2. THỰC NGHIỆM
2.3.1.6. Tách chiết phasmid
Nhằm thu một lượng lớn vector tái tổ hợp pPICZαA/phyAs sử dụng cho chuyển vào P. pastoris chúng tôi thực hiện tách chiết plasmid. Hai thể biến nạp E. coli số 10 và 12 được nuôi cấy và tách chiết plasmid theo phương pháp Sambrook (2001).
ADN plasmid đã tách chiết được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0.6%
Hình 12. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp M: Thang chuẩn 1, 2: số thứ tự khuẩn lạc số 10 và 12
Kết quả cho thấy cả hai thể biến nạp E. coli plasmid đã được tách chiết thành công và tinh sạch. Thông thường để kiểm tra quá trình ghép nối của gene và vector, cách phổ
biến là tách vector tái tổ hợp và xử lý lại bằng enzyme giới hạn EcoRI và XbaI để xác
định sản phẩm tạo thành có đúng là vector gốc và gene hay không. Tuy nhiên sau một vài thực nghiệm không thành công và khi kiểm tra lại chúng tôi nhận thấy với việc thiết kế
mồi ngược phyA-XbaI-Stop-R primer (5’-3’) nên khi gene gắn với vector sẽ xuất hiện trình tự methyl hóa ở vị trí cắt của XbaI, vì thế XbaI sẽ không cắt được vị trí này của vector tái tổ hợp.
5'...TCTAGATC...3'
3'...AGATCTAG...5' Trình tự màu xanh là chuỗi trình tự bị methyl hóa
Chính vì vậy, để kiểm tra việc ghép nối giữa gene và vector chúng tôi tiến hành sử
dụng cặp mồi chéo α-factor và phyA-XbaI-Stop-R như hình 13. Theo nguyên lý thì chỉ
khi gene gắn vào được vector thì mới cho ra sản phẩm PCR, do bởi mồi α-factor kết cặp bổ sung trên vector pPICZα.
Hình 13. Sơđồ hoạt động của cặp mồi chéo
Kết quả chạy PCR bằng cặp mồi chéo được minh họa qua hình 13 dưới đây.
Hình 14. Kiểm tra sự có mặt phyAs bằng cặp mồi chéo M: Thang chuẩn 1, 2: số thứ tự khuẩn lạc số 10 và 12
Theo tính toán thì sản phẩm PCR bằng cặp mồi chéo có kích thước 1,4 kb, thực nghiệm cho thấy xuất hiện band sản phẩm rõ nét phù hợp với tính toán trên. Như vậy có thể kết luận phyAs đã ghép nối thành công vào vector pPICZAα. Việc gắn trực tiếp gene phyAs với vector pPICZAα đã cho thấy, chúng tôi thành công hơn so với những nghiên cứu tương tự năm 2007 do phải thông qua một bước trung gian gắn gene đích vào vector pJET1/blunt. Kết quả này giúp đơn giản hóa qui trình, tiết kiệm thời gian công sức, hóa chất.