Nghiên cứu cố định b galactosidase từ lactobacillus trên hạt chitin và ứng dụng trong chuyển hóa lactose

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM MAI LAN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH β- GALACTOSIDASE TỪ LACTOBACILLUS TRÊN HẠT CHITIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN HÓA LACTOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM MAI LAN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH β- GALACTOSIDASE TỪ LACTOBACILLUS TRÊN HẠT CHITIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN HÓA LACTOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN TIẾN THÀNH Hà Nội – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Mai Lan xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu cố định β- galactosidase từ Lactobacillus hạt chitin ứng dụng chuyển hóa lactose” cơng trình nghiên cứu thực hướng dẫn TS Nguyễn Tiến Thành Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Tiến Thành - Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình dìu dắt, giúp đỡ, bảo tận tình cho tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin cảm ơn tất thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô, anh chị, bạn TTNC & PTCNSH tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực nghiên cứu luận văn; đặc biệt xin gửi lời cảm ơn tới Laura Angileri (Agro Campus Rennes), Nguyễn Thị Hiền (KTSH- K53) Hồng Chí Qn (KTSH- K54) tơi thực thí nghiệm nghiên cứu Tơi xin cảm ơn gia đình tạo điều kiện, quan tâm, động viên cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Đề tài hồn thành kinh phí đề tài nghiên cứu Cơ Nafosted Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng 06 năm 2014 Học viên Phạm Mai Lan MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan β- galactosidase 1.1.1 Nguồn gốc đặc tính β-galactosidase 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo β- galactosidase 1.1.3 Đặc điểm chuyển hóa lactose β- galactosidase 1.1.4 Ứng dụng β- galactosidase 1.1.4.1 Ứng dụng thực phẩm 1.1.4.2 Ứng dụng β- galactosidase thuỷ phân whey: 1.1.4.3 Ứng dụng chuyển hoá lactose tạo galacto- oligosaccharide (GOS) 1.2 β-galactosidase từ Lactobacillus 10 1.2.1 Đặc điểm chung 10 1.2.2 β- galactosidase từ Lactobacillus reuteri 10 1.3 Sự cố định β- galactosidase 12 1.3.1 Khái quát enzyme cố định 12 1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme truyền thống 13 1.3.3 Một vài nghiên cứu cố định β- galactosidase 14 1.3.4 Phương pháp nghiên cứu cố định enzyme sử dụng domain liên kết chất 15 1.3.4.1 Tình hình sử dụng domain nói chung 15 1.3.4.2 Trình tự liên kết chitin- chitin binding domain (ChBD) 15 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Chủng giống 18 2.1.2 Thành phần mơi trường hoạt hóa lên men 18 2.1.3 Các hóa chất sử dụng 19 2.1.4 Các thiết bị 20 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Lên men thu sinh khối phá tế bào thu dịch chiết enzyme thô 21 2.2.2 Nghiên cứu cố định β- galactosidase hạt chitin 22 2.2.3 Khảo sát điều kiện tối ưu β- galactosidase cố định chitin 22 2.2.3.1 Xác định nhiệt độ tối ưu enzyme 22 2.2.3.2 Xác định độ bền nhiệt độ enzyme 23 2.2.3.3 Xác định pH tối ưu 23 2.2.3.4 Xác định độ bền pH 23 2.2.3.5 Xác định ảnh hưởng ion kim loại 24 2.2.3.6 Xác định thông số động học enzyme: 24 2.2.3.7 Sự chuyển hóa lactose gián đoạn 25 2.2.3.8 Khảo sát khả tái sử dụng enzyme cố định 25 2.2.4 Nghiên cứu chuyển hóa lactose liên tục enzyme cố định 25 2.3 Các phương pháp phân tích 27 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 27 2.3.2 Xác định hàm lượng Protein phương pháp Bradford 30 2.3.3 Phương pháp điện di SDS- PAGE 31 2.3.4 Các phương pháp phân tích thành phần sản phẩm chuyển hóa lactose 33 2.3.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC (thin layer chromatography) 33 2.3.4.2 Phân tích định tính, định lượng sản phẩm chuyển hóa lactose HPLC 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết xác định hoạt độ β- galactosidase 35 3.2 So sánh khả cố định hạt chitin β- galactosidase 36 3.3 Xác định đặc tính β- galactose cố định chitin 38 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 38 3.3.1.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 38 3.3.1.2 Xác định độ bền nhiệt enzyme 39 3.3.2 Ảnh hưởng pH 41 3.3.2.1 Xác định pH tối ưu β- galactosidase cố định 41 3.3.2.2 Xác định độ bền pH 42 3.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại 43 3.3.4 Động học enzyme cố định 46 3.3.5 Sự chuyển hóa lactose gián đoạn enzyme cố định 47 3.3.6 Khả tái sử dụng enzyme cố định 50 3.4 Đánh giá khả chuyển hóa lactose liên tục 51 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng hoạt độ enzyme 51 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ cấp dịch chất: 52 3.4.3 Kết phân tích định tính TLC sản phẩm trình chuyển hóa lactose 54 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng1.1 Nguồn vi sinh vật thu β- galactosidase Bảng 1.2 pH nhiệt độ tối ưu số loại β- galactosidase Bảng 1.3 Cấu tạo số oligosaccharide sản phẩm chuyển hoá lactose Bảng 2.1 Thành phần môi trường MRS cải biến 19 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch 5X buffer 32 Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tạo gel SDS- PAGE 32 Bảng 3.2 Khả cố định hai enzyme β- galactosidase cố định chitin 36 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ ion kim loại Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cu2+, Zn2+ tới hoạt độ β- galactosidase cố định chitin 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng đồng thời Na+50 mM ion kim loại K+, Mg2+, Ca2+đến hoạt độ enzyme cố định 46 Bảng 3.5 Các thông số động học β- galactosidase cố định chitin 47 Bảng 3.6 Hàm lượng glucose galactose thu sản phẩm chuyển hoá lactose β- galactosidase cố định thời gian khác 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Phản ứng chuyển gốc galactosyl Hình 1.2 Các phương pháp cố định enzyme 14 Hình 2.1 Sơ đồ q trình chuyển hóa lactose liên tục bình phản ứng 26 Hình 2.2 Cơ chế tạo màu oNPG 27 Hình 2.3 Nguyên lý xác định hàm lượng glucose GOD/POD 29 Hình 2.4 Đường chuẩn glucose 30 Hình 2.5 Đường chuẩn Bradfod 31 Hình 3.1 Kết xác định hoạt độ enzyme β- galactosidase thu 35 Hình 3.2 Kết điện di dịch chiết enzym thô, enzyme cố định dịch sau cố định 37 Hình 3.3 Nhiệt độ tối ưu hai loại β- galactosidase cố định với hai chất oNPG lactose 39 Hình 3.4 Khảo sát độ bền β-galactosidase cố định chitin nhiệt độ khác 40 Hình 3.5 pH tối ưu hai loại β- galactosidase cố định chitin với chất oNPG lactose 41 Hình 3.6 Khảo sát độ bền pH β- galatosidase cố định hạt chitin pH khác 43 Hình 3.7 Kết TLC q trình chuyển hố gián đoạn β- galactosidase cố định 49 Hình 3.8 Khả tái sử dụng β- galactosidase tái tổ hợp cố định chitin 50 Hình 3.9 Ảnh hưởng hoạt độ đến chuyển hoá lactose IE (a) IE2(b) 52 Hình 3.10 Ảnh hưởng tốc độ cấp dịch chất đến chuyển hoá lactose IE1(a) IE2 (b) 53 Hình 3.11 Kết TLC sản phẩm chuyển hóa lactose dạng liên tục thời điểm cân hoạt độ enzyme tốc độ cấp dịch chất khác 54 Hình PL1: Đường chuẩn oNPG 63 Hình PL2: Đồ thị xác định thơng số động học Km Vm β- galactosidase cố định chitin với chất oNPG 64 Hình PL3: Đồ thị xác định thông số động học Km Vm β- galactosidase với chất lactose 64 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu viết tắt Lac oNPG ONP GOS β- gal ChBD CBD 10 11 Rpm OD U SDS- PAGE 12 13 14 15 16 17 18 19 TLC MOPS EDTA NaPP Glc Gal Lac IE1 20 IE2 Tên đầy đủ Lactose o- nitrophenyl- β- D- galactopyranoside Ortho- nitrophenolate Galacto- oligosaccharide β- galactosidase Trình tự liên kết chitin(Chitin binding domain) Trình tự liên kết cellulose (Cellulose binding domain/ Carbohydrate binding domain) Round per minute ( vòng/phút) Mật độ quang Đơn vị hoạt độ enzyme Điện di gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) 3- morpholinopropane-1- sulfonic acid Ethylene diamine tetra acetic acid Dung dịch đệm NaH2PO4 Glucose Galactosidase Lactose Immobilized enzyme (β- galactosidase LacLMChBD cố định chitin) Immobilized enzyme (β- galactosidase ChBDLacLM cố định chitin) Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành 3.3.6 Khả tái sử dụng enzyme cố định Một ưu điểm vượt trội enzyme cố định so với enzyme tự khả tái sử dụng chúng Trong nghiên cứu này, tiến hành kiểm tra khả tái sử dụng enzyme sau nhiều lần sử dụng cho chuyển hóa lactose gián đoạn 30oC với hoạt độ enzyme 5UoNPG/ml Khả chuyển hố enzyme tính dựa theo hàm lượng glucose sản phẩm kết biểu diễn hình 3.8 Hình 3.8 Khả tái sử dụng β- galactosidase tái tổ hợp cố định chitin Từ đồ thị hình 3.8 cho thấy, sau lần tái sử dụng, IE1 có khả chuyển hóa (tính theo hàm lượng glucose sản phẩm) đến 50% giảm xuống 20% sau lần tái sử dụng Điều gần tương tự kết nghiên cứu khả tái sử dụng levansucrase cố định chitin theo cách tương tự nhờ trình tự ChBD Enzyme có khả tạo 90% lượng levan sau lần tái sử dụng 50% PHẠM MAI LAN -50- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành sau lần tái sử dụng [47] Tuy nhiên, so sánh với D- hydantoinase chitin nhờ ChBD cho khả tái sử dụng đến 15 lần đạt đến 90% lượng chuyển hố [8], số lần tái sử dụng enzyme nghiên cứu thấp Ngược lại, IE2 có khả chuyển hóa 50% sau lần tái sử dụng giảm khoảng 30% sau lần Như vậy, IE2 có khả tái sử dụng so với loại enzyme lại 3.4 Đánh giá khả chuyển hóa lactose liên tục 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng hoạt độ enzyme Chúng tiến hành xác định ảnh hưởng hoạt độ enzyme tới q trình chuyển hóa lactose liên tục bình phản ứng tích 100ml với hoạt độ khác tốc độ cấp dịch chất 0,1ml/phút nồng độ lactose ban đầu 135 mM nhiệt độ chuyển hóa 30oC Các mẫu lấy định kỳ sử dụng để phân tích thành phần glucose galactose HPLC Kết thu sau: PHẠM MAI LAN -51- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành Hình 3.9 Ảnh hưởng hoạt độ đến chuyển hoá lactose IE1 (a) IE2 (b) Từ hình 3.9 cho thấy, hai enzyme, hoạt độ enzyme cao, khả thủy phân lactose enzyme cao Hàm lượng glucose galactose tăng dần đầu đạt cân 16- 18 IE1, 6- IE2 Với hoạt độ enzyme ban đầu 20U/ml, hàm lượng đường glucose galactose sản phẩm gấp ~1,8 lần so với hoạt độ 10U/ml (11,42g/l glucose với IE1 10,32g/l với IE2) Như vậy, hoạt độ enzyme 20U/ml có khả thủy phân chủ yếu Trong đó, với hoạt độ 10U/ml, hàm lượng sản phẩm thành phần thu có chứa GOS 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ cấp dịch chất: Để đánh giá ảnh hưởng tốc độ cấp dịch chất vào đến chuyển hóa lactose β- galactosidase tái tổ hợp cố định chitin, tiến hành thực PHẠM MAI LAN -52- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành trình chuyển hóa với hai tốc độ 0,05 ml/phút 0,1 ml/phút với hoạt độ enzyme 10U/ml bình phản ứng 100ml nồng độ lactose ban đầu 135 mM Các mẫu lấy định kỳ sử dụng để phân tích thành phần glucose galactose sản phẩm chuyển hóa HPLC Kết biểu diễn hình 3.10 Hình 3.10 Ảnh hưởng tốc độ cấp dịch chất đến chuyển hoá lactose IE1(a) IE2 (b) Kết hình 3.10 cho thấy, với tốc độ cấp dịch chất thấp, sản phẩm chuyển hóa tạo cao thời gian lưu sản phẩm bình phản ứng Khả chuyển hóa lactose IE1 hai tốc độ 0,05ml/phút 0,1ml/phút đạt cân sau 16- 18 giờ, với IE2 6- Với tốc độ dòng vào 0,05ml/phút, hàm lượng đường sản phẩm glucose galactose thu IE1 khoảng 13,16g/l glucose 10,24g/l galactose; IE2 12,46g/l glucose 9,4g/l galactose Trong đó, với tốc độ 0,1 ml/phút, hàm lượng glucose 11,68 g/l galactose 8,76g/l PHẠM MAI LAN -53- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành với IE1; 10,323g/l glucose 7,522g/l với IE2 Có thể nói, khả chuyển hóa lactose tốc độ 0,05ml/phút tốt so với 0,1ml/phút 3.4.3 Kết phân tích định tính TLC sản phẩm q trình chuyển hóa lactose Các mẫu lấy định kỳ từ q trình chuyển hóa lactose nói sử dụng để phân tích định tính TLC biểu diễn hình 3.11 Hình 3.11 Kết TLC sản phẩm chuyển hóa lactose dạng liên tục thời điểm cân hoạt độ enzyme tốc độ cấp dịch chất khác Từ hình 3.11, kết cho thấy, sản phẩm chuyển hóa lactose liên tục bình phản ứng enzyme cố định IE1 IE2 có chứa GOS Tuy nhiên, với hoạt độ 20U/ml, trình thủy phân diễn nhanh chóng tạo thành đường đơn glucose galactose, lượng GOS không đáng kể, sau đạt cân bằng, hàm lượng lactose gần PHẠM MAI LAN -54- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành hết (khơng tạo băng vị trí tương ứng) Như vậy, hoạt độ enzyme cao (20U/ml), trình chuyển hóa lactose liên tục diễn chủ yếu theo hướng thủy phân Do đó, định hướng sản phẩm chuyển hóa đường đơn nên sử dụng hoạt độ enzyme cao Kết phù hợp với kết khảo sát ảnh hưởng hoạt độ enzyme tới chuyển hoá lactose phần 3.3.1 Ở hoạt độ, với tốc độ cấp dịch chất 0,05ml/phút, nồng độ sản phẩm tạo cao tốc độ 0,1ml/phút, lactose chuyển hóa triệt để hơn, điều phù hợp với lý thuyết, tốc độ nhỏ dẫn đến thời gian lưu chất thiết bị phản ứng dài tiếp xúc enzyme chất dài So sánh với chuyển hóa gián đoạn, thời gian tiếp xúc chất với enzyme ngắn hơn, sản phẩm chuyển hoá liên tục tạo tách khỏi hỗn hợp phản ứng, khơng có hội để tiếp xúc với phức hợp enzyme – chất để thực phản ứng chuyển gốc galactosyl tạo sản phẩm GOS Do phương án liên tục phù hợp với hướng thủy phân tạo monosaccharide PHẠM MAI LAN -55- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN: Sau trình nghiên cứu, thực đề tài “Nghiên cứu cố định βgalactosidase từ Lactobacillus hạt chitin ứng dụng chuyển hóa lactose”, rút kết luận sau: Đã xác định khả cố định hai enzyme β- galactosidase tái tổ hợp cố định hạt chitin, đó, IE1 gần cố định hoàn toàn chitin IE2 có khoảng 50% cố định Hoạt tính cịn lại sau cố định hạt IE1 IE2 48% 13% tương ứng Nhờ tính đặc hiệu chitin binding domain (ChBD), tinh diễn đồng thời với trình cố định Về bản, hai enzyme β- galactosidase cố định chitin khơng có khác biệt rõ ràng với nhau, nhiên, thể khác biệt với enzyme tái tổ hợp dạng tự do, đặc biệt độ bền enzyme cố định tốt hơn: nhiệt độ, sau 75- 80 giờ, hoạt độ enzyme giữ 50% 30oC, lại không bền nhiệt độ tối ưu chúng 50-60oC Đối với pH, enzyme bền pH 6- 6,5 khoảng pH tối ưu chúng Đã xác định thông số động học enzyme cố định, lực lactose IE1 (Km = 16,25mM) mạnh so với IE2 (Km = 39,45mM) lại so với lực enzyme tự nhiên Phương thức chuyển hóa gián đoạn liên tục enzyme cố định sử dụng cho phép tạo phổ sản phẩm khác nhau, phương án liên tục tạo sản phẩm thủy phân Các enzyme cố định tái sử dụng nhiều lần cho chuyển hóa gián đoạn sử dụng cho chuyển hóa liên tục thời gian dài PHẠM MAI LAN -56- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành B KIẾN NGHỊ:  Tiếp tục xác định khả bám dính β- galactosidase tái tổ hợp hạt chitin để đánh giá độ bền liên kết cấu tử enzyme  Nghiên cứu trình chuyển hóa lactose liên tục dạng cột  Tiếp tục đánh giá phổ sản phẩm GOS tạo phương pháp phân tích thích hợp PHẠM MAI LAN -57- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 Alka Dwevedi, Arvind M Kayastha, (2009), "Optimal immobilization of betagalactosidase from Pea (PsBGAL) onto Sephadex and chitosan beads respone surface methdology and its applications", Bioresource Technology, Vol 100: p 2667- 2675 Barbara Splechtna, Thu- Ha Nguyen, Marlene SteinBock, Klaus D Kulbe, Werner Lorenz, and Dietmar Haltrich, (2006), "Production of Prebiotic GalactoOligosaccharides from Lactose Using beta-Galactosidases from Lactobacillus reuteri", Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 54: p 4999- 5006 Bradford, M.M, (1976), "A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding.", Anal Biochem., Vol 72: p 248- 254 Britton H.T.S, Robinson R.A, (1931), "Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal", J Chem Soc.: p 1456- 1462 Burvall A, A N., Dahlqvist A., (1979), "Oligosaccharide formation during hydrolysis of lactose with Saccharomyces lactis lactase (Maxilact)", Food Chem , Vol 4,(4): p 243- 250 Cohen- Kupiec, R and Chet, I., Curr, (1998), "The molecular biology of chitin digestion", Curr Opin Biotechnology, Vol 9,(3): p 270- 277 Chen CW, O- Y C, Yeh CW, (2003), "Synthesis of galacto- oligosaccharides and transgalactosylation modeling in reverse micelles", Enzyme Microb Technol., Vol 33,(4): p 497- 507 Chern JT, Chao YP, (2005), "Chitin- binding domain based immobilization of D- hydantoinase", J Biotechnology, Vol 117: p 267-275 Chung- Jen Chiang, Jen- You Wang, Po- Ting Chen, Yun- Peng Chao, (2009), "Enhanced levan production using chitin- binding domain fused levansucrase immobilized on chitin beads", Biotechnological products and process engineering Vol 82: p 445- 451 De Man; J.C.; Rogosa, M.; Sharpe, M.E., (1960), "A medium for the cultivation of lactobacilli", J Appl Bacteriol Vol 23: p 130- 135 Elisabeth Halbmayr, Geir Mathiesen, Thu- Ha Nguyen, Clemens, Peterbauer, Vincent Eijsink and Dietmar Haltrich, "High- level expression of recombinnant beta- galactosidase in Lactobacillus plantarum and Lactobacillus sakei using a sakacin P- based on expression system", Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 56: p 4710- 4719 Francisco J, A., C., Staphopoulos, R A J Warren, D G Kiburn, and G Georgion, (1993), "Specific adhesion and hydrolysis of cellulose by intact PHẠM MAI LAN -58- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành Escherichia coli expressing surface anchored cellulose or cellulose binding domain", Bio/Technology, Vol 11: p 491- 495 Gekas V., Lo'pez-Leiva, (1985), "Hydrolysis of lactose: A literature review", Process Biochemistry: p 2-12 Greenberg NA, M.R., (1983), "Formation of oligosaccharides by betagalactosidase from Streptococcus thermophilus", Food Chem., Vol 10,(3): p 195- 204 Gibson GR, Probert HM, Van Loo J, Rastall RA, Roberfroid MB, (2004), "Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics", Nutr Res Rev, Vol 17,(2): p 259- 275 Gibson GR, Roberfroid MB, (1995), "Dietary modulation of the human colonic microbiota- introducing the concept of prebiotics", J Nutr Vol 125,(6): p 14011412 Hashimoto, M., T Ikegami, S Seino, N Ohuchi, H Fukada, J Sugiyama, M Shirakawa, and T Watanabe, (2000), "Expression and characterization of the chitin- binding domain of chitinase A1 from Bacillus circullans WL-12", J Bacteriol, Vol 182: p 3045- 3054 Huber RE, Kurz G, Wallenfels K., (1976), "A Quantitation of factors which affect hydrolase and transgalactosylase activities of beta- galactosidase (E coli) on lactose", Biochemistry Journal, Vol 15: p 1994- 2001 Ito, M., Deguchi, Y., Matsumoto, K., Kimura, M., Onodera, N., & Yajima, T., (1993), "Influence of galactooligosaccharides on the human fecal microflora", Journal of Nutrional Science and Vitaminology Vol 39: p 635- 640 Iwasaki K, N.M., Nakao S, (1996), "Galacto- oligosaccharide production from lactose by an enzymatic batch reaction using beta- galactosidase", Process Biochemistry, Vol 31,(1): p 69- 76 Jen-You Wang, Yun-Peng Chao, (2006), "Immobilization of Cells with Surface-Displayed Chitin-Binding Domain", Appl Environ Microbiol., Vol.72,(1): p 927- 931 Jorgensen F, H.O, Stougaard P, (2001), "High- effeciency synthesis of oligosaccharides with a truncated beta- galactosidase from Bifidobacterium bifidum ", Appl Microbiol Biotechnol, Vol 57,(5- 6): p 647- 652 Kondo A, Teshima T, (1995), "Preparation of immobilized enzyme with high activity using affinity tag based on proteins A and G", Biotechnol Bioengr, Vol.46: p 421 Levy, L., and O Shoseyov, (2002), "Cellulose- binding domain: biotechnology applications", Biotechnol Adv, Vol 20: p 191- 213 M Harada, M Inohara, M Nakao, T Nakayama, A Kakudo, Y Shibano, and T Amachi, (1994), "Divalent metal ion requirements of a thermostable PHẠM MAI LAN -59- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành multimetal beta-galactosidase from Saccharopolyspora rectivirgula ", J Biol Chem., Vol 269,(22021- 22026) M Leahy, S Fanning, F O'Gara, and D.Sheehan, (1991), "Effect of divalent metal cations on Rhizobium meliloti beta-galactosidase", Biochem Soc.Trans., Vol 19 Nakayama T & Amachi T., (1999), "beta- galactosidase, enzymology" Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseperation, ed John Wilson and Sons Vol New York Nguyen TH, S.B., Krasteva S, Kneifel W, Kulbe KD, Divne C, Haltrict D, (2007), "Characterization and molecular cloning of a heterodimeric betagalactosidase from the probiotic strain Lactobacillus acidophilus R22", FEMS Microbiology Lett, Vol 269,(1): p 136- 144 Nguyễn Tiến Thành, Alexie Barey, Đặng Thị Kiều Trang, Phạm Mai Lan, Nguyễn Thị Hiền, (2013), "Tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp betagalactosidase tái tổ hợp từ Lactobacillus reuteri biểu vật chủ Lactobacillus plantarum WCFS1." in Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội Pessela BCC, Fernández- Lafuente R, Fuentes M, Vián A, Garc´ıa JL, Carrascosa AV, Mateo C, Guisán JM , (2003), "Reversible immobilization of a thermophilic beta- galactosidase via ionic adsoption on PEI- coated sepabeads", Enzyme and Microbial Technology, Vol 32: p 369 - 374 Prenosil, J E., Stuker, E., Bourne, (1987), "Formation of oligosaccharides during enzymatic lactose: Part I: State of art", Biotechnol Bioeng., Vol 30: p 1019- 1025 Prenosil, J E., Stuker, E., Bourne JR, (1987), "Formation of oligosaccharides during enzymatic lactose hydrolysis and their importance in a whey hydrolysis process", Biotechnol Bioengr, Vol 30,(9): p 1026- 1031 Rabiu BA, J A, Gibson GR, Rastall RA, (2001), "Synthesis and fermentation properties of novel galacto- oligosaccharides by beta- galactosidases from Bifidobacterium", Appl Microbiol Biotechnol, Vol 67,(6): p 2526- 2630 Raikhel, N.V., Lee, H.I., and Broekaert, W.F., Annu, (1993), "Structure and function of chitin-binding proteins", Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, Vol.44: p 591- 615 Sanaullah Iqbal, Thu- Ha Nguyen, Hoang Anh Nguyen, Tien Thanh Nguyen, Thomas Maischberger, Roman Kittl, Dietmar Haltrich, (2011), "Characterization of a Heterodimeric GH2 beta- galactosidase from Lactobacillus sakei Lb790 and Formation of Prebiotic Galactooligosaccharides", J Agric Food Chem., Vol 59: p 3803- 3811 Sanaullah Iqbal, Thu- Ha Nguyen, Tien Thanh Nguyen, Thomas Maischberger, Dietmar Haltrich, (2010), "Beta- galactosidase from Lactobacillus plantarum PHẠM MAI LAN -60- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành WCFS1: biochemical characterization and formation of prebiotic galactooligosaccharides", Carbonhydrate Research Vol 345: p 1408- 1416 Smart, J.B., (1991), "Transferase activity of the beta- galactosidase from Streptococcus thermophilus ", Appl Microbiol Biotechnol, Vol.34: p 495- 501 Tien-Thanh Nguyen, Hoang Anh Nguyen, Sheryl Lozel Arreola, Georg Mlynek, Kristina Djinović-Carugo, Geir Mathiesen, Thu-Ha Nguyen, Dietmar Haltrich, (2012), "Homodimeric β-galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus DSM 20081: expression in Lactobacillus plantarum and biochemical characterization", Journal of Agricultural and Food Chemistry Toba T, A.S., (1978), "Hydrolysis of lactose by microbial beta- galactosidases formation of oligosaccharides with special reference to - - beta- Dgalactopyranosyl- D- glucose", J Dairy Sci, Vol 61,(1): p 33 - 38 Toru Nakayama, Teruo Amachi, (1999), "beta-galactosidase, enzymology" Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, ed M.C Flickinger, Drews, S.W., Eds., New York: John Willey Thu- Ha Nguyen, Barbara Splechtna, Marlene Steinbock, Wolfgang Kneifel, Hans Peter Lettner, Klausd Kulbe, and Dietmar Haltrich, (2006), "Purification and Characterization of Two Novel beta-Galactosidases from Lactobacillus reuteri", Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 54: p 4989−4998 Wang, A., A Mulchandani, and W Chen, (2001), "Whole- cell immobilization using cell- surface- exposed cellulose- binding domain", Biotechnol Prog, Vol.17: p 407- 411 Wilhelm Tischer, Frank Wedekind, (1999), "Immobilized Enzymes: Methods and Applications", Current Chemistry, Vol 200 Yoshihiro Kikkawa, Hideo Tokuhisa, Hajime Shinga, Tomohiro Hiraishi, Hirohiko Houjou, Masatoshi Kanesato, Tadayuki Imanaka, and Takeshi Tanaka, (2008), "Interaction Force of Chitin- Binding Domains onto Chitin Surface", Biomacromolecules, Vol 9: p 2126- 2131 Alander M., Mättö, J., Kneifel, W., Johanson, M Kögler, B., Critenden, R., et.al., (2001), "Effect of galacto- oligosaccharide supplementation on human faecal microflora and on survival and persistence of Bifidobacterium lactis Bb12 in the gastronintestinal tract ", International Dairy Journal, Vol 11: p 817825 C.H Taron J.S Benner, L.J Hornstra, and E.P Guthrie, (1995), "A novel betagalactosidase gene isolated from the bacterium Xanthomonas- Manihotis exhibits strong homology to several eukaryotic beta- galactosidases", Glycobiology, Vol 5: p 603-610 Chao Chung-Jen Chiang & Jen-You Wang & Po-Ting Chen & Yun-Peng, (2009), "Enhanced levan production using chitin-binding domain fused PHẠM MAI LAN -61- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành levansucrase immobilized on chitin beads", Biotechnological products and process engineering Vol 82: p 445-451 Duarte P.M Torres Maria Pilar F Gonc¸alves, Jos´e A Teixeira, and L´ıgia R Rodrigues, (2010), "Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics", Food Science and Food Safety, Vol 9: p 438- 454 Đặng Thị Thu ( chủ biên) Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, (2012), "Công nghê Enzyme" Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Ganzle MG Haase G, Jelen P , (2008), "Lactose: crystallization, hydrolysis, and value- added derivates ", Int Dairy Journal, Vol 18: p 685- 694 Gunasekaran S Sheik Asraf and P., (2010), "Current trends of ß-galactosidase research and application", Applied Microbiology and Microbial Biotechnology: p 880- 890 Henrissat B., (1991), "A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochemistry Journal, Vol 280,(2): p 309-316 J Jenkins L Lo-Leggio, G Harris, and R Pickersgill, (1995), "β-glucosidase, βgalactosidase, family A cellulases, family F xylanases and two barley glycanases form a superfamily of enzymes wit 8-fold β/α architecture and with two conserved glutamates near the carboxy-terminal ends of β-strands four and seven", FEBS Lett , Vol 362,(3): p 281- 285 K Gutshall K Wang, and J E Brenchley, (1997), "A novel Arthrobacter βgalactosidase with homology to eucaryotic β-galactosidases", J Bacteriol, Vol.179: p 3064- 3067 K.R Gutshall D.E Trimbur, J.J Kasmir, and J.E Brenchley, (1995), "Analysis of a novel gene and β-galactosidase isozyme from a psychrotrophic Arthrobacter isolate", J Bacteriol, Vol 177: p 1981-1988 Kunst A.; Draeger, B.; Ziegenhorn, J., "Colourimetric methods with glucose oxidase and peroxidase ", in Methods of Enzymatic Analysis H.U; J.; GraBl Bergmeyer, M., Editor 1988, VCH Pulishers: Weinheim, Germany p 178185 Mahoney R R., (1998), "Galactosyl- oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: A review", Food Chem., Vol 63: p 147- 154 Manucci Federica, (2009), Enzymatic synthesis of galactooligosaccharides from whey permeate Nisha S Arun Karthick S and Gobi N, (2012), "A Review on Methods, Application and Properties of Immobilized Enzyme", Chemical Science Review and Letters: p 148- 155 Ong E Gilkes NR, Antony R, Warren J, Miller RC Jr, Kilburn DG, (1989), "Enzyme immobilization using the cellulose-binding domain of a cel-lulomonas fimi exoglucanase", Bio/Technology, Vol 7: p 604-607 PHẠM MAI LAN -62- Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành PHỤ LỤC Phương trình đường chuẩn oNPG:  Cách tiến hành: - Pha ONP (ortho- nitrophenol) nồng độ khác nhau: 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; mM - Lấy 375µl Na2CO3 bổ sung vào 250µl ONP với nồng độ khác - Đo độ hấp thụ quang học hỗn hợp bước sóng 420nm - Dựa vào giá trị thu được, xây dựng đường chuẩn oNPG: 2.5 Abs420nM 2.0 y = 1.1828x + 0.019 R2 = 0.9993 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 Concentration (mM) Hình PL1: Đường chuẩn oNPG PHẠM MAI LAN -63- 2.0 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật GVHD: TS Nguyễn Tiến Thành Đồ thị xác định thông số động học β- galactosidase tái tổ hợp cố định chitin: Hình PL2: Đồ thị xác định thông số động học Km Vm β- galactosidase cố định chitin với chất oNPG Hình PL3: Đồ thị xác định thơng số động học Km Vm β- galactosidase với chất lactose PHẠM MAI LAN -64- ... tốt cho việc ứng dụng enzyme cố định chitin vào chuyển hóa lactose, chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu cố định β- galactosidase từ Lactobacillus hạt chitin ứng dụng chuyển hóa lactose? ?? Đề.. .B? ?? GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC B? ?CH KHOA HÀ NỘI - PHẠM MAI LAN NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH β- GALACTOSIDASE TỪ LACTOBACILLUS TRÊN HẠT CHITIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN HÓA... β- galactosidase cố định hạt chitin - Đánh giá khả chuyển hóa lactose enzyme cố định Nội dung đề tài, vấn đề cần giải quyết: - Nghiên cứu cố định β- galactosidase hạt chitin - Nghiên cứu chuyển