Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ pa của vi khuẩn bacillus anthracis

Khóa luận tốt nghiệp mở đầu Bệnh than bệnh nhiễm khuẩn cấp tính vi khuẩn Bacillus anthracis (B anthracis) gây cho gia súc, đặc biệt cho động vật ăn cỏ nh trâu, bò, dê cừu ngựa Bệnh than có khả lây nhiễm sang ngời thành dịch với tỷ lệ tử vong cao Bệnh có nhiều dạng biểu khác tuỳ theo cách tiếp xúc với bệnh, nhng nhìn chung, bệnh than bao gåm d¹ng: than thĨ da, than thĨ hô hấp, than thể tiêu hoá than thể màng nÃo Bệnh than bệnh vô nguy hiểm Nó mang số đặc điểm đợc trung tâm kiểm soát ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết trờng hợp làm vũ khí sinh häc nh thêi gian l©y nhiƠm nhanh, tû lƯ g©y chết cao, tác nhân gây bệnh chống chịu đợc với điều kiện khắc nghiệt Chính vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than tác nhân gây bệnh than quan trọng Kháng nguyên tái tổ hợp PA loại độc tố than vi khuẩn Bacillus anthracis PA nhân tố định tính độc vi khuẩn than Bản thân PA không gây độc nhng kết hợp với nh©n tè g©y chÕt LF hay nh©n tè g©y phï thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết phï thịng cho tÕ bµo vËt chđ Ngoµi ra, PA có chứa vùng liên kết thụ thể có khả gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than Chính vậy, có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than nh tạo vaccine phòng chống bệnh than Trên giới đà có nhiều công trình công bố việc biểu gan pagA mà hoá kháng nguyên bảo vệ PA Tuy nhiên, Việt Nam vấn đề đợc quan tâm Đáp ứng yêu cầu cấp bách phòng trừ bệnh than, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu gen mà hóa kháng nguyên bảo vệ PA vi khuẩn Bacillus anthracis Mục tiêu đề tài: Biểu protein PA vi khuÈn B anthracis E coli BL21,  Thu nhận protein PA với lợng lớn để tinh Nhiệm vụ đề tài: Thiết kế vector biểu pET-TRX-FUS mang gen pagA, Nghiên cứu tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA, Tìm điều kiện thích hợp cho trình biểu vỊ nhiƯt ®é, nång ®é IPTG, thêi gian,  Tinh đợc protein cột sắc kí lực Probond Nikel Resin Trang 04-04 Lª Thu Khãa luËn tốt nghiệp Chơng I Tổng quan tài liệu I Sơ lợc bệnh than Lịch sử xuất phát triển bệnh than Bệnh than hay gọi bệnh nhiệt thán, đà gây thiệt hại vô to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc nh làm ảnh hởng tới sức khoẻ ngời Vì mà đợc đặt tên Black Bane nghĩa thảm hoạ đen, bị nhiễm bệnh, vết thơng có màu đen [1] Bệnh Than bắt nguồn từ Hy Lạp Anthrakos nghĩa than, vết thơng da có màu đen Bệnh than đợc tìm John Bell vào cuối kỷ 15 Năm 1876, Robert Kock đà tìm nguốn gốc bệnh than trình hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis (B anthracis) BÖnh than thêng xuÊt hiÖn ë trang trại vào thời điểm định, đặc biệt vùng nông nghiệp phía Nam Châu Mỹ Châu Phi Bệnh thờng gặp động vật ăn cỏ nh: cừu, dê, ngựa, trâu bò Đặc biệt bệnh lây nhiễm sang ngời nên đợc coi mối hiểm hoạ đe doạ cho sức khoẻ cộng đồng Trận dịch Than đợc biết đến Lịch sử xảy năm 1500 Trớc Công Nguyên làm chÕt nhiỊu vËt nu«i cđa ngêi Ai CËp Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Năm 1491 Trớc Công Nguyên, tiếp tục lốc bệnh Than Ai CËp lµm chÕt nhiỊu gia sóc, vµ lµm nãng lên kiện bệnh Than Những năm 1960, bệnh than đà làm chết khoảng 60.000 gia súc Châu Âu Năm 1789, trận dịch bệnh than lan tràn vùng Tresnobin (Nga) Tháng 4/1979, Sverdlovsk, Liên Xô Ekatarinbua, xảy trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 ngời [20] Sau vài năm, trận dịch tơng tự xảy Paraguay Năm 1989, miền Bắc xứ Wales xảy trận dịch than lớn Ngời ta phải giết 4492 gia súc bị nhiễm than áp dụng biện pháp sát trùng chất thải, nhà cửa, thiết bị, đờng xá, đất đai fomalin Năm 1978- 1980, trận dịch than Zimbabwe làm 6000 ngời bị nhiễm bệnh vµ 100 ngêi chÕt Sau sù kiƯn ngµy 11/9/2001, bän khủng bố sinh học đà dùng bào tử vi khuẩn B anthracis công số bu điện Mỹ phong bì th làm ngời chết 17 ngời bị nhiễm bệnh [1] Trận dịch Than gần ngày 14/6/2005 xảy quốc gia nhỏ Châu Phi làm chết ngời 80 ngời bị nhiễm bệnh [27] Việt Nam, bệnh Than đà xuất từ lâu nhng đợc thông báo Theo số liệu thống kê Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng, năm 1997 có 30 ngời mắc bệnh Than, năm 1998 có 59 ngời, năm 1999 có 58 ngời Riêng năm 2000 có 27 ngời mắc bệnh than, có 12 ca Cao B»ng, Trang 04-04 Lª Thu Khãa luËn tèt nghiệp 11 ca Lai Châu, ca Đồng Nai, nhiên ca bị tử vong Hầu hết ca mắc phải tập trung miền núi chăn nuôi gia súc lớn nh Thanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2] Đối với trờng hợp mắc bệnh than nớc ta hầu hết tiếp xúc với động vật ăn cỏ nh trâu, bò, ngời làm nghề thuộc da chế biến xơng [28] Các dạng bệnh than Bệnh Than thờng xuất loài động vật hoang dà nh động vật nuôi, đặc biệt loại gia súc ăn cỏ nh trâu, bò cừu, la, ngựa, dê chúng hít phải nhiễm phải bào tử than đất ngời, nguy mắc bệnh than tiếp xúc với động vật ăn cỏ [29] Bệnh than nhiễm vào thể vật chủ theo ba đờng: qua da, qua đờng tiêu hoá đờng hô hấp Bệnh than biến chøng thµnh thĨ than mµng n·o nÕu hÝt vµo bµo tử than Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà ngời ta chia bệnh than thành thể than khác nhau: Than da, than tiêu hoá, than hô hấp, than màng nÃo [19] 2.1 Bệnh than thể da Đây hình thức thức than phổ biến chiếm 90% loại bệnh có khả điều trị Bệnh thờng gặp nhóm đối tợng nguy lây nhiễm cao, thờng xuyên tiếp xúc với động vật sản phẩm từ gia súc đà bị nhiễm than, thờng ngời nông dân, bác sỹ thú y, ngời giết mổ gia súc hay thịt Từ vết thơng hở da, vi khuẩn hay bào tử B anthracis xâm nhập vào Trang 04-04 Lê Thu Khãa ln tèt nghiƯp H×nh 1.1: BƯnh than thĨ da Triệu chứng bệnh: Sau 1-2 ngày đầu thấy xuất vết sẩn ngứa nh côn trùng đốt, xuất dấu hiệu ngoại tử vùng tâm Sau 2-3 ngày xuất mụn nhỏ hay nốt nhú vị tri nhiễm, xung quanh xuất mụn nớc Vài ngày sau, vùng trung tâm vết loét xuất nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy Trong khoảng 1-2 tuần kể từ nhiễm bệnh xuất mủ tợng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, hạch bạch huyết tăng lên Sau vùng thơng tổn chuyển sang dạng tự phát Nếu bệnh nặng thêm vết loét lan rộng ăn sâu làm nhiễm trùng máu dẫn đến chữa khỏi Than da gây tử vong khoảng 20% trờng hợp không đợc điều trị 2.2 Bệnh than thể tiêu hoá Nguyên nhân bệnh than thể tiêu hoá ăn phải thịt gia súc đà bị nhiễm bào tử than mà không đợc nấu Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp chín, chí đợc nấu chín khả gây bệnh cao [2] Ngời ta tìm thấy vi khuẩn than dịch ruột bệnh nhân mắc bệnh than Đầu tiên vi khuẩn công vào vị trí thơng tổn màng ngày ruột dày Từ vị trí xuất vết loét, lan rộng lan vào hệ bạch huyết Bệnh than tiêu hoá thờng gặp nhng lại có tỷ lệ tử vong cao Bệnh thờng có hai thể lâm sàng [11]: Thể bụng: dấu hiệu dễ nhận có thơng tổn xuất huyết hoại tử manh tràng vùng lân cận Triệu chứng ban đầu không đặc biệt với cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao Sau triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc nhiễm trùng tử vong Bệnh nhân viêm phúc mạc viêm lách vi khuẩn công vào khu bạch huyết Sau 2-3 ngµy kĨ tõ xt hiƯn dÊu hiƯu cđa bƯnh gây tử vong Thể họng, miệng: Tại vùng thơng tổn thấy xuất hoại tử vùng vòm họng, cỉ häng cøng, sng amidan BƯnh nh©n sèt cao, khã nuốt, hạch vùng cổ sng to, nhiễm độc máu đa số dẫn đến tử vong Dạng than có tû lƯ tư vong cao chiÕm 50% mỈc dï cã đợc điều trị Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.2: Manh tràng đà bị nhiễm vi khuẩn than 2.3 Bệnh than hô hấp Nguyên nhân gây than hô hấp hít phải bào tử than Sau vào thể, bào tử than phát triển thành thể hoạt động di chuyển tới phế nang, hạch lympho phổi trung thất gây xuất huyết hoại tử phù thũng làm trung thất giÃn rộng hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt cao Các thơng tổn xuất huyết hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi Khí quản bị ảnh hởng với triệu chứng nh ho khan, co thắt, vùng phổi bị phù Vi khuẩn theo đờng máu lan đến phần dới niêm mạc ống tiêu hoá tạo nên vết loét thành ruột làm bệnh nhân nôn máu, tiêu hoá máu hai triệu chứng Một số nang Lympho đờng tiêu hoá bị phù xung huyết, bệnh nặng biến chứng sang thể màng nÃo gây xuất huyết Đa số bệnh nhân tử vong khoản 1- ngày kể từ phát bệnh Tû lƯ tư vong cđa bƯnh than nµy rÊt cao Trang 04-04 Lª Thu Khãa ln tèt nghiƯp Hình 1.3: Trung thất dÃn hít phải bào tư than 2.4 BƯnh than thĨ mµng n·o BƯnh thêng biến chứng từ ba thể than Than màng n·o xt hiƯn vi khn B anthracis tÊn c«ng vào hệ thống thần kinh trung ơng theo đờng máu mạch bạch huyết Triệu chứng bệnh thờng sốt cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn lên mê sảng phát bệnh dẫn đến hôn mê Đa số bệnh nhân thờng dẫn đến tử vong sau 1- ngày kể từ mắc bƯnh ThĨ than nµy cã tû lƯ tư vong rÊt cao Hình1 4: NÃo ngời bị nhiễm bệnh than BƯnh than vµ chiÕn tranh sinh häc Søc tµn phá bệnh than vô to lớn, đồng thời dễ chuẩn bị phát tán nhanh nên đà đợc sử dụng nh loại vũ khí sinh học làm tê liệt thành phố, chí quốc gia [24] Trang 04-04 1 Lê Thu Khãa ln tèt nghiƯp Trong chiÕn tranh thÕ giíi thứ nhất, bệnh than đà đ ợc sử dụng nh thứ vũ khí vô lợi hại Một vài nớc nh Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh, Iraq Liên Xô cũ đà thừa nhận sử dụng bệnh than làm phơng tiện chiến tranh [30] Năm 1915, Mỹ đà tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để cung cấp cho nớc chiến tranh giới thứ Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than MÃn Châu Lý (Trung Quốc) Năm 1942, Liên hiệp Anh tiến hµnh thư nghiƯm vị khÝ bƯnh than ë Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triĨn vị khÝ bƯnh than Sau chiÕn tranh thÕ giíi thø hai, Mü vÉn tiÕp tơc thùc hiƯn chiÕn tranh sinh học Fort Detrick, Maryland Mặc dù năm 1972, quy ớc Quốc tế cấm phát triển dự trữ vũ khí sinh học nhng chiến tranh khủng bố tiếp diễn Năm 1979, bào tử than đà đợc phóng thích quân đội Liên Xô cũ làm chết 68 ngời Năm 1991, lính Mỹ đợc tiêm phòng vaccine bệnh than để chuẩn bị cho chiến tranh vùng vịnh Năm 1990-1993, nhóm khủng bố Aum Shinrikyo đà phóng thích bệnh than Tokyo nhng không gây tổn thơng Năm 1995, Iraq thừa nhận đà tạo 8.500 th có chứa tác nhân gây bệnh than Ngày 22/10/2001, th có chứa bào tử than đợc chuyển đến bu điện Mỹ làm ngời chết, 17 ngời bị nhiễm bệnh Sự kiện đà làm đau đầu nhà cầm Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Cả mẫu đối chứng cảm ứng đợc nuôi 370C với tốc độ 200 vòng/phút 4h Hình 3.11: Điện di biĨu hiƯn protein PA trªn gel polyacrylamid 12,6% GiÕng 1, 3, 6, mẫu sau cảm ứng IPTG Giếng 2, 4, 7, mẫu không cảm ứng Giếng 5: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Protein tái tổ hợp Thioredoxin- pagA-HisTag đợc hình thành kết nối protein víi nhau: TrxTag víi 127 axit amin, pagA víi 735 axit amin đuôi His-tag với axit amin, tổng cộng 868 axit amin với trọng lợng phân tử tính theo lý thuyết khoảng 98 kDa Hình 3.11 cho thấy, giếng có cảm ứng 1,3,6,8 xuất băng protein lạ có kích thớc khoảng gần 100kDa nh tÝnh to¸n lý thut Nh vËy cã thĨ sơ kết luận trình biểu đà thành công dới kiểm soát promotor Trang 04-04 7 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp T7 Ngoài ra, dòng đợc cảm ứng giếng số cho kết biểu tốt Do đó, lựa chọn dòng cho nghiên cứu Để xác định nhiệt độ thích hợp cho trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp PA, tế bào E coli BL21 đợc cấy lắc điều kiện nhiệt độ khác là: 250C, 280C, 300C, 370C Sau nuôi cấy, thu tế bào Điện di mẫu gel polyacrylamid 12,6% để tìm nhiệt độ tốt cho trình biểu Kết đợc biểu hình sau: Hình 3.12: Điện di mẫu protein theo nhiệt độ gel polyacrylamide 12,6% Giếng 1: Mẫu trớc cảm øng GiÕng 2: Thang DNA chuÈn (Fermentas) GiÕng 3, 5, 7, 9: lần lợt mẫu cảm ứng 250C, 280C, 300C, 370C Trang 04-04 Lª Thu Khãa luận tốt nghiệp Giếng 4, 6, 8, 10: lần lợt mẫu không cảm ứng 25 0C, 280C, 300C, 370C H×nh 3.12 cho thÊy biĨu hiƯn ë 30 0C 370C tế bào cảm ứng tổng hợp protein tốt nh nhng 370C nhiệt độ thích hợp cho enzym protease hoạt động thuỷ phân protein tái tổ hợp đợc tạo thành Do đó, lựa chọn nhiệt độ biểu 300C tốt Nồng độ IPTG yếu tố quan trọng việc cảm ứng biểu protein tái tổ hợp PA Do đó, sau lựa chọn nhiệt độ cảm ứng 300C, tiến hành xác định nồng độ IPTG tối thiểu cho trình lên men sinh tổng hợp PA Kết nghiên cứu nồng độ cảm ứng IPTG 0,2; 0,5; 0,7; 1; 2mM ®· thư nghiƯm cho thÊy tổng hợp protein PA tối u đợc cảm ứng 1mM Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hởng tới suất biểu protein tái tổ hợp PA, lợng protein đợc tổng hợp thời điểm khác Nếu thu sớm protein cha đợc tổng hợp tối đa, thu muộn sinh chất ức chế phân hủy protein đợc tạo thành Chính vậy, cố định nhiệt độ cảm ứng 30 0C, nồng độ IPTG cảm ứng 1mM khảo sát biểu protein tái tổ hỵp theo thêi gian (0, 1, 2, 3, 4, giờ) Mẫu đợc xử lý điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6 % Kết thể hình 3.13: Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.13: Điện di mẫu protein PA theo thêi gian trªn gel polyacrylamid 12,6% GiÕng 1: MÉu tríc c¶m øng GiÕng 2: Thang protein chuÈn chuÈn (Fermentas) GiÕng : 3, 4, 5, 6, 7, 8: lần lợt mẫu đợc cảm ứng với IPTG lúc 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h Hình 3.13 cho thấy lợng protein tái tổ hợp tạo thành tăng theo thời gian Lợng protein đợc tạo thành thời điểm tơng tự nh thời điểm 5h Nếu tiếp tục kéo dài thời gian lên men, lợng protein tái tổ hợp giảm trình lên men tạo chất ức chế phân hủy Do đó, lựa chọn thời điểm 4h để thu mẫu nhằm đảm bảo chất lợng sản phẩm chi phí lên men Trang 04-04 Lª Thu Khãa ln tèt nghiƯp 3.2 Xác định khả hoà tan protein Để xác định phơng pháp tinh protein tái tổ hợp PA thích hợp, tiến hành xác định khả hoà tan protein theo phơng pháp đà nêu điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12,6%, kết thể hình 3.14: Hình 3.14: Điện di protein tan không tan gel polyacrylamid 12,6% GiÕng 1: MÉu c¶m øng lóc 4h GiÕng 4: Thang DNA chn (Fermentas) GiÕng 2: MÉu tríc c¶m øng GiÕng 5: protein hoà tan Giếng 3: Mẫu không cảm ứng Giếng 6: protein không tan Khả hòa tan PA tái tổ hợp đợc đánh giá sở so sánh pha tan pha không tan lần Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp cảm ứng Pha tan phần dịch nổi, pha không tan (thể vùi) phần cặn thu đợc sau phá tế bào siêu âm ly tâm.Kết hình 3.14 cho ta thấy protein tái tổ hợp PA đợc tổng hợp chủ yếu dạng thể vùi, tinh điều kiện bình thờng mà phải siêu âm phá tế bào tinh điều kiện biến tính 3.3 Tinh chÕ protein dung hỵp b»ng cét Probond Nikel Resin Do protein tái tổ hợp có đuôi lực 6-Histidin, vËy sư dơng cét tinh chÕ b»ng ¸i lùc, chÊt giá đợc dùng để nhồi cột Ni+ Dịch tế bào biểu đợc nuôi với lợng 100ml, cảm ứng b»ng IPTG víi nång ®é ci cïng 1mM thêi gian tiếng Sau ly tâm, cặn tế bào đợc hòa lại 8ml dịch phá (Lysis Buffer) đợc siêu âm thời gian 20 phút Dịch phá tế bào đợc ly tâm, phần dịch có chứa protein tái tổ hợp đợc đa lên cột Các protein có đuôi His-Tag có lực với Ni+ đợc bám chặt chất giá cột Sau rửa cột đệm rửa (Wash Buffer) protein E coli bị trôi khỏi cột protein có lực đợc giữ lại Sau protein có lùc khái cét nhê buffer ®Èy (Elution Buffer), chóng thu khoảng phân đoạn, phân đoạn 1ml Sau tinh chế protein đợc kiểm tra độ điện di gel polyacrylamid 12,6% (Hình 3.15): Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.15: Điện di protein sau tinh gel polyacrylamid 12,6% Giếng 1-7: Các phân đoạn đẩy khỏi cét (#7- #1) GiÕng 8: Protein tríc tinh s¹ch Giếng 9: Mẫu không cảm ứng Giếng 10: Thang protein chuẩn (Fermentas) Sau tinh hình 3.15 xuất băng tơng đơng với kích thớc protein tái tổ hợp trớc tinh (98kDa) Nh vậy, protein tái tổ hợp PA đà đợc tinh thành công cột sắc ký lực His- tag Trang 04-04 Lª Thu Khãa ln tèt nghiƯp Trang 04-04 Lª Thu Khãa ln tèt nghiƯp Kết luận Đà thiết kế thành công vector biểu hiƯn pET TRX pagA ®ã vector pET TRX cã chứa trình tự mà hóa protein Thioredoxin acid amin Histidine Đà biểu thành công gen pagA mà hoá kháng nguyên bảo vệ PA vi khuẩn B anthracis E coli BL21 Đà khảo sát ®ỵc ®iỊu kiƯn biĨu hiƯn protein PA vi khn E coli BL21, nhiệt độ thích hợp cho cảm ứng tổng hợp protein PA 300C, nồng độ IPTG 1mM thời gian kết thúc cảm ứng 4h Đà tinh đợc protein tái tỉ hỵp PA b»ng cét Probond Nikel Resin Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Mở đầu .1 Chơng I Tổng quan tài bệnh liệu .3 I Tìm hiểu sơ lợc than. Lịch sử xuất phát triển bệnh than Các dạng bệnh than ……………4 2.1 BƯnh than thĨ da…………………………………………… 2.2 BƯnh than thể tiêu hoá. 2.3 Bệnh than hô hấp 2.4 BƯnh than thĨ mµng n·o………………………………………7 BƯnh than vµ chiến tranh sinh học II Tác nhân gây vi khuẩn bệnh than.9 Đặc điểm B anthracis..10 Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp Độc tè cđa vi khn B anthracis……………………… ……… 12 2.1 §éc tố vỏ nhày 12 2.2 Độc tố than 12 2.2.1 Kháng nguyên bảo vệ (Protective AntigenPA) .13 2.2.2 Tác nh©n g©y phï thịng (Edema Factor EF)… … ….13 2.2.3 Nh©n tè g©y chÕt (Lethal Factor- LF) …………….… …14 Điều khiển biểu gen gây độc vi khuẩn B.anthracis ..16 III Kháng nguyên bảo vệ PA 17 Vai trò kháng nguyên bảo vệ PA 17 Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA 19 Cơ chế dẫn truyền độc tố kháng nguyên bảo vệ PA. 21 IV Gen mà hoá kháng nguyên bảo vệ PA .22 V Biểu gen pagA mà hoá kháng nguyên bảo vệ PA 24 Trang 04-04 Lª Thu Khãa ln tèt nghiƯp Tình hình nghiên cứu biểu gen pagA 24 BiĨu hiƯn gen pagA…………………………………………… 24 2.1 HƯ thèng biĨu hiƯn………………………………………… 24 2.1.1 Vector biĨu hiƯn………………………………………….24 2.1.2 HƯ thèng biĨu hiƯn……………………………………….27 2.2 Phơng pháp biểu 28 Chơng II Vật liệu phơng pháp 29 Vật liệu .29 1.1 Sinh phẩm 29 1.2 Hoá chất môi trờng .29 1.2.1 Hoá chất, dung dịch29 1.2.2 Môi trờng 35 1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 36 1.3.1 Dơng cơ………………………………………………… ….36 Trang 04-04 8 Lª Thu Khãa luận tốt nghiệp 1.3.2 Thiết bị 36 Phơng pháp nghiên cứu 37 2.1 Phơng pháp tách chiết DNA plasmid cña vi khuÈn B anthracis 37 2.2 Phơng pháp tinh plasmid.38 2.3 Phơng pháp làm tế bào khả biến E coli chủng DH538 2.4 Phơng pháp biến nạp vào tế enzym giới bào..39 2.5 Phơng pháp cắt hạn 39 2.6 Phơng pháp gel 40 2.7 Phơng pháp lai 41 2.8 Phơng pháp điện di gel agarose ..41 2.9 Điện di gel polyacrylamide.42 2.10 Phơng pháp PCR (Polymerase chain reaction) 43 2.11 Phơng pháp biểu gen 44 Trang 04-04 Lê Thu Khóa luận tốt nghiệp 2.12 Xác định khả hoà tan protein 45 2.13 Tinh chÕ protein dung hỵp b»ng cét Probond Nikel Resin ….….46 Chơng III Kết thảo luận mang gen 48 ThiÕt kÕ vect¬ biĨu hiƯn pagA .48 1.1 Th«i gel 49 1.2 Gắn đoạn gen pagA vào vectơ biểu hiƯn pET-TRXFUS 50 T¹o chđng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA .51 2.1 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biÕn E coli DH5α 51 2.2 T¸ch chiÕt DNA plasmid từ khuẩn lạc E coli DH551 2.3 Kiểm tra sù cã mỈt cđa gen pagA 52 2.4 KiĨm tra khung ®äc cđa gen pagA vect¬ biĨu hiƯn pET-TRX- FUS 54 2.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào biểu E coli BL21 .55 Trang 04-04 Lª Thu Khãa ln tèt nghiƯp 3BiĨu hiƯn gen pagA hƯ biĨu hiƯn E coli BL21…………….……….57 3.1 Tìm điều kiện biểu protein .57 3.2 Xác định khả hoà tan cđa protein…………………………… 59 3.3 Tinh chÕ protein dung hỵp b»ng cét Probond Nikel Resin 60 Trang 04-04 Lª Thu ... PCI vµ PACE4 IV Gen m· hoá kháng nguyên bảo vệ PA Kháng nguyên bảo vệ PA đợc mà hoá gen cấu trúc pagA nằm plasmid pXO1 Kháng nguyên bảo vệ PA thân độc nhng đợc coi thành phần quan trọng vi khuẩn. .. gen độc tố [22, 24] III Kháng nguyên bảo vệ PA Vai trò kháng nguyên bảo vệ PA Kháng nguyên bảo vệ PA thành phần quan trọng trình gây độc vi khuẩn B anthracis Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lợng... vi? ??c biểu gan pagA mà hoá kháng nguyên bảo vệ PA Tuy nhiên, Vi? ??t Nam vấn đề đợc quan tâm Đáp ứng yêu cầu cấp bách phòng trừ bệnh than, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu gen mà hóa kháng