XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG.DOC

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG

bé GI¸O DôC Vµ §µO T¹O Bé Y TÕTR¦êNG §¹I HäC D¦îC Hµ NéI

bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế

TRƯờNG ĐạI HọC DƯợC Hà NộI

Dơng Hải Thuận

xây dựng phơng pháp định lợng azithromycin trong huyết tơng

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - độc chất

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Phạm Thị Thanh Hà đã tận tình hớng dẫn chỉ bảo, và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trìmh học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trờng, trân trọng cám ơn các thầy giáo, cô giáo Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác của trờng Đại học Dợc Hà Nội đã giảng dạy tận tình và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trờng.

Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ơng, Ban lãnh đạo Viện dinh dỡng, phòng Vật lý đo lờng-viện kiểm nghiệm thuốc trung ơng, Trung tâm kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm- Viện dinh dỡng nơi tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Thái Nguyên nơi tôi công tác đã quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian qua.

Cuối cùng xin cám ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ tôi tận tình để có kết quả ngày hôm nay.

Dơng Hải Thuận

Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Chơng 2: Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu. 13

2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong dung môi

2.3.2 Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng

2.3.3 Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời uống AZI 18

3.2 Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang.

3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lợng AZI 21 3.2.2 Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang 22

3.2.3 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định 24 3.3 Khảo sát xây dựng chơng trình sắc ký lỏng khối phổ để định lợng

3.5 Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời tình nguyện 43

4.1 Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI 45 4.1.1.Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI trong

dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang 45

4.1.2 Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI trong

Cmax : Nồng độ thuốc tối đa

ESI Ion húa bằng phun điện tử (Electronsray Ionization)

FMOC-Cl 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chlorid

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

IS : Nội chuẩn (Internal standard)

LC-MS : Sắc ký lỏng ghộp khối phổ (Liquid Chromatography-Mass

LOD : Giới hạn phỏt hiện (Limit of Detection)

LOQ : Giới hạn định lợng (Limit of Quantification)

MS : Khối phổ (Mass Spectrometry)

PA : Tinh khiết phõn tớch (Pure for Analysis)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

ROXI : Roxithromycin

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

S/N : Tớn hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

UV : Tử ngoại (Ultra Violet)

DANH MỤC C C BÁẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bản

DANH MỤC CÁC HèNH TRONG LUẬN VĂN

3.13 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Thermo C18(50x2,1mm; 5àm) 34

3.14 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy cột Zorbax C18 SB (150x4,6; 5àm) 34

3.15 Sắc ký đồ AZI và ROXI chạy chạy chế độ dẳng dòng 0,5ml/phút

hệ dung môi acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4)

3.16 Các sắc ký đồ thể hiện sự chon lọc của phơng pháp. 37

3.17 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diên tích pic(AZI/ROXI) và

Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dợc phẩm, lĩnh vực phân tích và đảm bảo chất lợng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh, gắn bó chặt chẽ với nhau và có quan hệ tơng hỗ để cùng nhau phát triển Vào những năm 60 của thế kỷ 20, vấn đề sinh khả dụng của thuốc đợc đề cập tới và nhanh chóng trở thành vấn đề đợc hầu hết các hãng dợc phẩm lớn quan tâm và phát triển Nó trở thành một động lực thúc đẩy các nhà bào chế tìm ra công thức thuốc tốt nhất, an toàn nhất cho một loại hoạt chất

Từ cuối năm 2003, Viện Kiểm nghiệm đã triển khai một mô hình thử nghiệm để đánh giá tơng đơng sinh học của thuốc nhằm xây dựng nên một qui chế cho đánh giá tơng đơng sinh học [7] Những quy chế này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sinh khả dụng, tơng đơng sinh học và dợc động học của thuốc, góp phần quản lý chặt chẽ, nâng cao chất lợng thuốc sản xuất trong nớc Chúng ta đã có một số nghiên cứu về lĩnh vực này [1], [3], [7] Tuy nhiên, con ngời đợc đào tạo về lĩnh vực phân tích sinh học này rất ít do đó để triển khai và phát triển nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học của thuốc không những phải đầu t vào trang thiết bị mà còn phải chú trọng vào đào tạo con ngời.

Phơng pháp phân tích để định lợng thuốc và chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học đóng vai trò quyết định trong đánh giá và diễn giải các số liệu nghiên cứu sinh khả dụng, tơng đơng sinh học và dợc động học của thuốc Để làm đợc điều này, các phơng pháp phân tích sinh học dựa trên kỹ thuật hóa lý và sinh học hiện đại đợc phát triển và ứng dụng rộng rãi trong đó có phơng pháp HPLC đợc sử dụng rất phổ biến Các phơng pháp phân tích sinh học phải đợc thẩm định trớc để đảm bảo kết quả thu đợc là chính xác, đáng tin cậy Qui định một qui trình và các tiêu chí thẩm định phơng pháp phân tích sinh học đã đợc thảo luận ở rất nhiều hội nghị quốc tế lớn về công nghiệp dợc phẩm.

Trong thực tế chúng tôi nhận thấy thuốc của Việt Nam sản xuất không thua kém về sinh khả dụng so với chế phẩm nổi tiếng cùng loại của nớc ngoài (các chế phẩm nghiên cứu đều có tơng đơng sinh học với chế phẩm đối chiếu)

nhng giá thành chênh lệch nhau gấp 10 lần thậm chí 30 – 40 lần Về giá bán cũng đúng với trờng hợp chế phẩm azithromycin, trong khi viên Azithrin 250 của Pfizer giá khoảng 80.000 – 90.000 đ/ viên, viên Usmax 250 của Dong In Dang Pharmaco (Hàn Quốc) giá khoảng 34.000 đ/ viên, thì viên Azithromycin 250 của Traphaco hoặc Azimax 250 của Imexpharm giá chỉ khoảng 3.000 đ/ viên Do đó, đánh giá sinh khả dụng và tơng đơng sinh học của chế phẩm chứa Azithromycin nói riêng và các thuốc của Việt Nam sản xuất nói chung là một việc làm hết sức cần thiết nhằm mục đích phục vụ ngời bệnh những thuốc có chất lợng cao, giá cả hợp lý phù hợp với điều kiện kinh tế ngời Việt Nam, đồng thời thúc đẩy nhà sản xuất không ngừng nâng cao chất l-ợng để sản phẩm của mình có tính cạnh tranh cao.

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi chọn đề tài "Xây dựng phơng pháp định lợng arithromycin trong huyết tơng"

Mục tiêu của đề tài:

- Xây dựngphơng pháp định lợng AZI trong HT.

Trong cấu trúc của AZI không có dây nối đôi liên hợp và các nhóm mang màu nên nó hấp thụ UV kém, đây chính là điều khó khăn để định lợng AZI trong dịch sinh học.

* Tính chất [4], [6].

AZI là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid, ở dạng bột màu trắng đến

màu trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng Thực tế không tan trong nớc, rất dễ

tan trong methanol, aceton, ethanol, diethyl ether, cloroform và dung dịch acid hydrocloric loãng Dung dịch 0,2% trong hỗn hợp methanol – nớc (1 : 1) có pH là 9,0– 11,0 Năng suất quay cực là - 45o tới – 49o (dung dịch 1% trong ethanol)

* Dợc động học [4].

Hấp thu: AZI hấp thu nhanh và sinh khả dụng đường uống khoảng 40% Đặc biệt thuốc đạt nồng độ trong tế bào cao hơn so với trong HT vỡ vậy dựng điều trị vi khuẩn nội bào tốt Thức ăn làm giảm hấp thu thuốc

Phõn bố: Phõn bố rộng khắp trong cơ thể, chủ yếu vào cỏc mụ như phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt và đại thực bào , cao hơn trong mỏu nhiều lần, tuy nhiờn nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp.

Chuyển hoỏ: Một lượng nhỏ AZI bị khử methyl trong gan, và được đào thải qua mật ở dạng khụng biến đổi và một phần ở dạng chuyển hoỏ.

Thải trừ: Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vũng 72 giờ dưới dạng khụng biến đổi

*Cơ chế và tác dụng dợc lý [4].

AZI tỏc động bằng cỏch gắn kết vào tiểu đơn vị 50S của ribosom và qua đú ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn AZI cú phổ khỏng khuẩn rộng và sau khi uống, nồng độ đỉnh trong HT đạt được sau 2-3 giờ

AZI là một kháng sinh mới có hoạt phổ rộng, có tác dụng tốt trên các vi

khuẩn gram(+) (nh Streptococcus, Pneumococcus, Staphilococcus aureus…) và gram(-) (nh Haemophilus influenzae, Neissria gonorrhoeae…) Có tác dụng vừa phải trên các vi khuẩn Escherichia coly, Samonella enteritis,

Samonella typhi, Klebsiella.

* Tác dụng không mong muốn [4].

- AZI đợc dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp Hay gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hoá (khoảng 10%) với các triệu chứng nh buồn nôn,

đau bụng, co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy, nhng thờng nhẹ và ít xẩy ra hơn so với erythromycin.

- ảnh hởng thính giác: sử dụng lâu dài ở liều cao AZI có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số ngời bệnh.

* Chỉ định [4].

AZI đợc chỉ định dùng trong các trờng hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm với thuốc nh nhiễm khuẩn đờng hô hấp dới (viêm phổi, viêm phế quản, các nhiễm khuẩn da và mô mềm, viêm tai giữa), đờng hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng và viêm amidan), nhiễm khuẩn đờng sinh dục cha biến chứng do Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae không đa

* Liều dùng và cách dùng [4].

- Dùng 1 lần mỗi ngày, uống trớc bữa ăn 1 giờ hoặc sau khi ăn 2 giờ - Ngời lớn: ngày đầu uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa với liều đơn 250mg/ngày.

- Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ uống ngày đầu là 10mg/kg thể trọng, và 4 ngày tiếp theo là 5mg/kg thể trọng mỗi ngày uống một lần.

* Dạng bào chế [5].

- Viên nang AZI dihydrat tơng đơng AZI 250mg và 500mg.

- Bột pha hỗn dịch uống AZI dihydrat tơng đơng 200mg AZI/ 5ml, lọ bột đông khô pha tiêm 500mg.

- Viên nén và viên nén bao phim tơng đơng AZI 125mg, 250mg và 500mg; viên nén phân tán tơng đơng AZI 100mg

1.2 Một số phơng pháp định lợng AZI trong dịch sinh học.

Theo tài liệu khoa học của nớc ngoài có thể định lợng AZI trong dịch sinh học bằng những phơng pháp sau:

*Các nghiên cứu sử dụng sắc ký

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lợng AZI trong dịch sinh học bằng HPLC

T/ liệuMẫu thửCột sắc kýĐiều kiện sắc ký

- Dung môi chiết: Diethyl ether

- Pha động: MeCN- NH4CH3COO 0,05M - Chuẩn nội: ROXI

- Pha động: MeCN- NH4CH3COO 0,05M - Chuẩn nội: CLA - Detector huỳnh quang.

- Chất dẫn xuất huỳnh quang: FMOC-Cl.

- Dung môi chiết: Tert-butyl metyl ether - Pha động: MeCN- đệm phosphat (36,5:63,5) pH=7,40

- Tốc độ dòng: 1,2ml/phút - Detector : điện hóa

Norwark USA

- Dung môi chiết: Ethyl acetat-hexan(1:1) - Pha động: MeCN-MeOH-Đệm phosphat 0,04M pH=6,9 (52:9:39)

- Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector: điện hóa.

- Dung môi chiết: Tert-butyl methyl ether - Pha động:Na2HPO450mM-NaH2PO450mM

Xử lý mẫu: pha loãng HT bằng ethanol (1:1), ủ ở 4o C , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, lấy dịch nổi ở trên cô ở 55oC đến thể tích ban đầu của mẫu Định lợng trong môi trờng thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là

Micrococcus luteus NCTC 8440, khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,005 đến

1.3 Nguyên tắc chung về phơng pháp phân tích bằng HPLC [2].

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng- rắn) Mẫu phân tích đợc chuyển lên cột tách dới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng t-ơng tác của chúng với pha động và pha tĩnh khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

1.3.1 Phân tích định tính.

Một trong các đại lợng đặc trng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ pha đã chọn là thời gian lu của các chất Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian l-u khác nhal-u và cố định Chính đại lợng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn hợp mẫu.

Vì vậy, sau khi đã chọn đợc các điều kiện tối u cho quá trình sắc ký, tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lu của từng pic ứng

với mỗi chất trong sắc đồ Sau đó so sánh thời gian lu của chất phân tích với thời gian lu của chất chuẩn, từ đó sẽ xác định đợc trong mẫu phân tích có những chất nào.

1.3.2 Phân tích định lợng:

Để có thể định lợng đợc thì yêu cầu giữa đáp ứng phân tích (chiều cao, diện tích pic) phải có tơng quan với nồng độ chất thử

- Phơng pháp nội chuẩn: Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, ngời ta

th-ờng dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu phân tích và mẫu chuẩn đối chiếu Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lu gần với thời gian lu của chất phân tích nhng đợc tách hoàn toàn, có tính chất tơng tự nh chất cần phân tích nhng không gây ảnh hởng lên tín hiệu của chất cần phân tích Tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic của chất phân tích và chất chuẩn nội trong dung dich chuẩn đối chiếu là thông số phân tích đợc dùng để xây dựng đờng chuẩn

*Phơng pháp chuẩn hóa diện tích:

Hàm lợng phần trăm của một thành phần trong mẫu phân tích đợc xác định bằng tỷ số (tính bằng phần trăm) của diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu( trừ pic dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lợng nhỏ hơn giới hạn phát hiện)

Hai yêu cầu cần đáp ứng khi sử dụng phơng pháp này:

- Tất cả các thành phần trong mẫu phân tích cần đợc rửa giải, xuất hiện trân sắc ký đồ.

- Detector của thiết bị có đáp ứng nh nhau đối với tất cả các thành phần có mặt trong mẫu.

Do hai yêu cầu trên rất khó đợc đáp ứng đầy đủ nên kết quả thờng không tin cậy Để tăng độ tin cậy ngời ta dùng hệ số đáp ứng của detector đối với từng thành phần của mẫu.

1.4 Vài nét về HPLC với detector huỳnh quang.

Quang phổ huỳnh quang ngoài việc áp dụng để định tính, định lợng các chất trên máy đo quang phổ huỳnh quang thì nó còn đợc dùng để chế tạo bộ phận phát hiện của máy HPLC Detector huỳnh quang đóng vai trò nh một máy huỳnh quang kết nối với sắc ký lỏng để phát hiện về phân tích định tính và định lợng các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký Detector huỳnh quang có độ chọn lọc và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV HPLC-detector huỳnh quang có thể phát hiện tới 10-12g Do có độ nhạy cao nên detector huỳnh quang đợc sử dụng trong phân tích vết trong kiểm soát môi tr-ờng, giám định pháp y, định lợng hoạt chất trong dịch sinh học

Tùy theo các chất cần định lợng có khả năng phát quang hay không mà tiến hành định lợng trực tiếp hay gián tiếp thông qua dẫn chất có khả năng phát quang của nó Ngời ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo dẫn chất phát huỳnh quang mạnh trớc khi đến detector huỳnh quang Việc tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trớc hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua cột sắc ký Nếu chất cần phân tích đợc phản ứng với thuốc thử trớc khi qua cột

thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất tr- ớc cột Nếu chất cần phân tích đợc phản ứng với thuốc thử sau khi đã đi ra khỏi cột, thì đợc gọi là tạo dẫn xuất sau cột.

1.5 V i nét về LC-MS.à

LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích.

- Phơng pháp sắc ký lỏng khối phổ cho phép phân tích hỗn hợp các chất khó bay hơi nh các thuốc bảo vệ thực vật, các thuốc chữa bệnh, các độc tố, các phân tử protein có phân tử lợng lớn từ vài ngàn đến hàng trăm ngàn đơn vị dalton [8].

- Phơng pháp sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện đợc sử dụng rất hữu hiệu phân tích dợc phẩm cả định tính và định lợng, ví dụ các thuốc có trong các mẫu sinh học phức tạp nh HT, huyết thanh, nớc tiểu [8].

*Nguyên tắc hoạt động của máy phân tích khối phổ:

Đây là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lợng và điện tích của ion (m/z) đ-ợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hay nguyên tử của mẫu.

Các ion đợc tạo thành trong buồng ion hóa, đợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trớc khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị áp suất thấp, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 đến 10-6 Pa.

Nhiệm vụ của detector khối phổ: Chuyển các ion đã đến detector thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

*Các bộ phận của máy phân tích khối phổ:

- Bộ nạp mẫu: Có đờng kết nối với đầu ra của máy sắc ký lỏng.

- Bộ nguồn ion hóa: Nhiệm vụ ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhng hiện nay thờng sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở áp suất thờng (APCI)

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI ESI có vai trò chuyển ion từ pha lỏng sang pha khí Kỹ thuật này đợc mô tả nh sau: Các phân tử dung

môi và hóa chất sau khi ra khỏi cột sắc ký sẽ đợc đa vào một ống mao quản cao thế 2 đến 5 KV (điện thế dơng ở đầu kim tạo ion dơng, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và đợc quyết định tùy chất khảo sát) Dới tác động của điện thế cao có sự tạo thành những hạt nhỏ mang điện Sau khi qua ống mao quản dới tác động của luồng khí nitơ nóng các phân tử dung môi từ từ bay hơi, các hạt mang điện tích nhỏ dần Sau đó các ion dơng hay âm tạo thành đợc đa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài [21].

- Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt.

- Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

-Bộ xử lý dữ liệu: Tín hiệu điện đợc khuyếch đại trớc khi chuyển thành tín hiệu phục vụ sử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau: Ghi phổ, định lợng

* Một số kỹ thuật LC-MS

- Kỹ thuật phân tích toàn thang (full scan)

Là kỹ thuật phân tích mà phổ khối sẽ đa ra toàn bộ ion sinh ra từ ion gốc, ta có một sắc đồ toàn ion (Total Ion Chromatogram) Kỹ thuật này có độ nhiễu đờng nền rất lớn nên độ nhạy kém [9].

- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM)

Đây là kỹ thuật ngay từ đầu chỉ cho phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian Lúc này sắc đồ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa ion đó Kỹ thuật này có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đờng nền và do đó làm tăng độ nhạy (tăng tỷ lệ tín hiệu /nhiễu đờng nền) Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích d l-ợng một chất đã biết trong một mẫu phức tạp [9].

- Kỹ thuật MS/MS

Kỹ thuật này chọn một ion ở chế độ MS lần 1, ion đó sẽ đợc phân tích tiếp bằng cách tạo ra mảnh ion nhỏ hơn đặc trng cho ion trớc đó, đợc phân tích

MS lÇn 2 NÕu tiÕp tôc chän ion vµ bÎ g·y ion ta cã kü thuËt MSn (n lµ sè lÇn bÎ gÉy ion) [21]

Chơng 2: Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu.

2.1.Đối tợng nghiên cứu

Để xây dựng và thẩm định phơng pháp phân tích AZI trong HT ngời, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tợng sau:

- Mẫu trắng: là HT ngời của viện Huyết học và truyền máu trung ơng - Mẫu chuẩn: là mẫu trắng đợc thêm AZI với nồng độ xác định.

- Mẫu thử: là HT ngời có sử dụng AZI.

2.2 Hoá chất và thiết bị

* Hoá chất :

Bảng 2.1: Danh mục hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn

Hóa chất thuốc thử

Chất chuẩn

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 10A-VP -

Detector huỳnh quang.

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max.

- Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45μm), bộ lọc mẫu (màng lọc 0,2μm) - Máy lắc siêu âm (Brasonic - Mỹ).

- Cân phân tích (Sartorius - Đức) - Máy đo pH (Metrohm - Thụy Sĩ) - Máy ly tâm (Jouan - Pháp)

- Máy siêu li tâm (Sartorius - Đức) - Tủ lạnh sâu (Frigo - Đan Mạch) - Máy lọc nớc siêu sạch (Elga -Anh) - Máy lắc (Labinco - Hà Lan) - Nồi cách thủy.

- ống nghiệm lấy máu chứa EDTA, - ống nghiệm teflon dung tích 30ml.

- Bình định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác.

2.3 Phơng pháp nghiên cứu

Định lợng AZI trong HT là quá trình phân tích phức tạp yêu cầu phơng pháp phân tích phải có tính chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao Sau khi tìm hiểu sâu về đối tợng nghiên cứu, mục tiêu của đề tài và tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn hai phơng án để tiến hành khảo sát đó là: HPLC với detector huỳnh quang và LC-MS.

2.3.1 Khảo sát quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang.

*Chuẩn bị dung dịch:

- Dung dịch chuẩn AZI nồng độ lần lợt là 5, 10, 25, 50, 100 àg/ml trong methanol

- Dung dịch nội chuẩn CLA (IS) 50 àg/ml

- Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml - Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4

* Khảo sát điều kiện chạy sắc ký.

Khảo sát về cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, detector huỳnh quang (bớc sóng kích thích, bớc sóng phát xạ)

* Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang.

- Khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất: Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 70oC, cách 10oC

- Khảo sát thời gian phản ứng: Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối u là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút, cách 10

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lợng (LOQ).

2.3.2 Khảo sát xây dựng quy trình định lợng AZI trong HT bằng LC-MS.

2.3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn.

Để giảm các yếu tố ảnh hởng đến kết quả phân tích và tăng độ chính sác chúng tôi chọn phơng pháp nội chuẩn Sau khi tìm hiểu, tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn hai chất có cùng cấu trúc phân tử là CLA và ROXI để tiến hành khảo sát chọn làm chuẩn nội.

- Pha dung dịch chuẩn gốc AZI: cân chính xác chất chuẩn AZI, hòa tan trong methanol để đợc dung dịch gốc Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,2- 20àg/ml trong methanol.

2.3.2.2 Sử lý mẫu

Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi chọn xây dựng quy trình sử lý mẫu theo phơng pháp chiết lỏng - lỏng.

2.3.2.3 Khảo sát điều kiện để định lợng AZI

Tiến hành chạy thử trên từng mẫu AZI, chuẩn nội (IS) và hỗn hợp AZI

và IS trong dung môi pha động để: * Khảo sát điều kiện khối phổ.

- Kỹ thuật MS một lần: phân tích toàn thang để xác định ion phân tử - Kỹ thuật SIM sử dụng ion phân tử để định lợng.

* Khảo sát điều kiện sắc ký.

- Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của AZI và IS trên các cột: Thermo C18 (50 x 2,1mm; 5àm) và Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5àm).

- Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên hệ pha động acetonitril : amoni acetat 0,05M với tỷ lệ khác nhau và chạy chế độ đẳng dòng hay gradient

- Tốc độ dòng: thay đổi lu lợng pha động từ 0,2 – 0,6ml/phút để xác định đợc tốc độ phù hợp cho thời gian lu tối u.

- HT có AZI và IS.

Xử lý mẫu và tiến hành phân tích

* Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

Chuẩn bị mẫu chuẩn có AZI và IS trong pha động Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số: thời gian lu, tỷ số diện tích pic.

* Khoảng nồng độ tuyến tính, hàm đáp ứng

Chuẩn bị các mẫu HT trắng, thêm AZI và IS tạo thành các mẫu có nồng độ AZI từ 0,02 - 2 àg/ml, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.1 và tiến hành phân tích.

*LOD và LOQ

LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định đợc nhng không nhất thiết phải định lợng đợc trong điều kiện thí nghiệm cụ thể LOD đ-ợc coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N=3) LOQ là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lợng đợc với độ đúng và độ chính xác phù hợp LOQ đợc chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng Trong phơng pháp sắc ký độ nhiễu của đờng nền có thể thay cho tín hiệu của mẫu trắng.

Tiến hành xử lý các mẫu HT trắng và mẫu chuẩn có nồng độ AZI thấp dần và tiến hành phân tích.

* Độ đúng

Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu và tiến hành phân tích, so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lợng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lợng chuẩn đã cân và thể tích đã pha.

*Độ chính xác.

Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý nh trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sác ký, đánh giá độ lệch chuẩn tơng đối của các mẫu theo từng nồng độ.

2.3.2.5 Xác định hiệu suất chiết

Chuẩn bị các mẫu AZI trong HT trắng ở 3 nồng độ khảo sát, mỗi nồng độ làm 3 mẫu, song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động ở 3 nồng độ tơng ứng Đánh giá hiệu suất chiết thông qua so sánh chỉ số diện tích pic trung bình trong HT so với trong pha động ở từng nồng độ tơng ứng.

2.3.3 Định lợng thăm dò AZI trong HT ngời uống AZI

Tiến hành lấy máu định lợng AZI trong HT 2 ngời tình nguyện sử dụng chế phẩm có chứa AZI ( uống 2 viên nén Athromax hàm lợng 250 mg) Mỗi ngời đợc lấy máu ở 2 thời điểm, sau uống thuốc 1 giờ và 1,75 giờ Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy HT thêm chuẩn nội, xử lý mẫu và tiến hành phân tích.

2.3.4 Phân tích số liệu thực nghiệm

Tính toán các số liệu: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn t-ơng đối, pht-ơng trình hồi quy và hệ số tt-ơng quan hồi quy bằng cht-ơng trình phần

Chơng 3: Kết quả

3.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Từ các tính chất lý hóa của AZI và theo các tài liệu đã công bố, trên cơ sở điều kiện hiện có chúng tôi xây dựng quy trình chiết AZI từ HT theo phơng pháp chiết lỏng-lỏng.

- Kiềm hóa bằng Na2CO3 0.05M - Dung môi chiết: Diethyl ether - Thể tích dung môi:10ml - Thời gian lắc xoáy: 3 phút

- Nhiệt độ cô bay hơi dung môi: 45oC

Quy trình xử lý mẫu đợc trình bày cụ thể tại hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết AZI trong HT

3.2 Khảo sát quy trình định lợng AZI trong dung môi bằng HPLC detector huỳnh quang.

Định lợng AZI trong nền mẫu HT bằng phơng pháp HPLC với detector huỳnh quang đòi hỏi trải qua quá trình xử lý mẫu phức tạp và quá trình dẫn xuất hóa để tạo chất phát huỳnh quang Trớc hết, tiến hành khảo sát trên mẫu AZI chuẩn pha trong acetonitril Để hạn chế các sai số có thể gặp phải chúng tôi lựa chọn sử dụng chất nội chuẩn Qua quá trình khảo sát chúng tôi chọn CLA là một chất có nhiều tính chất tơng đồng với AZI làm chất nội chuẩn.

*Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc AZI: Cân chính xác một lợng chất chuẩn AZI pha trong acetonitril sao cho thu đợc dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000

àg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc AZI pha loãng bằng acetonitril để thu đợc các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ lần lợt là 5, 10, 25, 50, 100 àg/ml

- Dung dịch nội chuẩn CLA 50 àg/ml trong acetonitril

*Dung dịch dẫn xuất huỳnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml pha trong acetonitril

*Dung dịch đệm Borat 0,1M pH 7,4 (0,625g acid boric và 0,750 KCl pha trong 100ml nớc, chỉnh pH tới 7,4).

3.2.1.Điều kiện chạy sắc ký để định lợng AZI

Qua khảo sát các điều kiện phân tích, chúng tôi đã chọn lựa điều kiện phân

3.2.2 Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang

Dẫn xuất hóa với FMOC-Cl để tạo dẫn xuất phát huỳnh quang

Theo các nghiên cứu trớc đây, nhiều tác giả đã sử dụng FMOC-Cl để tạo dẫn xuất huỳnh quang cho định lợng nhiều chất thuộc nhóm Macrolid, trong đó có AZI Chúng tôi triển khai nghiên cứu các điều kiện phản ứng cho tối u với điều kiện ở phòng thí nghiệm Dung dịch dẫn xuất hóa FMOC-Cl đợc pha trong acetonitril với nồng độ giữ cố định 0,5mg/ml và phản ứng đợc thực hiện ở pH 7,4 [10] Hai thông số chúng tôi khảo sát thêm là nhiệt độ tiến hành phản ứng và thời gian phản ứng.

*Chuẩn bị dung dịch chuẩn tiến hành dẫn xuất hóa

Chuẩn bị 5 ống nghiệm thủy tinh có nắp kín và tiến hành theo bảng sau:

Bảng 3.1: Quy trình tạo dãy mẫu chuẩn và dẫn xuất hóa

Giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác, chỉ thay đổi nhiệt độ từ 30, 40, 50, 60, 70o C Kết quả đợc thể hiện theo biểu đồ sau:

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang

Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 500C là nhiệt độ mà phản ứng đạt đợc hiệu suất tốt nhất

* Khảo sát thời gian phản ứng

Giữ nguyên nhiệt độ phản ứng tối u là 50oC, thay đổi thời gian phản ứng trong khoảng từ 30 đến 60 phút Kết quả thu đợc theo biểu đồ sau:

Hình 3.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang

Kết quả cho thấy phản ứng xảy ra tốt nhất trong vòng khoảng 40 phút, do đó chúng tôi quyết định chọn thời gian phản ứng là 40

3.2.3 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu thẩm định.

- Mẫu có AZI và CLA

Tiến hành dẫn xuất hóa và chạy sắc ký.

Hình 3. 7 : Sắc ký đồ mẫu có AZI và CLA

Nhận xét: trên sắc ký đồ mẫu trắng tại các vị trí tơng ứng với thời gian

lu của các pic AZI và CLA đã dẫn xuất hóa không xuất hiện pic lạ, các pic AZI và CLA cân đối, sắc nét, tách riêng biệt Từ các kết quả trên cho thấy phơng pháp có tính chọn lọc tốt.

*Tính phù hợp của hệ thống HPLC:

Chuẩn bị mẫu chuẩn có Azi nồng độ 10àg/ml và CLA nồng độ 5àg/ml và tiến hành phản ứng dẫn xuất hóa và phân tích theo điều kiện sắc ký đã xác định Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số: thời gian lu, tỷ số diện tích pic.

Bảng 3.2.: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống HPLC

Nhận xét: độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số phân tích đều nhỏ

hơn 3%, điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp chấp nhận đợc.

*Khoảng tuyến tính:

Chuẩn bị các mẫu có nồng độ AZI từ 0,5 – 10,0 àg/ml và CLA có nồng độ cố định 5,0àg/ml, tiến hành dẫn xuất huỳnh quang, phân tích theo quy trình đã xác định.

Bảng 3.3: Sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích pic và nồng độ AZI

Nhận xét: Từ các kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa

tỷ số diện tích pic (AZI/CLA) và nồng độ AZI Đờng chuẩn hồi quy có dạng thẳng và hệ số tơng quan lớn hơn 0,999 chứng tỏ có sự tơng quan tuyến tính