2. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope (phyAs)
(phyAs)
2.3.1.1.Thiết kế mồi.
Từ những nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện phytase năm 2007, chúng tôi nhận thấy sản phẩm protein tái tổ ngoại bào từ dịch canh trường rất sạch và hầu như không lẫn các protein khác. Mặt khác định hướng của chúng tôi là nghiên cứu sản xuất phytase tái tổ
hợp phục vụ làm thức ăn gia súc đây cũng chính là phổứng dụng mạnh nhất của enzyme này. Chính vì vậy, việc tinh chế phytase với lượng lớn là không thực sự cần thiết và gây tốn kém, phức tạp cho qui trình sản xuất phytase. Do đó chúng tôi nghiên cứu thiết kế
vector biểu hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope với mong muốn tìm
được sự tối ưu về cấu trúc. Để có được vector mong muốn chúng tôi phải thiết kế lại cặp mồi để tách dòng gene phyA.
Mồi xuôi cần thiết phải chứa điểm cắt của enzyme giới hạn EcoRI và có trình tự
giống với trình tựđầu 5’ của mature protein coding region - Điểm cắt của EcoRI trên vector: GAA GCT G’AA TT_C ACG
- Đầu 5’ của phyA mature protein coding region: CTG GCA GTC CCC GCC TCG AGA - phyA-EcoRI-F primer (5’-3’): GCTGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCTCGAGA
Mồi ngược cần thiết phải chứa điểm cắt của XbaI và có trình tự bổ sung với trình tựđầu 3’ của mature protein coding region
- Điểm cắt của XbaI trên vector : TTT’ CTA G_AA CAA
- Đầu 3’ của phyA (mature protein coding region): GAT TGG GCG GAG TGT TTT GCT
Vì mong muốn sản phẩm protein ngoại lai không chứa đuôi c-myc-epitope và polyhistidine tag, nên sau mature protein coding region cần phải có stop codon TGA để
dừng quá trình phiên mã. Mồi ngược sẽ là - phyA-XbaI-R (3’-5’):
GAT TGG GCG GAG TGT TTT GCT TGA T’ CTA G_AA CA -phyA-XbaI-Stop-R primer (5’-3’)