yếu ở vùng núi Tây nguyên, tập trung nhiều nhất là Kontum. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Viscozyme (Novozyme) để tiến hành trích ly và xác định hàm lượng saponin triterpenoid từ Đảng sâm. Saponin triterpenoid là một trong những thành phần dược liệu tập trung chủ yếu ở rễ củ.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ ENZYME ĐỂ TRÍCH LY CÁC HOẠT CHẤT THỨ CẤP TỪ RỄ CÂY ĐẢNG SÂM (Codonopsic javanica) Phan Phước Hiền5, Võ Thị Thao Tóm tắt: Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook.f phân bố chủ yếu vùng núi Tây nguyên, tập trung nhiều Kontum Trong nghiên cứu này, sử dụng Viscozyme (Novozyme) để tiến hành trích ly xác định hàm lượng saponin triterpenoid từ Đảng sâm Saponin triterpenoid thành phần dược liệu tập trung chủ yếu rễ củ Kết nghiên cứu cho thấy tiến hành trích ly Viscozyme nhiệt độ 30oC thời gian giờ, nồng độ enzyme 0,4%, tỷ lệ nguyên liệu:enzyme 1:7 (g:ml) hàm lượng saponin triterpenoid thu 88,7±5,2 mg/100g cao 1,5 lần khơng sử dụng enzyme điều kiện Từ khóa: Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook.f., Viscozyme, Saponin triterpenoid, nồng độ enzyme Abstract: Đảng sâm Codonopsis javanica (Blume) Hook.f mainly distributed in the highland mountain region in Viet Nam, concentrated mostly in Kontum province In this study, for the first time Viscozyme (Novozyme) was used to extract and determine the content of saponin triterpenoid from its root Saponin triterpenoid is one of the medicinal components concentrated mainly in tuberous roots The results showed that when using Viscozyme extraction at 300C for hour, the enzyme concentration was 0.4%, the ratio of material: enzyme was 1:7 (g:ml), the amount of triterpenoid saponin obtained was 88.7 ± 5.2 mg / 100g 1.5 times higher not using the enzyme under the same conditions Key words: “Đảng sâm” Codonopsis javanica (Blume) Hook.f., Viscozyme, Saponin triterpenoid, enzyme concentration Lời mở đầu Đảng sâm loại thân thảo sống lâu năm, mọc bò hay leo thân quấn Thân màu tím sẫm, dài 2-3m, phân nhánh nhiều Rễ củ, hình trụ dài 10-12 cm, đường kính đạt 1-1,7cm Đầu rễ phình to, có nhiều vết sẹo lồi thân củ, phía có phân nhánh có rễ dạng tua nhỏ, mặt ngồi màu vàng nhạt, khơ màu vàng xám, có nếp nhăn dọc ngang, phần lõi màu trắng ngà [1], [2], [3] Phó Giáo sư - Tiến sĩ Trường Đại học Nam Cần Thơ 33 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 Rễ Đảng sâm tươi có chứa đường, saponin, acid amin chất béo [1] Hàm lượng saponin Đảng sâm cao 3,12 [4] Rễ Đảng sâm có vị ngọt, cay, tính mát; có cơng dụng nhiệt (hạ sốt), lợi tiểu, giải độc Thường sử dụng thuốc chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, rong kinh, băng huyết, sử dụng làm thuốc bổ giúp bồi bổ sức khỏe Đơng y coi Đảng sâm dùng thay nhân sâm bệnh thiếu máu, vàng da, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có albumin, chân phù đau Còn dùng làm thuốc bổ dày, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu Người ta gọi Đảng sâm nhân sâm người nghèo có công dụng nhân sâm mà lại rẻ tiền [1] Saponin hay saponosid nhóm glycoside có phần sapongenin có cấu trúc triterpen hay steroid 27 carbon gặp rộng rãi thực vật, tìm thấy rộng rãi động vật thân mềm Hải sâm, Sao biển [5] Công dụng saponin tạo từ khả hoạt động chúng, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus Một số có tác dụng điều trị viêm loét dày viêm da, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus Trong nghiên cứu này, sử dụng Viscozyme để tiến hành trích ly saponin triterpenoid từ Đảng sâm Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Đảng sâm tươi thu hoạch Manden, huyện Konplong thuộc tỉnh Kontum rửa sạch, cắt lát sấy khô 60oC đến đạt độ ẩm 15% Sau xay rây qua lỗ rây 250µm để đồng kích thước bột, bảo quản túi kín để tránh ẩm, mốc; lưu trữ ngăn mát tủ lạnh cho thí nghiệm Enzyme Viscozyme L sử dụng enzyme thương mại cung cấp công ty Novozymes, Copenhagen - Đan Mạch 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Định lượng saponin dựa vào phương pháp quang phổ: vanilin acid vô mạnh kết hợp với genin cho sản phẩm màu hấp thụ cực đại bước sóng ánh sáng khoảng 510 - 620 nm Một phản ứng tách nước xảy tạo thành nhóm methylene chưa no gây nên màu tím hoa cà cho sản phẩm với aldehyde [6] - Xác định hàm lượng triterpenoid: Dựng đường chuẩn acid oleanolic: Dung dịch acid oleanolic pha với nồng độ khác nhau, bổ sung vào chất vanillin - acetic acid (5%), acid pechoric (72%), acid acetic băng, đun nhiệt độ 60oC thời gian 15 phút, dung dịch chuyển sang màu tím hoa cà Đo độ hấp thu bước sóng 548 nm [7]  34 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 Quy trình trích ly xác định hàm lượng saponin triterpenoid từ Đảng sâm: Sau Đảng sâm xử lý enzyme trích ly ethanol 70o, Dịch trích ly lọc ly tâm Sau cô khan ethanol thu cao Đảng sâm Thủy phân cao chiết Đảng sâm H2SO4 5% nhiệt độ 100oC, Dịch thu lắc với nhexane theo tỷ lệ 1:1 (v/v) đến không màu, bốc n-hexane nhiệt độ 50oC, thu cắn Hòa tan cắn methanol định mức thành 10ml Tiến hành lấy dịch phân tích hàm lượng saponin triterpenoid  Kết thảo luận 3.1 Khảo sát nhiệt độ tác động enzyme Khảo sát đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến trình xử lý nguyên liệu bột Đảng sâm enzyme thu nhận saponin triterpenoid Hàm lượng saponin (mg/100g) 40 30,661b 30 33,023a 26,81c 16,355d 20 10 25 30 Nhiệt độ (oC) 40 50 Hình Khảo sát nhiệt độ tác động enzyme Các giá trị có ký tự chữ khơng có khác biệt có ý mặt thống kê với mức ý nghĩa  ≤ 5%, khác biệt đánh giá dựa vào bảng phân tích ANOVA Trong khảo sát này, tiến hành khảo sát nhiệt độ tác động enzyme từ 25 C đến 50oC Ở nhiệt độ 30oC hoạt động enzyme hiệu nhất, hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận cao 33,023±0,766 mg/100g 30oC thấp 16,355±1,151 mg/100g 50oC o Theo kết S A Palanlyandl cộng (2015), tăng nhiệt độ xử lý nguyên liệu nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) Viscozyme hàm lượng saponin thu nhận tăng đạt cao 45oC [8] So với kết thí nghiệm này, nhiệt độ xử lý nguyên liệu enzyme theo kết thí nghiệm chúng tơi thấp hơn, điều giúp giảm chi phí gia nhiệt, đồng thời bảo vệ hoạt tính hợp chất dễ bị ảnh hưởng nhiệt độ có Đảng sâm Từ phân tích nhận định trên, chọn nhiệt độ xử lý bột Đảng sâm với enzyme nhiệt độ 30oC Nhiệt độ cố định cho khảo sát 35 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 3.2 Khảo sát nồng độ enzyme Khảo sát nồng độ enzyme ảnh hưởng đến trình xử lý nguyên liệu Đảng sâm nhằm chọn nồng độ enzyme mà saponin triterpenoid có hàm lượng cao hàm lượng saponin (mg/100g) 50 38,961a 40 30 39,029a 30,796b 22,698c 20 10 0.2 0.3 0.4 nồng độ enzyme (%) 0.5 Hình Khảo sát nồng độ enzyme Số liệu thực nghiệm hình cho thấy, nồng độ enzyme tăng hàm lượng saponin triterpenoid thu tăng Cụ thể nồng độ enzyme thấp 0,2%, hàm lượng saponin triterpenoid 22,698 ±0,651 mg/100g Nồng độ enzyme cao hàm lượng saponin thu cao, 0,3% hàm lượng saponin đạt 30,796 ±1,151mg/100g, 0,4% hàm lượng saponin đạt 38,961 ±0,536 mg/100g Khi nồng độ enzyme 5% hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận khơng có khác biệt với nồng độ enzyme 0,4% mức ý nghĩa 95% xử lý theo ANOVA Nồng độ enzyme yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất thu saponin triterpenoid Khi nồng độ enzyme cao phản ứng diễn nhanh, vận tốc phản ứng tăng nhanh Nồng độ enzyme cao phản ứng diễn nhanh, vận tốc phản ứng tăng nhanh Nồng độ enzyme tăng đến giá trị, cụ thể 0,4% (v/v) vận tốc phản ứng đạt cực đại V=Vmax theo phương trình Michaelis-Menten, hàm lượng saponin thu đạt ổn định Theo kết Trương Hoàng Duy cs đưa (2014): nồng độ enzyme cao hàm lượng saponin triterpenoid thu tăng nồng độ enzyme tối ưu 0,5% [9] Từ kết trên, chọn nồng độ enzyme 0,4%, ứng với nồng độ enzyme hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận tốt phù hợp với lợi ích kinh tế 3.3 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: enzyme Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu: enzyme (g/ml) đến trình xử lý nguyên liệu Đảng sâm enzyme thu nhận saponin triterpenoid Chúng khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: enzyme (w/v) từ 1:6 đến 1:9, tăng tỷ lệ nguyên liệu: enzyme lên hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận tăng, nhiên tiếp tục tăng tỷ lệ hàm lượng saponin triterpenoid không tăng Cụ thể tỷ lệ 36 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 nguyên liệu : enzyme : hàm lượng saponin thu thấp 41,3 ±1,1mg/100g, tăng tỷ lệ lên : hàm lượng saponin đạt 56,7 ±1,5 mg/100g, tăng tỷ lệ lên : : hàm lượng saponin triterpenoid tăng không đáng kể mức ý nghĩa 95% xử lý theo ANOVA Hàm lượng saponin (mg/100g) 50 40 39,16a 39,164a 39,434a 31,336b 30 20 10 1:6 1:7 liệu : enzyme 1:8 Tỷ lệ nguyên 1:9 Hình Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu : enzyme Thành phần thành tế bào thực vật gồm pectin, cellulose, hemicellulose Khi sử dụng Viscozyme có thành phần pectinase cellulase, chúng thủy phân pectin cellulose cấu trúc mơ thực vật từ dịch tế bào bên ngồi dễ dàng Kết thí nghiệm Trương Hồng Duy cộng (2014) đưa ra: tăng tỷ lệ nguyên liệu : enzyme hàm lượng saponin triterpenoid thu nhận tăng tỷ lệ tối ưu : [9] Từ kết trên, chọn tỷ lệ nguyên liệu : enzyme : cho thí nghiệm sau tiết kiệm lượng enzyme sử dụng, phù hợp với lợi ích kinh tế 3.4 Khảo sát thời gian tác động enzyme Hàm lượng saponin (mg/100g) Khảo sát đánh giá ảnh hưởng thời gian tác động enzyme đến q trình trích ly thu nhận saponin triterpenoid từ Đảng sâm Viscozyme Chúng chọn thời gian xử lý cho phù hợp, đạt hiệu thu saponin triterpenoid cao 40 30 35.182 32.69 22.563 20 10 0 Thời gian (giờ) Hình Khảo sát thời gian xử lý nguyên liệu enzyme 37 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 Khi thời gian xử lý enzyme tăng lên từ đến hàm lượng saponin triterpenoid thu tăng lên từ 22,563 ± 0,928 mg/100g đến 35,182 ± 1,151 mg/100g Tuy nhiên tăng thời gian xử lý lên hàm lượng saponin triterpenoid thu lại giảm 32,69 ± 1,93 mg/100g Phản ứng thủy phân enzyme phải cần có thời gian tối thiểu để enzyme đủ thời gian tác động đến toàn chất, kéo dài thời gian ủ enzyme hiệu trích ly tăng thêm [10] Tuy nhiên, lượng chế phẩm enzyme với lượng chất có giới hạn đến thời điểm định, lượng chất gần chuyển hóa hết Saponin triterpenoid chất bền tiếp xúc với ánh sáng nhiệt độ cao nên bị biến đổi phần thời gian xử lý nguyên liệu enzyme kéo dài Kết luận Qua khảo sát đưa kết luận điều kiện xử lý Đảng sâm với enzyme tối ưu là: nhiệt độ tác động enzyme 30oC, nồng độ enzyme 0,4%, thời gian giờ, với tỷ lệ nguyên liệu: enzyme 1:7 Từ khảo sát nghiên cứu điều kiện trích ly Đảng sâm enzyme tạo tiền đề cho ứng dụng sản phẩm Đảng sâm có giá trị cao chất lượng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Huy Bích cs, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật Tp HCM, 2006 [2] Sách đỏ Việt Nam NXB Khoa học Tự nhiên cộng nghệ, 2007 [3] Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học, 2004 [4] Hoàng Minh Chung, “Nghiên cứu tác dụng bổ khí Đảng sâm Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, vol tập 7, pp 118-120, 2002 [5] N V Thu and T Hùng, Dược liệu học Tập 1: Nhà xuất Y Học Hà Nội, 2011 [6] K Hostettmann, “Saponins”, Cambridge University, p 144, 1995 [7] Han Benyong, Chen Ying, Ren Ying, Chen Chaoyin, “Content determination of total saponins from Opuntia”, BioTechnology, vol 10, no 18, pp 10400-10404, 2014 [8] Sasikumar Arunachalam Palaniyandi, Joo Won Suh, Seung Hwan Yang, “Preparation of Ginseng Extract with Enhanced Levels of Ginsenosides Rg1 and Rb1 using High Hydrostatic Pressure and Polysaccharide Hydrolases”, Pharmacognosy Magazine, vol 13, no 49, pp 142-147, 2017 38 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ Tạp chí Khoa học Kinh tế phát triển số 05 [9] Trương Hoàng Duy, “Optimize extraction of crude saponin triterpenoid from codonopsis javanica (Blume) Hook.f using enzyme cellulase”, International Journal of Pharmaceutical Research & Development (IJPRD), vol 6, 2014 [10] A K Landbo, K Kaack and A.S Meyer, “Statiscally designed two step response surface optimization of enzymatic prepress treatment to increase juice yield and lower turbidity of elderberry juice”, vol 8, no 1, pp 135-142, 2007 39 ... 05 Quy trình trích ly xác định hàm lượng saponin triterpenoid từ Đảng sâm: Sau Đảng sâm xử lý enzyme trích ly ethanol 70o, Dịch trích ly lọc ly tâm Sau cô khan ethanol thu cao Đảng sâm Thủy phân... xử lý Đảng sâm với enzyme tối ưu là: nhiệt độ tác động enzyme 30oC, nồng độ enzyme 0,4%, thời gian giờ, với tỷ lệ nguyên liệu: enzyme 1:7 Từ khảo sát nghiên cứu điều kiện trích ly Đảng sâm enzyme. .. tế phát triển số 05 Rễ Đảng sâm tươi có chứa đường, saponin, acid amin chất béo [1] Hàm lượng saponin Đảng sâm cao 3,12 [4] Rễ Đảng sâm có vị ngọt, cay, tính mát; có cơng dụng nhiệt (hạ sốt),