BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM pdf

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chủ nhiệm đề tài: VŨ NGUYÊN THÀNH 7309 23/4/2009 HÀ NỘI - 2009 BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM - NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THƯỜNG XUYÊN KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chủ nhiệm: PGS TS Vũ Nguyên Thành Cộng tác viên ThS Ngô Thanh Xuân (ĐH Sư phạm HN) ThS Dương Anh Tuấn (Viện CNTP) CN Nguyễn Thanh Thủy (Viện CNTP) CN Đào Anh Hải (Viện CNTP) ThS Đinh Mỹ Hằng (Viện CNTP) ThS Nguyễn Hương Giang (Viện CNTP) TS Mai Thị Hằng (ĐH Sư phạm HN) Hà nội, tháng 12 năm 2008 MỤC LỤC KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT TỔNG QUAN 1.1 CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI 1.2 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.3 ĐỐI TƯỢNG/PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.4.1 Axit phytic 1.4.2 Enzyme phân giải phytate (phytase) 1.4.2.1 Nguồn phytase 1.4.2.2 Đặc điểm phytase 1.4.2.3 Ứng dụng phytase 12 1.4.3 Nghiên cứu chuyển gene mã hóa phytase 15 1.4.3.1 Gene mã hoá phytase 15 1.4.3.2 Một số thành tựu chuyển gene mã hóa phytase 16 1.4.4 Hệ biểu 20 1.4.4.1 Các hệ biểu phổ biến 20 1.4.4.2 Đặc điểm hệ biểu P pastoris 21 1.4.4.3 Cấu trúc vector biểu P pastoris 22 1.4.4.4 Quá trình tiết protein ngoại bào P pastoris 24 THỰC NGHIỆM 26 2.1 NGUYÊN LIỆU 26 2.1.1 Chủng vi sinh vật 26 2.1.2 Plasmid 26 2.1.3 Hoá chất 26 2.1.4 Môi trường nuôi cấy dung dịch đệm .27 2.1.4.1 Môi trường nuôi cấy 27 2.1.4.2 Dung dịch đệm 27 2.1.5 Thiết bị 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Tách chiết ADN 28 2.2.1.1 Tách chiết ADN genome Aspergillus Pichia 28 2.2.1.2 Tách chiết plasmid 28 2.2.2 PCR 29 2.2.3 Xác định trình tự gene 30 2.2.4 Ghép nối plasmid 30 2.2.5 Biến nạp ADN 30 2.2.5.1 Biến nạp vào E coli sốc nhiệt 30 2.2.5.2 Biến nạp P pastoris xung điện 31 2.2.6 Tuyển chọn dòng mang gene biến nạp 32 2.2.7 Biểu gene P pastoris 32 -1- 2.2.8 Xác định hoạt tính phytase 32 2.2.9 Phương pháp xác định protein tổng số (Bradford) 35 2.3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 36 2.3.1 Thiết kế vector thể phyA không chứa đuôi His-tag C-myc-epitope (phyAs) 38 2.3.1.1.Thiết kế mồi 38 2.3.1.2 Nhân dòng gene 39 2.3.1.3 Tinh sản phẩm PCR 39 2.3.1.4 Gắn phyAs vào vector biểu pPICZαA 40 2.3.1.5 Kiểm tra có mặt phyAs có E coli PCR colony 42 2.3.1.6 Tách chiết phasmid 43 2.3.2 Kiểm tra trình tự thiết kế vị trí liên kết 44 2.3.3 Chuyển vector biểu pPICZαA/phyAs vào P pastoris 45 2.3.3.1 Mở vòng pPICZαA/phyAs 45 2.3.3.2 Biến nạp vector biểu pPICZαA/phyAs/Pme I vào P pastoris 46 2.3.4 Biểu phyAs P pastoris 48 2.3.5 Tuyển chọn chủng biến nạp có hoạt tính phytase cao 51 2.3.6 Tuyển chọn chủng biến nạp mang multicopy 52 2.3.7 Xác định điều kiện lên men thu hồi phytase 55 2.3.7.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ methanol 55 2.3.7.2 Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy đến khả biểu phytase 56 2.3.8 Nghiên cứu so sánh đặc tính phytase tái tổ hợp 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 3.1 KẾT LUẬN 64 3.2 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 72 -2- KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT AOX - Alcohol Oxidase BSA - Bovine Serum Albumin CNTP – Sưu tập giống vi sinh vật Viện Công nghiệp Thực phẩm cDNA – Copy DNA CS – Cộng FIRI – Food Industries Research Institute (Viện Công nghiệp Thực phẩm) ITS – Internal Transcribed Spacer JCM – Japan Collection of Microorganisms (Bảo tàng giống Vi sinh vật Nhật Bản) JICA - Japan International Cooperation Agency KDa – Kilo Dalton HIV – Human Immunodeficiency Virus MALDI-TOF – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (kỹ thuật khối phổ peptid dựa ion hóa tia laser) MW – Molecular weight (trọng lượng phân tử) NMR - Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) Mut – Methanol utilization NRRL - Northern Regional Research Laboratory (hiện National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) OD - Optical Density (mật độ quang) PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di polyacrylamide) PCR - Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) PDA - Potato Dextrose Agar Pvc – Phospho vô SDS- Sodium Dodecyl Sulfate TCA - Trichloroacetic Acid U - Unit (đơn vị) -3- TỔNG QUAN 1.1 CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI Đề tài thực theo hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ với mã số: 07.08.QG/HĐ-KHCN Bộ Công nghiệp Viện Công nghiệp Thực phẩm ký ngày 20/02/2008 (bản photo hợp đồng trang cuối) Trong q trình thực đề tài cịn nhận hỗ trợ bổ sung từ SIDA/SAREC thông qua dự án “Nghiên cứu sử dụng phế thải nông nghiệp để sản xuất enzyme vi sinh vật cho chăn nuôi gia súc, gia cầm Việt Nam” TS Mai Thị Hằng (Đại học Sư phạm Hà Nội) làm chủ nhiệm 1.2 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Phytase enzyme có nhiều ứng dụng thực tiễn Trong chăn nuôi, bổ sung phytase riêng với enzyme khác làm tăng trọng lượng vật ni Phytase mặt có tác dụng làm giảm tác động kháng dinh dưỡng axit phytic, làm giảm chi phí phần khơng cần thiết bổ sung phốt vô vào thức ăn; mặt khác làm giảm lượng phốt dư thừa thải qua phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn ni bền vững [Simell CS., 1989] Ngoài ứng dụng quan trọng chăn nuôi, phytase bắt đầu sử dụng thực phẩm người, điều chế dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, sử dụng công nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [Ashima, 2000] Trên giới, có nhiều nghiên cứu phytase vi sinh vật, từ mức sơ tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính đến mức phân tử nhân dịng, giải trình tự, biểu gene, cung cấp chủng giống tái tổ hợp cho sản xuất qui mô công nghiệp Việt Nam sở hữu nguồn gene vi sinh vật phong phú chưa khai thác cách có hiệu Một lý vi sinh vật phân lập từ môi trường khơng qua chọn lọc, cải tạo khó ứng dụng sản xuất công nghiệp Những nghiên cứu phytase Việt Nam giai đoạn bắt đầu 1.3 ĐỐI TƯỢNG/PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài thực với nội dung tách dịng gene mã hóa phytase từ vi sinh vật bảo tồn lưu giữ nhằm cung cấp nguyên liệu di truyền cho việc tạo chủng sinh phytase tái tổ hợp phục vụ sản xuất Đề tài bao gồm phần cơng việc sau: - Thiết kế vector thể phyA không chứa đuôi His-tag c-myc-epitope - Kiểm tra trình tự thiết kế vị trí liên kết - Biến nạp đa phyA vào P pastoris - Thể phyA P pastoris - Xác định điều kiện lên men thu hồi phytase -4- 1.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 1.4.1 Axit phytic Axit phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexakis dihydrogen phosphate; công thức hóa học C6H18O24P6; phân tử lượng 659,86) dạng dự trữ phốt chủ yếu ngũ cốc, họ đậu loại hạt chứa dầu Axit phytic thực vật không tồn tự mà thường tạo muối phytate với số nguyên tố khoáng Mg, K, Ca, tham gia liên kết với protein Hình Muối phytate liên kết với ion kim loại protein Trong hạt cây, axit phytic có vai trị sinh lý như: (1) Nguồn dự trữ phốt pho; (2) Nguồn dự trữ lượng; (3) Nguồn ion dương (cation); (4) Nguồn cung cấp myo-inositol Ngồi ra, axit phytic cịn có vài chức khác chất chống oxy hóa giai đoạn nghỉ hạt [Graf CS., 1987] Axit phytic tồn dạng muối cation hóa trị hay cation hố trị hai (ví dụ muối K-Mg phytate có gạo muối Ca-K-Mg phytate đậu tương) Axit phytic thơng thường tổng hợp q trình chín hạt xảy đồng thời với tổng hợp hợp chất tích trữ khác tinh bột lipid Trong ngũ cốc họ đậu, axit phytic tổng hợp hạt Alơron (Aleurone) tinh thể hình cầu [Reddy CS., 1989] Phytate khơng có mặt nội nhũ lúa mỳ lúa nước mà tập trung mầm lớp vỏ Alơron tế bào hạt Ở đậu Hà Lan, 99% phytate hạt tìm mầm 1% phơi mầm Ngơ loại ngũ cốc có hàm lượng phytate cao (chiếm 0.83 – 2.22% khối lượng hạt) Trong số họ đậu, đậu dolique (dolique beans) có hàm lượng phytate cao (5.92 – 9.15% khối lượng hạt) [Reddy CS., 1989] Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dưỡng mạnh động vật Do cấu trúc phân tử đặc biệt (Hình 1), axit phytic liên kết chặt chẽ với protein, nguyên tố khoáng tạo thành phức hợp khơng tan đường tiêu hóa Hiệu ứng dẫn đến ức chế q trình tiêu hố protein hạn chế khả hấp thụ ion -5- khoáng Ca, Mg, Zn…[Davies, 1982; Reddy CS., 1989] Kẽm nguyên tố vi lượng mà hoạt tính sinh học bị ảnh hưởng lớn axit phytic Thử nghiệm chuột cho thấy axit phytic bổ sung vào thức ăn làm giảm mạnh khả hấp thụ ion Zn2+ trọng lượng chuột [Rimbach Pallauf, 1992] Axit phytic tương tác với protein dải pH rộng để tạo thành phức hợp phytate-protein Dưới điều kiện pH thấp, axit phytic liên kết chặt chẽ với protein thực vật điểm đẳng điện protein dao động khoảng pH 4.0 – 5.0 Trong khoảng pH 6.0 – 8.0, axit phytic phần lớn protein thực vật tích điện âm Tuy vậy, điều kiện này, tạo thành phức hợp axit phytic protein phổ biến [Cheryan, 1980] Liên kết protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, khả bị phân cắt protein làm giảm giá trị dinh dưỡng chúng Hơn nữa, liên kết với muối khoáng, protein, axit phytic tiếp tục tương tác với enzyme tiêu hoá trypsin, pepsin, α-amylase β-galactosidase, làm giảm hoạt tính enzyme [Deshp Cheryan, 1984; Singh Krikorian, 1982; Inagawa CS., 1987] 1.4.2 Enzyme phân giải phytate (phytase) Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc tác phản ứng thủy phân myo-inositol hexakisphosphate (axit phytic) thành gốc phốt phát đơn vô dẫn xuất đơn giản myo-inositol phosphate Trong vài trường hợp phản ứng giải phóng myo-inositol tự (Hình 2) Hình Phản ứng xúc tác enzyme phytase Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành hai dạng là: Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8) Tên đề xuất: 3-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate phosphohydrolase -6- T ên khác: phytase; phytate-3-phosphatase Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26) Tên đề xuất: 6-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase Sự phân loại dựa sở vị trí nhóm phốt phát bị phytase cơng Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) cơng vào nhóm phốt phát vị trí thứ 3; dạng phytase điển hình vi sinh vật enzyme 6-phytase (EC 3.1.3.26) cơng vào nhóm phốt phát số 6; dạng điển hình cho phytase từ thực vật [Ashima, 2000] 1.4.2.1 Nguồn phytase Phytase phổ biến tự nhiên, tìm thấy từ mơ thực vật, động vật nhiều lồi vi sinh vật Phytase từ vi sinh vật Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thường thấy nấm mốc đặc biệt loài thuộc chi Aspergillus Shieh Ware (1968) phân lập tuyển chọn từ đất 2000 loài vi sinh vật để sản xuất phytase Hầu hết chủng sản sinh phytase nội bào, có 30 chủng sinh phytase ngoại bào chúng nấm sợi, 28 chủng thuộc chi Aspergillus, thuộc chi Penicillum thuộc Mucor Trong 28 chủng chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc lồi A niger Những nhóm nghiên cứu khác Howson Davis (1983), Volfova CS (1994) khẳng định A niger loài có khả sản sinh phytase ngoại bào tốt Phytase tìm thấy nhóm vi khuẩn như: Aerobacter aerogenes [Greaves CS., 1967], Pseudomonas sp [Irving Cosgrove, 1971], Bacillus subtilis [Powar Jagannathan, 1982], Klebsiella sp [Shah Parekh, 1990], B subtilis [Shimizu, 1992], Escherichia coli [Greiner CS., 1993], Enterobacter sp [Yoon CS., 1996] B amyloliquefaciens [Kim CS 1998] Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào chủng thuộc chi Bacillus Enterobacter Còn phytase từ E coli lại enzyme nội bào (periplasmic enzyme) Một số nấm men Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis Schwanniomyces castelii, có khả sản sinh phytase [Nayini Markakis, 1984; Sequeilha CS., 1992; Mochizuki Takahashi, 1999] Phytase từ thực vật Phytase tìm thấy rộng rãi giới thực vật Phytase từ số ngũ cốc (lúa mỳ, ngô, lúa mạch, lúa…), họ đậu (cây đậu xanh, đậu lùn, đậu trắng…) -7- tinh mô tả Ngồi ra, phytase tìm thấy mù tạc trắng, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, hạt phấn hoa huệ tây [Dvorakova, 1998] Phytase từ động vật Các nhà khoa học chứng minh có tồn phytase thể động vật dày đơn [Bitar Reinhold, 1972; Copper Gowing, 1983; Yang CS., 1991; Chi CS., 1999] Tuy nhiên, phytase ruột non động vật dày đơn vai trị rõ ràng việc phân giải muối phytate từ thức ăn [Williams Taylor, 1985] Một enzyme giống phytase tìm thấy động vật nguyên sinh Paramecium [Freund CS., 1992] Nguồn gốc số phytase thể bảng Bảng Phytase từ nguồn khác Nguồn phytase Từ nấm Aspergillus niger A flavus A carbonarius A ficuum A flavipes A terreus A carneus A oryzae A fumigatus Mucor sp Penicillum spp Penicillium caseoicolum Rhizopus oligosporus Emericella nidulans Lentines edodes Mycleiophthora thermophila Talaromyces thermophilus Thermomyces lanuginose Trichoderma reessei Từ nấm men Saccharomyces cerevisiae Schwanniomyces castelii Kluyveromyces fragilis Candida tropicalis Torulopsis candida Debaryomyces castelii Nơi định vị Tài liệu tham khảo Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Nội bào ngoại bào Chưa xác định Chưa xác định Chưa xác định Chưa xác định Chưa xác định Chưa xác định Wyss CS (1999) Shieh Ware (1968) Al asheh Duvnjak (1995) Liu CS (1999) Wyss CS (1999) Yamada CS (1968) Ghareib (1990) Wyss CS (1999) Wyss CS (1999) Shieh Ware (1968) Wyss CS (1999) Amano (1995) Sutardi Buckle (1988) Wyss CS (1999) Wyss CS (1999) Pasamontes CS.(1997) Pasamontes CS.(1997) Wyss CS.(1999) Wyss CS (1999) Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Ngoại bào Nayini Markakis (1984) Lambrechts CS (1993) Lambrechts CS (1992) Lambrechts CS (1992) Nakamura CS (2000) Lambrechts CS (1992) -8- 100% 80 80% Hoạt tính (%) 120% 100 Hoạt tính (%) 120 60 40 20 60% 40% 20% 0% 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 1.5 2.5 3.5 4.5 pH A niger P1 5.5 6.5 7.5 8.5 6.5 7.5 8.5 100 80 80 Hoạt tính (%) 120 100 60 40 20 60 40 20 0 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 pH 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 pH KM71H.phAs X33.phyAs 120 100 Hoạt tính (%) KM71H.P1 120 Hoạt tính (%) pH 80 60 40 20 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 pH Phytase thương mại Hình 28 Ảnh hưởng pH lên họat động phytase - 62 - 100% 100% 80% 80% Hoạt tín h (% ) 120% Hoạt tín h (% ) 120% 60% 40% 60% 40% 20% 20% 0% 0% 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100 80 100 Nhiệt độ ( C) Nhiệt độ ( C) A.niger P1 KM71H.P1 84% 84% Hoạt tín h (% ) 105% Hoạt tín h (% ) 105% 63% 42% 21% 63% 42% 21% 0% 0% 20 40 60 80 100 0 20 40 Nhiệt độ ( C) Nhiệt độ ( C) KM71H.phyAs X33.phyAs 105% Hoạt tín h (% ) 84% 63% 42% 21% 0% 20 40 60 60 80 100 Nhiệt độ ( C) Phytase thương mại Hình 29 Khả bền nhiệt phytase - 63 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1 KẾT LUẬN Từ kết đạt được, rút kết luận sau - Đã thành công thiết kế vector thể phyA không chứa đuôi His-tag c-mycepitope, giải trình tự thiết kế vị trí liên kết - Đã biến nạp biểu thành công vector chứa gene ngoại lai (pPICZαA/phyAs) vào hai chủng nấm men P pastoris X-33 KM71H - Đã biến nạp tuyển chọn chủng biến nạp P pastoris X-33 mang multicopy có khả sinh trưởng nồng độ zeocin cao (2000 mg/l) khả biểu protein tái tổ hợp cao - Đã nghiên cứu điều kiện lên men thu hồi phytase với hiệu suất cao Trên môi trường biểu BMM, nồng độ methanol 1%, sau ngày biểu suất phytase ngoại bào đạt 1329 IU/ml, hàm lượng protein đạt 1.71g/l Tăng gấp 22 lần so với kết nghiên cứu năm 2007 2000 lần so với chủng gốc - Đã nghiên cứu đặc tính phytase tái tổ hợp, enzyme họat động tối ưu pH 2.5 pH 5.0, nhiệt độ 60°C Phytase bền nhiệt độ bảo quản thấp 55°C, điều kiện pH 2.0 - 8.0 3.2 KIẾN NGHỊ - Để đáp ứng nhu cầu giống vi sinh vật tái tổ hợp phục vụ sản xuất giai đoạn tới, Sưu tập giống Vi sinh vật, Viện Công nghiệp Thực phẩm cần đầu tư chiều sâu nhân lực trang thiết bị lĩnh vực di truyền - sinh học phân tử - 64 - TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Vũ Duy Giảng (2004) Enzyme thức ăn Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi 3, 11-13 Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007) Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên tái tổ hợp vi khuẩn Bacillus subtilis Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học Hà Nội, 2007 Đỗ Hữu Phương (2004) Vai trị enzyme chăn ni Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi 1, 25-26 Nguyễn Thị Hoài Trâm (2002) Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme sản xuất thức ăn chăn nuôi Báo cáo tổng kết đề tài R-D Bộ Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm, 2002 Ngô Thanh Xuân (2006) Tuyển chọn nghiên cứu sản xuất phytase vi sinh vật bã sắn phế thải để dùng cho chăn nuôi Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học Trường đại học Sư phạm Hà nội, 37-38 Nguyễn Văn Viết (2008) Nghiên cứu biểu gene phyC có nguồn gốc từ Bacillus Subtilis E coli BL21 (DE3) bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ hợp cho chăn nuôi Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học Trường đại học Sư phạm Hà nội, 37-38 TIẾNG ANH A manual of methods for expression of recombinant proteins in P passtoris Pichia Expression Kit (2005) Catalog N0 K1740-01, 1-56 A.S Xiong, Q.H Yao, R.H Peng, P.L Han, Z.M Cheng, Y Li (2005) High level expression of a recombinant acid phytase gene in Pichia pastoris Journal of Applied Microbiology 98 (2), 418-428 Adolphus P G M van Loon (1997) The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila Microbiology 143, 245–252 10 Ai-Sheng Xiong, Quan-Hong Yao, Ri-He Peng, Xian Li, Hui-Qin Fan, Mei-Jin Guo, Si-Liang Zhang (2004) Isolation, Characterization, and molecular cloning of the cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high expression in Pichia pastoris Journal of Biochemistry and Molecular Biology 37(3), 282-291 11 Al Asheh, S and Duvnjak, Z (1994) Characteristics of phytase produced by Aspergillus carbonarius NRC 401121 in canola meal Acta Biotechnol 14, 223-233 12 Amano Pharmaceuticals (1995) Novel Phytase Japan Pat 706, 8-26 - 65 - 13 Anno, T., Nakanishi, K, Matsuno, R., Kamikubo, T (1985) Enzymatic elimination of phytate in soybean milk J Japan Soc Food Sci Technol 32, 174-180 14 Ashima Vohra and T Satyanarayana (2003) Phytase: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications Critical Reviews in Biotechnology 23 (1), 9-60 15 Ashok Pandey, George Szakacs, Carlos R Soccol, Jose A Rodriguez-Leon, Vanete T Soccol (2001) Production, purification and properties of microbial phytases Bioresource Technology 77, 203-214 16 Billington, D C (1993) The Inositol Phosphates Chemical Synthesis and Biological Significance Verlag Chemie, Weinheim 26, 38-42 17 Bitar, K and Reinhold, J G (1972) Phytase and alkaline phosphatase activities in intestinal mucose of rat, chicken, calf, and man Biochim Biophys Acta 268, 442-452 18 Casey A, Walsh G (2004) Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest J Biotechnol 110(3), 313-22 19 Cheryan, M (1980) Phytic acid interactions in food systems CRC Crit Rev Food Sci Nutr 13, 297-335 20 Chi, H., Tiller, G E., Dasouki, M J et al (1999) Multiple inositol polyphosphate phosphatase: evolution as a distinct group within the histidine phosphatase family and chromosomal localization of the human and mouse genes to chromosomes 10q23 and 19 Genomics 56, 324-336 21 Copper, J R and Gowing, H S (1983) Mammalian small intestine phytase Br J Nutr 50, 673-678 22 Craxton, A, Caffrey, J J., Burkhart, W., Safrany, S T and Shears, S B (1997) Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol polyphosphate phosphatase Biochem J 328, 75-81 23 Cromwell, G L., Coffey, R D., Monegue, H J and Randolph, J H (1995) Efficacy of low-activity, microbial phytase in improving the bioavailability of phosphorus in cornsoybean meal diets for pigs J Animal Sci 73, 449-456 24 Cromwell, G L., Stahly, T S., Coffey, R D., Monegue, H J and Randolph, J H (1993) Efficacy of phytase in improving the bioavailability of phosphorus in soybean meal and corn-soybean meal diets for pigs J Animal Sci 71, 1831-1840 25 Delucca, A J., Dischinger, C and Ullah, A H J (1992) Identification of a phytase from Citrobacter freundii Abstr Gen Meet Am Soc Microbiol 92, 385 26 Deshpande, S S and Cheryan, M (1984) Effect of phytic acid, divalent cations, and their interactions on alpha-amylase activity J Food Sci 49, 516-524 27 Dvorakova, J (1998) Phytase: Sources, Preparation and Exploitation Folia Microbiol 43, 323-338 - 66 - 28 Eric Rodriguez, Yanming Han, and Xin Gen Lei (1999) Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/phytase gene (appA2) isolated from pig colon Biochemical and Biophysical Research Communications 257, 117–123 29 Findenegg GR, Nelemans JA (1993) The effect of phytase on the vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots Plant Soil 154, 189-196 30 Freund, W D., Mayr, G W:, Tietz, C and Schultz, J E (1992) Metabolism of inositol phosphates in the protozoan Paramecium Eur J Biochem 207, 359-367 31 Ghareib, M (1990) Biosynthesis, purification, and some properties of extracellular phytase from Aspergillus carneus Acta Microbiol Hung 37, 412-418 32 Ghosh, S (1997) Phytase of a thermophilic mould Sporotrichum thermophile Apinis M sc dissertation, Department of Microbiology, Unirversity of Delhi, Delhi, 442-453 33 Gibson, D M and Ullah, A H J (1988) Purification and characterization of phytase from cotyledons of germinating soybean seeds Arch Biochem Biophys 260, 503-513 34 Graf, E., Empson, K and Eaton, J W (1987) Phytic acid A natural antioxidant J Biol Chem 262, 11647-11651 35 Greaves, M P., Anderson, G and Webley, D M (1967) The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes Biochim Biophys Acta 132, 412-418 36 Greiner, R., Haller, E., Konietzny, U and Jany, K D (1997) Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena Arch Biochem Biophys 341, 201-206 37 Greiner, R., Konietzny, U and Jany, K D (1993) Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli Arch Biochem Biophys 303, 107-113 38 Haefner S, Knietsch A, Scholten E, Braun J, Lohscheidt M, Zelder O (2005) Biotechnological production and applications of phytases Appl Microbiol Biotechnol 68, 588-597 39 Hall, T.A (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp 41, 95-98 40 Han, Y.M., Lei, X.G (1999) Role of glycosylation in the functional expression of an Aspergillus niger phytase (phyA) in Pichia pastoris Archives of Biochemistry and Biophysics 364 (1), 83-90 41 Han Y W and Gallagher, D.J (1987) Phytase production by Apergilus ficuum on semisolid substrate J Ind Microbiol 2, 195-200 42 Han Y W (1988) Removal of phytic axit from soybean and cotton seed meals by A ficuum phytase J Agric Food Chem 36, 1181 - 1183 43 Hara, A., Ebina, S., Kondo, A and Funaguma, T (1985) A new type of phytase from pollen of Typha latifolia L Agric Biol Chem 49, 3539-3544 44 Howson, S J and Davis, R J (1983) Production of phytate-hydrolysing enzyme by fungi Enzyme Microbiol Technol 5, 377-382 - 67 - 45 Inagawa, J., Kiyosawa, I and Nagasawa, T (1987) Effect of phytic acid on the hydrolysis of lactose with beta-galactosidase Agric Biol Chem 51, 3027-3032 46 Irving, G C J and Cosgrove, D J (1971) Inositol phosphate phosphatase of microbial origin Observations on the nature of the active center of a bacterial (Pseudomonas sp.) phytase Austral J Biol Sci 24, p 1559-1564 47 IUPAC-IUB (Commission on Biochemical Nomenclature) (1977) Nomenclature of phosphorus containing compounds of biochemical importance Eur J Biochem 79, 1-9 48 Janne Kerovuo (2000) A Novel Phytase from Bacillus Characterization and Production of the Enzyme Thesis Faculty of Science of the University of Helsinki, 2-18 49 Jareonkitmongol, S., Ohya, M., Watanabe, R., Takagi, H and Nakamori, S (1997) Partial purification of phytase from a soil isolate bacterium, Klebsiella oxytoca MO-3 J Ferment.Bioeng 83, 393-394 50 Jongbloed, A W., Mroz, Z and Kemme, P A (1992) The effect of supplementary Aspergillus niger phytase in diets for pigs on concentration and apparent digestibility of dry matter, total phosphorus, and phytic acid in different sections of the alimentary tract J Animal Sci 70, 1159-1168 51 Joseph M Fernandez James P.Hoeffler (1999) Gen expression System Acedamic press, 158-191 52 Joseph Sambrook, David W Russell (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 1, 3132 53 Joseph Sambrook, David W Russell (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York 2, 112122 54 Kim, Y O., Lee, J K., Kim, H K., Yu, J H and Oh, T K (1998) Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp DS11 and its overexpression in Escherichia coli FEMS Microbiol Lett 162, 185-191 55 Kim, D H, Oh, B C., Choi, W C., Lee, J K and Oh, T K (1999) Enzymatic evaluation of Bacillus amyloliquefaciens phytase as a feed additive Biotech Lett 21, 925-927 56 Kim, Y O., Lee, J K., Oh, B C and Oh, T K (1999) High-level expression of a recombinant thermostable phytase in Bacillus subtilis Biosci Biotechnol Biochem 63, 2205-2207 57 Laboure, A M., Gagnon, J and Lescure, A M (1993) Purification and characterization of a phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during germination Biochem J 295, 413419 58 Lambrechts, C., Boze, H., Moulin, G., Galzy, P (1992) Utilization of phytate by some yeast Biotechnol Lett 14, 61-66 - 68 - 59 Linghua Zhang, Lijia Ana, Xiaorong Gaoa, Yunji Wang (2005) Properties of A ficuum AS3.324 phytase expressed in tobacco Process Biochemistry 40, 213–216 60 Liu, B L., Rafiq, A., Tzeng, Y M and Rob, A (1998) The induction and characterization of phytase and beyond Enzyme Microbiol Technol 22, 415-424 61 Liu, W and Hulett, M (1998) Comparison of PhoP binding to the tuaA promoter with PhoP binding to other Pho-regulon promoters establishes a Bacillus subtilis Pho core binding site Microbiology 144, 1443-1450 62 Markus Wyss, Roland Brugger, Alexandra Kronenberger, Roland Rémy, Rachel Fimbel, Gottfried Oesterhelt, Martin Lehmann, and Adolphus P.G.M van Loon (1999) Biochemical characterization of fungal phytase (myo-Inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): Catalytic properties Applied and Environmental Microbiology 65(2) 367 - 373 63 Maugenest, S., Martinez, I and Lescure, A M (1997) Cloning and characterization of a cDNA encoding maize seedling phytase Biochem J 322, 511-517 64 Maugenest, S., Martinez, I., Godin, B., Perez, P and Lescure, A M (1999) Structure of two maize phytase genes and their spatio-temporal expression during seedling development Plant Mol Biol 39, 503-514 65 Mochizuki, D and Takahashi, H (1999) Method for producing phytase Patent application EP 0931837-A, 327 – 331 66 Nakamura, Y., Fukuhara, H., and Sano, K (2000) Secreted phytase activities of yeasts Biosci Biotechnol Biochem 64 (4), 841-844 67 Nayini, N R and Markakis, P (1984) The phytase of yeast Food Sci Technol 17, 126-132 68 O’Quinn, P R., Knabe, D A and Gregg, E J (1997) Efficacy of Natuphos in sorghumbased diets of finishing swine J Animal Sci 75, 1299-1307 69 Pallauf, J and Rimbach, G (1996) Nutritional significance of phytic acid and phytase Arch Anim Nutr 50, 301-319 70 Pasamontes, L., Haiker, M., Henriquez-Huecas, M., Mitchell, D B and van Loon, A P G M (1997) Cloning of the phytases from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus Biochim Biophys Acta 1353, 217-223 71 Phillippy, B.Q., Mullaney, E.J (1997) Expression of an Aspergillus niger phytase (phyA) in Escherichia coli Journal of Agricultural and Food Chemistry 45 (8), 33373342 72 Powar, V K and Jagannathan, V (1982) Purification and properties of phytatespecific phosphatase from Bacillus subtilis J Bacteriol 151, 1102-1108 73 Randy M Berka, Michael W Rey, Kimberly M Brown, Tony Byun, and Alan V Klotz (1998) Molecular Characterization and Expression of a Phytase Gene from the Thermophilic Fungus Thermomyces lanuginosus Appl Environ Microbiol American Society for Microbiology 64(11), 4423–4427 - 69 - 74 Reddy, N R., Pierson, M D., Sathe, S K and Salunkhe, D K (1989) Phytates is cereals and legumes CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla, 218-227 75 Rimbach, G and Pallauf, J (1992) The effect of a supplement of microbial phytase on zinc availability Z Ernahrungswiss 31, 269-277 76 Sandberg, A S., Hulthen, L R and Turk, M (1996) Dietary Aspergillus niger phytase increases iron absorption in humans J Nutr 126, 476-480 77 Sano, K., Fukuhara, H., and Nakamura Y (1999) Phytase of the yeast Arxula adeninivorans, Biotechnol 21, 33 -38 78 Scott, J J (1991) Alkaline phytase activity in nonionic detergent extracts of legume seeds Plant Physiol 95, 1298-1301 79 Sequeilha, L., Lambrechts, C., Boze, H., Moulin, G and Galzy, P (1992) Purification and properties of the phytase from Schwanniomyces castelii J Ferment Bioeng 74, 711 80 Shah, V and Parekh, L J (1990) Phytase from Klebsiella sp No PG-2: Purification and properties Indian J Biochem Biophys 27, 98-102 81 Shieh, T R and Ware, J H (1968) Survey of microorganisms for the production of extracellular phytase Appl Microbiol 16, 1348-1351 82 Shieh, T R., Wodzinski, R J and Ware, J H (1969) Regulation of the formation of acid phosphatase by inorganic phosphate in Aspergillus ficuum J Bacteriol 100, 11611165 83 Shimizu, M (1992) Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77 Biosci Biotechnol Biochem 56, 1266-1269 84 Shimizu, M (1993) Purification and characterization of phytase and acid phosphatase by Aspergillus oryzae K1 Biosci Biotech Biochem 57, 1364-1365 85 Simell, M., Turunen, M., Piironen, J and Vaara, T (1989) Feed and food applications of phytase Lecture at 3rd Meet Industrial Applications of Enzymes, Barcelona, Spain, 33-38 86 Singh, M and Krikorian, A D (1982) Inhibiton of trypsin activity in vivo by phytate J Agric Food Chem 30, 799-805 87 Siren, M (1995) Method of treating pain using inositol triphosphate U.S Patent 5407924, 23-28 88 Siren, M (1998) Use of an ester of inositoltriphosphate for the preparing of medicaments U.S Patent 5846957, 21-28 89 Siren, M., Lofkvist, B and Edvinsson, L (1992) Method of treating cardiovascular diseases using inositoltrisphosphate U.S Patent 5128332, 34-37 90 Sutardi, M and Buckle, K A (1988) Characterization of extra - and intracellular phytase from Rhizopus oligosporus used in tempeh production Int J Food Microbiol 6, 67-69 - 70 - 91 Tambe, S M., Kaklij, G S., Kelkar, S M and Parekh, L J (1994) Two distinct molecular forms of phytase from Klebsiella aerogenes: evidence for unusually small active enzyme peptide J Ferment Bioeng 77, 23-27 92 Ullah, A H J (1988) Aspergillus ficuum phytase: partial primary structure, substrate selectivity, and kinetic characterization Prep Biochem 18, 459-471 93 Volfova, O., Dvorakova, J., Hanzlikova, A and Jandera, A (1994) Phytase from Aspergillus niger Folia Microbiol 39, 481-484 94 Williams, P J and Taylor, T G (1985) A comparative study of phytate hydrolysis in the gastrointestinal track of the golden hamster (Mesocricetus auratus) and the laboratory rat Br J Nutr 54, 429-435 95 Wingkin Yip, Lingjian Wang, Chiwai Cheng,c Wailan Wu, Shiucheung Lung, Boon-Leong Lim (2003) The introduction of a phytase gene from Bacillus subtilis improved the growth performance of transgenic tobacco Biochemical and Biophysical Research Communications 310, 1148–1154 96 Wodzinski, R J and Ullah, A H J (1996) Phytase Adv Appl Microbiol 42, 263-302 97 Wyss, M., Pasamontes, L., Friedlein, A., Remy, R., Tessier, M., Kronenberger, A., Middendorf, A., Lehmann, M., Schnoebelen, L., Röthlisberger, U., Kusznir, E., Wahl, G., Muller, F., Lahm, H W., Vogel, K., and van Loon, A P G M (1999) Biophysical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): molecular size, glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance Appl.Environ Microbiol 65, 359-366 98 Yamada, K., Minoda, Y and Yamamoto, Y (1968) Phytase from Aspergillus terrus Production, purification and some general properties of the enzyme Agric Biol Chem 32, 1275-1282 99 Yang, W J., Matsuda, Y Inomata, M and Nakagawa (1991) Developmental and dietary induction of 90 kDa subunit of rat intestinal phytase Biochim Biophys Acta 1075, p 83-87 100 Yanke, L J., Selinger, L B., and Cheng, K J (1999) Phytase activity of Selenomonas ruminantium: a preliminary characterization Lett Appl Microbiol 29, 20 - 25 101 Yanming Han, David b Wilson, and Xin gen Lei (1999) Expression of an Aspergillus niger phytase gene (phyA) in Sacharomyces cerevisiae Applied and Environmental Microbiology 65(4), 1915-1918 102 Yi, Z., Kornegay, E T., Ravindran, V., and Denbow, D M (1996) Improving phytate phosphorus availability in corn and soybean meal for broilers using microbial phytase and calculation of phosphorus equivalency values for phytase Poultry Sci 75, 240-249 103 Yoon, S J., Choi, Y J., Min, H K., Cho, K K., Kim, J W., Lee, S C and Jung, Y H (1996) Isolation and identification of phytase-producing bacterium, Enterobacter sp 4, and enzymatic properties of phytase enzyme Enzyme Microbiol Technol 18, 449454 - 71 - PHỤ LỤC - 72 - - 73 - - 74 - - 75 - - 76 - ...BỘ CÔNG THƯƠNG VI? ??N CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM - NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THƯỜNG XUYÊN KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chủ nhiệm: PGS... vị) -3- TỔNG QUAN 1.1 CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI Đề tài thực theo hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ với mã số: 07.08.QG/HĐ-KHCN Bộ Công nghiệp Vi? ??n Công nghiệp Thực phẩm ký... - 25 - THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Chủng vi sinh vật Chủng nấm mốc phục vụ nghiên cứu tách dòng tiếp nhận từ Sưu tập giống Vi sinh vật Công nghiệp Thực phẩm, Vi? ??n Công nghiệp Thực phẩm (CNTP),