2. THỰC NGHIỆM
2.3.3.1. Mở vòng pPICZαA/phyAs
Để tăng hiệu suất biến nạp, cũng như tăng hiệu suất trao đổi chéo thì vector cần chuyển phải được mở vòng thành dạng ADN mạch thẳng. Vì vậy việc mở vòng vector tái tổ hợp là cần thiết. Vector pPICZαA có ba điểm cắt của ba enzyme giới hạn Sac I,
Pme I và BstX I, định hướng vector này trao đổi chéo hiệu quả vào vùng gene AOX1 trong ADN genome của nấm men. Tuy nhiên, sau khi kiểm tra trình tự phyAs, chúng tôi nhận thấy phyAs cũng chứa vị trí nhận biết của hai enzyme Sac I và BstX I. Sac I cắt phyAstop ở vị trí nucleotit số 906 còn BstX I cắt ở hai vị trí nuleotit số 1090 và 1112. Bởi vậy, chỉ có thể cắt plasmid pPICZαA/phyAs bằng Pme I.
Phản ứng cắt hạn chế được thực hiện với tổng thể tích 250 μl, thành phần gồm 25 μl ×10 NEB 4; 2,5 μl BSA (NEB) 10 mg/ml, 200 μl plasmid (50 ng/μl), 5 μl Pme I
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|....
PhyA-Mature AGATCTGGGG GTGATTGGGC GGAGTGTTTT GCT--- --- --- ----
pPICZαA/phyAs AGATCTGGGG GTGATTGGGC GGAGTGTTTT GCTTGATCTA GAACAAAAAC TCATCTCAGA AGAG pPICZαA --- --- --- ---TCTA GAACAAAAAC TCATCTCAGA AGAG 10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| pPICZαA CTCTCGAGAA AAGAGAGGCT GAAGCTGAAT TC--- --- ---
pPICZαA/phyAs CTCTCGAGAA AAGAGAGGCT GAAGCTGAAT TCCTGGCAGT CCCCGCCTCG AGAAATCAAT
(20 U/μl) và ủ qua đêm ở 37°C. Kết thúc phản ứng, enzyme được bất hoạt ở 75°C trong 10 phút. Do phải sử dụng một lượng ADN tương đối lớn để biến nạp, việc hạn chế các ion trong dịch ADN là cần thiết. Nhằm loại muối, sản phẩm sau khi cắt được tinh chế
bằng Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Ngoài ra, thay vì rửa cột bằng đệm cung cấp kèm theo như khuyến cáo của hãng, chúng tôi sử dụng cồn 80% để
hạn chế tối đa lượng ion không mong muốn. Sản phẩm sau phản ứng được điện di kiểm tra trên gel 0.6% agarose trong đệm ×0.5 TAE.
Hình 17. Xử lý enzyme tái tổ hợp bằng PmeI. P/PmeI : Sản phẩm cắt vector pPICZαA/phyA
bằng Pme I.; P: pPICZαA/phyAsđóng vòng; M: Thang ADN chuẩn
Kết quả cho thấy khi xử lý với PmeI plasmid tái tổ hợp đã được cắt hoàn toàn và có kích thước khoảng 4,9 kb, kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết về
vector tái tổ hợp. Do vector tái tổ hợp được tạo bởi gene có kích thước 1.4 kb và vector pPICZαA có kích thước 3.5 kb.