2. THỰC NGHIỆM
2.3.1.4. Gắn phyAs vào vector biểu hiện pPICZαA
Với mục đích sử dụng vector pPICZαA là vector tác dòng và cũng là vector biểu hiện, vì vậy để thực hiện được phản ứng ghép nối thì cả vector và phyAs cần được xử lý cùng với một loại enzyme giới hạn
Xử lý enzyme giới hạn với sản phẩm PCR và vector
a. Xử lý enzyme giới hạn với vector (tổng thể tích phản ứng 20 µl)
Hỗn hợp phản ứng: 2 µl vector : 12 µl nước cất: 4 µl x 10 tango : 1 µl EcoRI (10 U/ µl): 1 µl XbaI (10 U/ µl)
b. Xử lý enzyme giới hạn với sản phẩm PCR (tổng thể tích phản ứng 20 µl)
Hỗn hợp phản ứng: 2 µl ADN : 4 µl x 10 tango: 12 µl nước cất: 1 µl EcoRI (10 U/ µl):1 µl XbaI (10 U/ µl)
Phản ứng cắt với enzyme giới hạn được thực hiện qua đêm ở 37 °C
Tinh sạch sản phẩm PCR và vector sau khi xử lý enzyme giới hạn
Sau khi xử lý enzyme giới hạn cả sản phẩm PCR và vector sẽđược tinh chế nhằm loại bỏ enzyme thừa, các ion khoáng và những sản phẩm phụ, phương pháp được thực hiện như phần tinh sạch sản phẩm PCR. Theo lý thuyết vector pPICZαA sau khi mở vòng bằng enzyme giới hạn sẽ có kích thước 3,5 kb, còn sản phẩm PCR có kích thước 1,4 kb.
Kết quả sau khi cắt và tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 0,8% trình bày qua hình dưới đây.
Hình 9. DNA sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI và XbaI và tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA. 1: phyAs; 2: Vector pPICZαA mở vòng ; M: Thang chuẩn Kết quả điện di cho thấy vector pPICZαA đã mở vòng thành công đã xuất hiện band rõ nét với kích thước 3.5 kb. Chứng tỏ phản ứng cắt enzyme giới hạn đã tối ưu, triệt
để. Hình 9 cũng cho thấy cả sản phẩm PCR cũng như vector đã được tinh sạch hiệu quả
vì cả hai đều thể hiện band đúng kích thước sau điện di. Đây chính là những điều kiện quan trọng, cần thiết vì phản ứng ghép nối đòi hỏi cần gene và vector sau xử lý enzyme giới hạn có độ tinh khiết cao.
Gắn gene phyAs vào vector pPICZAα
Gene và vector được gắn với nhau nhờ enzyme ligase theo phản ứng sau: 1 µl phyAs: 3 µl vector: 3 µl nước cất: 2 µl đệm ligase 5x: 1 µl enzyme
Ủở điều kiện 15ºC qua đêm, Sau đó 5 μl hỗn hợp plasmid tái tổ hợp pPICZαA/phyAs
được biến nạp vào 200 μl tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi cấy trên LB-Low salt chứa 25 mg/l zeocin ở 37°C qua đêm.
Theo lý thuyết bản thân pPICZαA không có khả năng tựđóng vòng do được xử lý với 2 enzyme giới hạn khác nhau, cho nên vector chỉ có khả năng đóng vòng khi gắn với phyAs cũng được xử lý với 2 enzyme giới hạn tương tự. E. coli DH5α không có khả
năng sinh trưởng trên môi trường có zeocin, trong khi đó vector pPICZαA lại chứa gene kháng zeocin, chính vì vậy chỉ những tế bào mang vector tái tổ hợp pPICZαA/phyAs đã
đóng vòng mới có khả năng sinh trưởng trên môi trường có zeocin. Kết quả sau khi biến nạp trên E. coli DH5α được minh họa qua hình 10.
Đối chứng:E. coli được biến nạp bằng nước cất TN: E. coli được biến nạp bằng vector tái tổ hợp
Hình 10. Biến nạp vector tái tổ hợp pPICZαA/phyAs vào E. coli DH5α Kết quả sau khi biến nạp vào E. coli đã thấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc mọc trên môi trường có chứa kháng sinh zeocin, chứng tỏ vector tái tổ hợp có chứa gene kháng zeocin đã có mặt trong tế bào E. coli.