2. THỰC NGHIỆM
2.3.2. Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết
Với mục đích kiểm tra gene phyA đã được gắn ở vị trí chính xác trong vector pPICZαA theo như thiết kế hay không, sau khi thu được plasmid tái tổ hợp chúng tôi tiến hành đọc giải trình tự các vùng phụ cận. Hai mồi α-factor primervà 3’-AOX1 primer được sử
dụng đểđọc trình tự từ hai đầu của đoạn thiết kế.
Một trong những điểm quan tâm đầu tiên là trình tự của gene tại vị trí ghép nối, bởi những sai lệch nhỏ ở đây cũng có thểảnh hưởng tới khung giải mã và hoạt động của gene đưa vào. Trình tự ADN đã giải mã được so sánh với trình tự nucleotit ở các phía tương ứng trong vector pPICZαA và trình tự nucleotit của đoạn phyA - mature (Z16414)
trên Genebank. Kết quả phân tích trình tự ở các vị trí EcoR I và Xba I của pPICZαA/phyAs được trình bày trong hình 15 và hình 16.
Hình 15. So sánh độ tương đồng của đoạn gene pPICZαA-phyAs tại vị trí ghép nối EcoR I từ
phía α-factor primer với phyA (Z16414) và đoạn gene pPICZαA ở phía tương ứng.
Hình 16. So sánh độ tương đồng của đoạn gene phyA-pPICZαA tại vị trí ghép nối Xba I từ phía
3’-AOX1 primer với phyA (Z16414) và đoạn gene pPICZαA ở phía tương ứng.
Kết quảđọc trình tự ghép nối hai đầu đã cho thấy gene phyAs được gắn chính xác
ở hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn trong vector pPICZαA, không xảy ra hiện tượng lệch khung các bộ ba mã hóa. Đặc biệt sau đoạn mã hóa phyA-mature chúng tôi đã thành công trong việc gắn stop codon TGA (hình 16), kết quả này chứng minh rằng việc thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope đã thành công.