2. THỰC NGHIỆM
2.3.6. Tuyển chọn chủng biến nạp mang multicopy
Giống nhưSaccharomyces cerevisiae, AND mạch thẳng được chuyển vào trong tế
bào P. pastoris khi gặp vùng tương đồng với genome sẽ xảy quá trình trao đổi chéo (Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989). Quá trình trao đổi chéo có thể xảy ra một lần tạo ra chủng biến nạp đơn bản (single copy) hoặc được thực hiện nhiều lần tạo ra chủng biến nạp đa bản (multicopy). Sự trao đổi chéo nhiều lần tạo đa bản xảy ra ngẫu nhiên và có tần suất từ 1-10% so với tổng số tế bào có trao đổi chéo đơn bản (Easyselect Pichia pastoris
expression kit).
Đối với P. pastoris khi được biến nạp bằng vector tái tổ hợp pPICZαA/phyAs quá trình trao đổi chéo sẽ xảy ra tại locus AOX1 hoặc tại locus aox1::ARG4 (hình 23)
Hình 23. Mô hình biến nạp đa bản
Như vậy đối với những chủng biến nạp đa bản sẽ chứa nhiều khung biểu hiện (Expression cassette) trong genome. Về mặt lý thuyết cũng như thực tiễn nghiên cứu chủng biến nạp đa bản sẽ có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh hơn chủng biến nạp đơn bản khi so sánh trên cùng sinh khối (Clare, J.J. et all, 1991). Với mục đích nâng cao khả năng biểu hiện phytase ngoại bào, chúng tôi tiến hành tạo và chọn dòng tế bào biến nạp multicopy.
Những chủng biến nạp đa bản sẽ có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng
độ zeocin cao. Do mỗi khung biểu hiện (Expression cassette) đều có chứa gene kháng lại zeocin (hình 23). Theo nguyên lý trên chúng ta có thể chọn lọc thể biến nạp đa bản thông qua nuôi cấy trên môi trường có nồng độ zeocin cao.
Toàn bộ tế bào P. pastoris X33 sau khi được biến nạp bằng vector tái tổ hợp pPICZαA/phyAs, được trang lên đĩa môi trường YPDS có chứa 100 mg/l zeocin. Sau đó chúng tôi thu tất cả các khuẩn lạc nấm men có khả năng kháng zeocin bằng cách hòa tan vào nước cất và trang lên môi trường YPD với ba nồng độ zeocin là 100 mg/l; 1000 mg/l và 2000 mg/l để tuyển chọn thể biến nạp đa bản. Sau 48 giờ nuôi cấy ở 28°C, quan sát cho thấy xuất hiện khuẩn lạc mọc trên nồng độ kháng sinh cao (hình 24).
a. YPD 100 mg/l zeocin b. YPD 1000 mg/l Zeocin c. YPD 2000 mg/l Zeocin
Hình 24. Khả năng sinh trưởng trên nồng độ kháng sinh cao
Với mục đích kiểm tra dòng biến nạp chống chịu nồng độ cao zeocin có họat tính cao như dựđoán hay không. Đồng thời kiểm chứng khả năng sinh trưởng của những thể
biến nạp biểu hiện họat tính phytase thấp trên môi trường có nồng độ kháng sinh cao. Chúng tôi tiến hành lấy 9 thể biến nạp kháng zeocin nồng độ cao (thể biến nạp A) so sánh với 9 thể biến nạp biểu hiện họat tính phytase thấp (thể biến nạp B). Cả hai thể biến nạp A và B được nuôi cấy trên môi trường YPD ở 28°C sau 48 giờ, ly tâm và rửa tế bào, Sau
đó biểu hiện trên môi trường BMM với OD600 ban đầu đạt 20 - 22 ở 28°C sau 96 giờ. Kết quả kiểm tra họat tính phytase được trình bày trong bảng 13.
Bảng 13. So sánh họat tính phytase giữa các thể biến nạp A và B
Stt mTên ẫu hiKí ệu OD 700 nm pha loãng (lần) IU/ml Thí nghiệm Đối chứng 1 KM71H.P1 0.152 0.068 10000 146 2 KM71H.5 0.221 0.068 10000 265 3 X33.140 0.257 0.068 10000 328 4 X33.1000.1 A1 0.334 0.068 10000 461 5 X33.1000.2 A2 0.283 0.068 10000 373 6 X33.2000.1 A3 0.265 0.068 10000 342 7 X33.2000.2 A4 0.347 0.068 10000 484 8 X33.2000.3 A5 0.311 0.068 10000 422 9 X33.2000.4 A6 0.295 0.068 10000 394 10 X33.2000.5 A7 0.327 0.068 10000 449 11 X33.2000.6 A8 0.288 0.068 10000 382 12 2000.7 A9 0.331 0.068 10000 456 13 X33.3 B1 0.18 0.068 10000 194 14 X33.10 B2 0.167 0.068 10000 172 15 X33.37 B3 0.154 0.068 10000 149 16 X33.71 B4 0.192 0.068 10000 215 17 X33.81 B5 0.187 0.068 10000 206 18 X33.56 B6 0.188 0.068 10000 208 19 X33.58 B7 0.166 0.068 10000 170 20 X33.63 B8 0.199 0.068 10000 227 21 X33.86 B9 0.201 0.068 10000 231
Kết quả cho thấy các thể biến nạp A đều cho hoạt tính cao hơn không chỉ với những thể biến nạp B mà còn cao hơn so với chủng KM71H.P1 mà chúng tôi đã tiến hành chuyển gene trong năm 2007. Mặt khác thể biến nạp X33.140 được tuyển chọn sau biến nạp cũng cho kết quả họat tính khá cao 328 IU/ml, theo chúng tôi đây cũng là thể
biến nạp đa bản.
Tế bào của cả hai thể biến nạp A và B được hòa tan trong nước cất vô trùng và
được cấy gạch chéo lên trên môi trường YPD nồng độ 100 mg/l và 2000 mg/l nhằm so sánh khả năng chống chịu zeocin. Sau 48 giờ nuôi cấy ở 28 0C kết quả được mô tả qua hình.
a. YPD 100mg/l Zeocin b. YPD 2000 mg/l Zeocin
Hình 25. So sánh khả năng kháng zeocin giữa các thể biến nạp A và B
Kết quả cho thấy trên môi trường nồng độ zeocin thấp (100 mg/l) cả hai thể biến nạp A và B đều có khả năng sinh trưởng như nhau (hình a). Tuy nhiên trên môi trường nồng độ zeocin cao (2000 mg/l-hình b) đã có sự khác biệt, những thể biến nạp B không có khả năng sinh trưởng ở nồng độ này trong khi đó các thể biến nạp A vẫn sinh trưởng bình thường. Như vậy, những thể biến nạp A chắc chắn phải chứa nhiều khung biểu hiện (Expression catsette) hơn những thể biến nạp B, nên mới có khả năng kháng zeocin cao và khả năng biểu hiện họat tính cao. Đây chính là những thể biến nạp đa bản (multicopy) mà chúng tôi chọn lọc được, trong đó thể biến nạp X33.2000.2 (kí hiệu A4) biểu hiện họat tính cao nhất 484 IU/ml được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.