So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.DOC

So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.

đặt vấn đề

Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiềuloại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khácnhau Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1]

Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli,

điều trị bệnh lỵ Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn,không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của vi khuẩn có ích ở ruột

Hiện nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏmắt, viên nén, viên bao… Vì vậy vấn đề kiểm tra chất l Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lợng nguyên liệu làmthuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng

Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệmnguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổhấp thụ tử ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberinbằng HPLC Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp,

chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “ So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III ” với nhữngmục tiêu sau:

 Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLCtheo dợc điển Trung Quốc (2005)

 Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đoquang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III

 So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thíchhợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất l-

ợng thuốc trong nớc

PHầN I TổNG QUAn 1.1 vài nét Về BERBERIN:

Cấu trúc của isoquinolin

Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C20H18NO4+ PTL: 336.36

Tên khoa học : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a

– azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]

1.1.2 Nguồn gốc: Berberin thờng có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây

thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18] Berberin cónhiều trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là82% so với alcaloid toàn phần [9]

Berberin thờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nh: palmatin,jatrorrhizin Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5

% [6],[13]

1.1.3 Tính chất

- Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng Tan trong nớcnóng, khó tan trong ethanol và nớc lạnh, rất khó tan trong cloroform, khôngtan trong ether.[6]

1.5 Tác dụng dợc lý:

- Berberin có tác dụng kháng vi trùng nh: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu vàliên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùnggây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đờng ruột) [12], [17]

- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽkhông ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi

dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởicác thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17].

- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế cocơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanhthất, giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuấthuyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừbilirubin[17]

Chỉ định: [9],[12],[17]

- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật

và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt

- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng,gió, lạnh, bụi, khói… Vì vậy vấn đề kiểm tra chất l) và điều trị bệnh đau mắt hột

- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas

1.1.6 Chống chỉ định: [17]

- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin

- Ngời dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)

ơng đơng thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khimàu xanh biến mất thì dừng

Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện

1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tơng ứng với 12,39 mg C20 H18NO4Cl.

1.2.2 Phơng pháp đo UV-vis

 Phơng pháp 1:[6].

* Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nớc bằngcách đun nóng Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000ml Lấy 10ml dungdịch này pha loãng với nớc đến 100ml

* Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốcthử chuẩn đã sấy khô ở 1100C trong 4 giờ, hòa tan trong nớc Thêm 10ml dungdịch acid sulfuric 1N và thêm nớc vừa đủ 1000ml

* Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ởbớc sóng 421 nm

* Cách tính: Lợng ( mg) của C20H18NO4Cl đợc tính bằng công thức sau: a

As

At

006 , 1 1

a: khối lợng ( mg) kali dichromat

 Phơng pháp 2 [6]

Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén

* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thànhbột mịn Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mgberberin clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng200ml nớc sôi, khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml,thêm nớc tới vạch, lắc đều Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm Lấy chính xác5ml dung dịch trong ở trên đem pha loãng với nớc cất vừa đủ 100ml

* Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếuberberin clorid

Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lợng bột viên

t-ơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml,thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm

methanol đến ngấn Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu.Lấy đúng 100ml dịch lọc Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm150ml dung dịch NaOH 0,1N và 90ml nớc, đun nóng Lắc kỹ để hòa tan Đểnguội rồi lọc qua giấy lọc đã thấm ớt Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần10ml nớc.

Gộp dịch lọc và nớc rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N rồitiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT) Lắc đều Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đờng kính lỗ xốp 10– 16 m ( đã cân bì) để lấy tủa Rửa tủa 3 lần với nớc cất ở khoảng 150C, mỗilần 15ml nớc, hút kiệt nớc rồi sấy khô phễu và tủa ở 1000C đến khối lợngkhông đổi Khối lợng tủa xác định là P (g)

1 g tủa tơng ứng với 0,6586 g C20H18NO4Cl

1.2.4 Phơng pháp HPLC

 Phơng pháp 1:[14], [15].

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) đợc nhồi bởi hạt silicagel đã

đợc octadecylsilan hóa có đờng kính 5 m

- Nhiệt độ cột: 400C

- Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong

1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1)

- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lu của berberinkhoảng 10 phút

* Cách tính: Lợng Wt (mg) của berberin clorid (C20H18ClNO4)

Wt = Ws x (At / As)

Ws = Lợng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lợng khan

 Phơng pháp 2: [13]

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Cột đợc nhồi bởi các hạt silicagel đã đợc octadecylsilan hóa

- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kalidihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2%triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril(60:40)

1.3.1 Nguyên tắc

Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và

định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa cácchất với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cộthiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợpcác chất cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào phatĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bơmdung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của cácchất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sựphân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi

là detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng đợc hiển thịtrên màn hình hoặc đa ra máy in [8]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển vàphân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển vớimột tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ rakhỏi cột Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửagiải tách đợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký,chúng ta có sắc đồ [8], [11]

to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách

tR (thời gian lu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích đợc bơm vào cộtcho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích

tR’ (thời gian lu thực ) = tR- to

W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao

Wb: Độ rộng đáy pic

1.3.2.1 Hệ số dung lợng k’

Nếu k' nhỏ thì

tR cũng nhỏ và sựtách kém Trong thực

tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất Hai chất chỉ đợc tách ra khỏi nhaunếu chúng có giá trị khác nhau

1.3.2.2 Độ chọn lọc  (selectivity - factor)selectivity - factor))

=

t

t '

k

0 1 R

0 2 R 1

2





 (k2' > k1' ) [4], [8]

 khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2

1.3.2.3 Độ phân giải (selectivity - factor)r)esolution)

Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:

w

t

t w

2 / 1 B 2 / 1

A , R B , R A

B

A , R B ,

4

N 18

AF w1 / 20



[4], [8]

Trong đó:

W1/20: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờngcong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lợng đợc chấpnhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tợng kéo đuôi càng rõ Hiện tợng đỉnhkéo đuôi (tailing peak) có thể là do tơng tác giữa chất cần phân tích và phatĩnh hoặc cột sắc ký bẩn Đỉnh kéo tuyến trớc (fronting peak) có thể do lợngmẫu đa vào quá lớn so với năng lực cột [7]

k

0

R 0

0 R 0



B2/1

1.3.4 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC baogồm 6 bộ phận chính sau:

a/Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0

- 400 bar)

a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ Dungmôi chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 m ) và

đuổi khí hòa tan

c/ Hệ tiêm mẫu

Để đa mẫu phân tích vào cột

Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụngmột van tiêm Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động

Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể đợc tiêm ngay sau khi lọc loại tạpqua màng lọc 0,45 m, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi thích hợp

f/ Thiết bị hiển thị kết quả

Có nhiều loại nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu

đo dới dạng pic

Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 2

Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC

1.3.5 Cách đánh giá pic[7]

* Đánh giá diện tích pic : Diện tích của một chất tơng ứng với tổng

l-ợng chất đó Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân

điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học(sai số 1,3 %) Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờngnền và cả pic có đờng nền bị trôi Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuốicủa pic đợc nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình

và cao

* Đánh giá chiều cao pic : Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic

và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ

độngBơm

Van tiêmmẫu

dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì

đi qua dung dịch

Mối quan hệ giữa I và Io đợc thể hiện bằng định luật Lambert-Beer

I = Io  10 -εCl

Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch Hệ số này không phụ thuộcvào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bớc sóng của ánh sángchiếu vào dung dịch

1.4.1.2 Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer

+ Chùm tia sáng phải đơn sắc

+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)

+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang)

+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánhsáng (UV-VIS)

1.4.1.3 Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer

+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) nh

do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém

+ Sai lệch do hoá học:

- Do sự phân ly (ion hoá): thờng gặp khi pha loãng dung dịch, phân tửchất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân lykhông nh nhau

- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khácdạng đơn phân tử

+ Do phản ứng các chất lạ:

Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện t ợng này xảy ra, ngời ta dùng mẫu trắng có thành phần nh dung dịch, chỉ thiếuchất cần định lợng

- Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hởng tới kết quả định ợng Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu, phải chú ý tới điều kiệnphản ứng và các thành phần tham gia phản ứng

l-1.4.1.4 Một số đại lợng thông dụng[

a/ Độ truyền qua (T-Transmittance):

Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trng cho độ trong suốt(về mặt quang học) của dung dịch, đợc định nghĩa:

b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance):

Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) đợc định nghĩa :

A = lg 1

T = ε.C.l

Đối với một chất xác định (có ε xác định), thờng đo trên một loại cốc đo(có bề dày thông thờng là l=1 cm), nh vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độdung dịch:

A=K.C (K=ε.l)

c/ Hệ số hâp thụ phần trăm (E11%cm ):

Theo công thức A =ε.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì :

A = ε = E11%cm

Vậy E11%cmchính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo

có bề dày 1cm Với một chất tan xác định, tại một λ xác định, E11%cm là mộthằng số

cm

E và εμ có mối liên hệ εμ =

1 1%

10

cm

E

 M

ở đây M là phân tử gam của chất tan

1.4.2 Một số kỹ thuật định lợng bằng phơng pháp quang phổ UV-VIS.[2],

[4],[8]

 Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.

 Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị λmax xác định cho trong tàiliệu )để kiểm tra lại máy

 Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thànhdung dịch có nồng độ chính xác Đo phổ tìm các giá trị λmax và tìmAmax

A

A x Cc

Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc không

đ-ợc chênh lệch nhau quá nhiều Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quảcàng chính xác

Ngoài ra còn có các kỹ thuật định lợng khác nh: phơng pháp đờng chuẩn,phơng pháp thêm đờng chuẩn, phơng pháp chuẩn độ đo quang, phơng pháp

định lợng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ

Phần 2: thực nghiệm và kết quả

2.1 Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử:

2.1.1.1 Đối tợng nghiên cứu:

Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lợng 83,3% do Viện kiểm nghiệmthuốc TW cung cấp

Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ môn Hoá Dợc cung cấp Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp

2.1.1.2 Hoá chất, thuốc thử:

Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric(H3PO4)

Heptane sodium sulfonate, triethylamine

Acetonitril dùng cho HPLC (Merk)

Nớc cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trờng đại học Dợc

Hà Nội) dùng cho máy HPLC

Một vài hóa chất khác

2.1.2.1 Chỉ tiêu nghiên cứu:

Phân tích mẫu thử bằng phơng pháp HPLC và phơng pháp đo quangphổ hấp thụ UV- VIS

Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu củahai phơng pháp trên

So sánh 2 phơng pháp trên

2.1.2.2 Phơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:

 Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn

Dữ liệu thu đợc đợc xử lý bằng phơng pháp thống kê - sử dụng công

cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel

i xi

n

1 x

- Độ lệch chuẩn:

1 n

x S

n

1 i

2 i

+ Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2

phơng pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn =

2 1 2 2

 Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1

+ Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơngpháp khác nhau :

Cách tiến hành :

+ Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hoà tan trong 200 ml nớcbằng cách đun nóng Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000 ml Lấy 10 mldung dịch này pha loãng với nớc đến 100 ml (C = 20g/ml)

+ Dung dịch chuẩn đợc pha tơng tự dung dịch thử , dùng chất đốichiếu berberin clorid

+ Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng

điều kiện tại bớc sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nớc cất, cốc đo dày 1cm



  C

Trong đó :

C% : Hàm lợng % Berberin clorid có trong mẫu thử

C : Hàm lợng % Berberin clorid có trong mẫu chuẩn

At : Độ hấp thụ của dung dịch thử

Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn

mt : Khối lợng tính bằng gam của Berberin clorid trong bộtnguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử

mc : Khối lợng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đãcân để pha dung dịch chuẩn