2. THỰC NGHIỆM
2.2.5.1. Biến nạp vào E coli bằng sốc nhiệt
Tạo tế bào E. coli DH5α khả biến [Sambrook, 2001]
- Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 5 ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm
- Chuyển 0.5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục cấy lắc ở 200 vòng/phút ở 37°C cho tới khi đạt OD600 từ 0.4 – 0.6. Sau đó lấy mẫu ra và đặt lên
đá khoảng 1 giờ. Từ bước này tất cả các thao tác đều phải tiến hành ở 4°C
- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Hoà tế bào thu được trong 50 ml CaCl2 100 mM (vô trùng). Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 3500 vòng/phút trong 10 phút - Hoà tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu trong 60 phút trên đá
- Hoà tế bào trong 0.5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol
- Hút 0.1 ml dịch tế bào trên vào mỗi ống Eppendorf và bảo quản ở -75°C hoặc sử
dụng trực tiếp
Biến nạp bằng sốc nhiệt [Sambrook, 2001]
- Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -75°C, làm tan trên đá trong khoảng 15 phút. Sau
đó bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 10-100 ng ADN, đảo nhẹ nhàng để ADN phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó để mẫu trên đá trong thời gian 30 phút
- Mẫu được chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42°C và ủ trong 90 giây Sau đó mẫu được lấy ra và đặt trên đá trong 2 phút
- Bổ sung 1 ml LB, lắc hỗn hợp tế bào ở 37°C trong 60 phút
- Hút 100ml dịch tế bào cấy trải trên đĩa môi trường LB-Ampicillin hoặc LB- Zeocin, ủđĩa ở 37°C qua đêm