SỬ DỤNG ENZYME LACCASE SINH TỪ NẤM ĐẨM ĐỂ LOẠI BỎ CHẤT Ô NHIỄM NỒNG ĐỘ THẤP

I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong thời gian gần đây, sự xuất hiện của các chất gây ô nhiễm nồng độ thấp (Micropollutants – MPs) trong môi trường nước đã trở thành một vấn đề môi trường toàn cầu. Khoảng 80% các dòng sông ở Mỹ (108 trên 139 dòng được khảo sát) bị ô nhiểm bởi hàng loạt MPs, bao gồm cả Bisphenol A và Triclosan (Kolpin và cộng sự, 2002). Chúng được sử dụng trong dược phẩm, sản phẩm chăm sóc cá nhân, các chất thay đổi hormone sử dụng cho người, hóa chất công nghiệp, thuốc trừ sâu và nhiều hợp chất khác. MPs tồn tại trong nước ở nồng độ rất thấp, từ một vài pg L tới một vài µg L. Sự đa dạng cũng như nồng độ rất thấp của MPs của các chất gây ô nhiễm này nên quan trắc, đánh giá chúng rất phúc tạp. Các phương pháp xử lý nước thải truyền thống cũng không xử lý được các chất ô nhiễm này (Yunlong và cộng sự. 2012) khiến MPs thoát thẳng vào môi trường nước một cách dễ dàng. Sự thải liên tục MPs vào môi trường dẫn tới nhiều hậu quả lâu dài cho hệ sinh thái (Daughton và cộng sự, 1999). Ở Việt Nam, nồng độ Bisphenol A được tìm thấy ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh cao hơn 3 lần so với các khu vực khác (từ 5.3 µgl tới 11 µgl). Nonylphenol được tìm thấy trong các kênh nước thải của Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh với nồng độ từ 0.02 – 9.7 µgl tới 2 – 20 µgl . Nồng độ nonylphenol trong các sông của Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh đã được kiểm định có thể gây nguy hại cho hệ sinh thái dưới nước (Yamamoto và c ộng sự., 2014). Hơn nữa, gần đây nồng độ quá mức cho phép của Triclosan được tìm thấy trong kem đánh răng đã gây ra tranh cãi. Tuy nhiên, giải pháp thích hợp để xử lý vấn đề này chưa được công bố. Ở Việt Nam, cũng chưa có nhiều nghiên cứu về MPs. Trong nghiên cứu 2 năm trước của chúng tôi cho thấy laccase sinh tổng hợp từ Cerrena sp. FBV41 đã loại được nhiều màu thuốc nhuộm hoạt tính và có hiệu quả cao trong tiền xử lý rơm rạ để tạo đường. Thực tế, laccase đã được các nhà nghiên cứu chứng minh khả năng oxy hóa MPs (Chairin và cộng sự, 2013). Sử dụng laccase có thể cản trở hoạt động của các chất kháng sinh trong nước thải (De Gunzburg và cộng sự, 2012), ngăn chặn ô nhiễm môi trường. Ví dụ, Margot và cộng sự cũng đã chỉ ra rằng 25% diclofenac và 95% mefenamic acid có thể bị loại trong 20 giờ bằng laccase từ chủng Trametes versicolor. Vì thế, laccase đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu. Đây là nghiên cứu có tính kế thừa và chọn đối tượng là một số MPs là một nhiệm vụ có tính mới và có tính ứng dụng cao.

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT VIỆT ĐỨC QUẬN HOÀN KIẾM – HÀ NỘI ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: SỬ DỤNG ENZYME LACCASE SINH TỪ NẤM ĐẨM ĐỂ LOẠI BỎ CHẤT Ô NHIỄM NỒNG ĐỘ THẤP (MICROPOLLUTANT) Lĩnh vực: Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN TÁC GIẢ: - GS TS Đặng Thị Cẩm Hà - Đặng Trần Quang - ThS Ngô Thị Huyền Trang - Lớp 12A3 Trường THPT Việt Đức - Đơn vị công tác: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội, tháng 12 năm 2014 MỤC LỤC Trang I Lý chọn đề tài II Tổng quan III Quá trình nghiên cưu kết 3.1 Vật liệu 3.1.1 Laccase 3.1.2 Micropollutants (MPs) 3.1.3 Chất hóa học sử dụng để nghiên cứu 3.1.4 Thiết bị máy móc 3.2 Phương pháp 3.2.1 Phương pháp phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 3.2.2 Xác định hoạt tính laccase 3.2.3 Loại bỏ MPs 3.2.4 Đánh giá hiệu loại bỏ MPs 3.3 Kết 3.3.1 Sự loại bỏ MPs 7 3.3.2 Ảnh hưởng chất gắn kết (CGK) tới hiệu suất loại bỏ MPs 3.3.3 Thảo luận IV Két luận 17 V Lời cảm ơn 17 VI Tài liệu tham khảo 18 MỤC LỤC Trang Hình 1.1 Cơng thức hóa học Bisphenol A Hình 1.2 Cơng thức hóa học Triclosan Hình 3.1: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA laccase từ FPT5 Hình 3.2: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS 11 12 laccase từ FPT5 Hình 3.3: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA 12 laccase từ FBV25 Hình 3.4: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS 13 laccase từ FBV25 Hình 3.5: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA 13 laccase từ FBV41 Hình 3.6: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS 14 laccase từ FBV41 Bảng 3.1: Hiệu suất loại bỏ bỏ Bisphenol A Triclosan 10 Bảng 3.2: Thống kê số nghiên cứu loại bỏ Bisphenol A Triclosan sử dụng enzyme laccase 16 I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong thời gian gần đây, xuất chất gây ô nhiễm nồng độ thấp (Micropollutants – MPs) môi trường nước trở thành vấn đề mơi trường tồn cầu Khoảng 80% dịng sơng Mỹ (108 139 dịng khảo sát) bị ô nhiểm hàng loạt MPs, bao gồm Bisphenol A Triclosan (Kolpin cộng sự, 2002) Chúng sử dụng dược phẩm, sản phẩm chăm sóc cá nhân, chất thay đổi hormone sử dụng cho người, hóa chất cơng nghiệp, thuốc trừ sâu nhiều hợp chất khác MPs tồn nước nồng độ thấp, từ vài pg / L tới vài µg / L Sự đa dạng nồng độ thấp MPs chất gây ô nhiễm nên quan trắc, đánh giá chúng phúc tạp Các phương pháp xử lý nước thải truyền thống không xử lý chất ô nhiễm (Yunlong cộng 2012) khiến MPs thoát thẳng vào môi trường nước cách dễ dàng Sự thải liên tục MPs vào môi trường dẫn tới nhiều hậu lâu dài cho hệ sinh thái (Daughton cộng sự, 1999) Ở Việt Nam, nồng độ Bisphenol A tìm thấy Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh cao lần so với khu vực khác (từ 5.3 µg/l tới 11 µg/l) Nonylphenol tìm thấy kênh nước thải Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh với nồng độ từ 0.02 – 9.7 µg/l tới – 20 µg/l Nồng độ nonylphenol sông Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh kiểm định gây nguy hại cho hệ sinh thái nước (Yamamoto cộng sự., 2014) Hơn nữa, gần nồng độ mức cho phép Triclosan tìm thấy kem đánh gây tranh cãi Tuy nhiên, giải pháp thích hợp để xử lý vấn đề chưa công bố Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu MPs Trong nghiên cứu năm trước cho thấy laccase sinh tổng hợp từ Cerrena sp FBV41 loại nhiều màu thuốc nhuộm hoạt tính có hiệu cao tiền xử lý rơm rạ để tạo đường Thực tế, laccase nhà nghiên cứu chứng minh khả oxy hóa MPs (Chairin cộng sự, 2013) Sử dụng laccase cản trở hoạt động chất kháng sinh nước thải (De Gunzburg cộng sự, 2012), ngăn chặn nhiễm mơi trường Ví dụ, Margot cộng 25% diclofenac 95% mefenamic acid bị loại 20 laccase từ chủng Trametes versicolor Vì thế, laccase chọn làm đối tượng nghiên cứu Đây nghiên cứu có tính kế thừa chọn đối tượng số MPs nhiệm vụ có tính có tính ứng dụng cao II TỔNG QUAN Mục tiêu nghiên cứu khảo sát khả loại chất MPs đại diện gồm Bisphenol A Triclosan enzyme laccase tạo từ chủng FBV41, FBV25 FPT5 thuộc sưu tập giống phịng Cơng nghệ Sinh học Tái tạo Mơi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hiện Việt Nam giới chưa có tiêu chuẩn, quy chuẩn nồng độ chất ô nhiễm nồng độ thấp cho phép xả thải môi trường (Deblonde cộng sự, 2011), mà chúng thải ngồi mơi trường mà việc thải liên tục dẫn tới nhiều hậu khó lường (Daughton cộng sự, 1999) Điểm tính sáng tạo đề tài đưa giải pháp kỹ thuật sử dụng enzyme laccase từ nấm đảm chủ động phân lập từ Việt Nam với nguồn đa dạng cao, hoạt tính laccase cao sản xuất dễ dàng để xử lý ô nhiễm môi trường MPs vốn chưa có giải pháp loại bỏ triệt để Đây biện pháp sinh học không gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường, chi phí khơng cao đầu tư nghiên cứu nghiêm túc kết hợp với công nghệ khác ý tưởng có tính ứng dụng đại trà Nghiên cứu nghiên cứu bước đầu để tìm giải pháp loại bỏ hồn tồn chất ô nhiễm nguy hiểm nói khỏi môi trường chất ô nhiễm nguy hiểm ảnh hưởng đến sống thường ngày sức khỏe cộng đồng Hướng nghiên cứu mà thực nhằm tạo sở thiết kế, xây dựng công nghệ hiệu bền vững Ngồi sử dụng thân nấm sống enzyme tự cố định laccase lên vật liệu nano để chế tạo màng xử lý sinh học phục vụ cho việc xử lý loại nước thải chứa MPs chất đa vịng thơm khác định hướng có tính áp dụng thực tế cao Việt Nam III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 Vật liệu 3.1.1 Laccase Các chủng nấm FBV25 phân lập từ gỗ mục từ rừng quốc gia Ba Vì FPT5 từ tỉnh Phú Thọ Riêng chủng FBV41 nhóm nghiên cứu chúng tơi phân lập từ đất rừng Ba Vì năm 2012 sử dụng để loại màu thuốc nhuộm có hiệu Ba chủng nấm lựa chọn để nuôi cấy thu dịch enzyme laccase thô cho nghiên cứu Laccase (EC 1.10.3.2) hợp chất oxi hóa polyphenol có khả xúc tác oxi hóa nhiều hợp chất hữu đa vòng thơm, đặc biệt chất có nhóm chức cho electron phenol (-OH) hay aniline (-NH2) cách sử dụng cách sử dụng phân tử oxi làm chất oxi hóa (Gianfreda cộng 1999) Laccase enzyme phổ biến tự nhiên có mặt nhiều loại thực vật, nấm số loài vi khuẩn trùng có nhiều chức phân hủy hợp chất polymer phức tạp (lignin, humic acid), lignin hóa, phân hủy độc, bệnh nhân tạo, tạo hình thái, hình thành bào tử, trùng hợp melanin (Strong & Claus 2011) Khả xúc tác laccase từ nấm (một có trợ giúp chất gắn kết) oxi hóa dược phẩm chất diệt cỏ diễn vài chất, ví dụ hợp chất nội tiết (Auriol cộng 2008; Cabana cộng 2007), thuốc giảm đau chống viêm (Lu cộng 2009; Marco-Urrea cộng 2010; 2013b Margot cộng sự), kháng sinh (Schwarz cộng 2010; Suda cộng 2012), lọc tia cực tím (Garcia cộng 2013b 2011), chất diệt sinh vật (Margot cộng sự.) thuốc trừ sâu halogen khác (Torres-Duarte cộng 2009) Do phổ chất rộng yêu cầu oxi làm hợp chất nền, laccase chất xúc tác sinh học đầy hứa hẹn với khả phân hủy hữu hợp chất micropollutants nước thải thứ cấp 3.1.2 Micropollutants (Chất ô nhiễm nồng độ thấp) Các chất Bisphenol A, Triclosan đại diện MPs sử dụng cho nghiên cứu loại chất ô nhiễm nồng độ thấp 3.1.2.1 Micropollutant gì? MPs hợp chất nhiễm tìm thấy với nồng độ từ vài pg/L tới vài µg/L mơi trường Nhiều MPs có mặt nước thải thành thị, từ dược phẩm hay chất diệt cỏ, khó để bị loại bỏ phương pháp xử lý sinh học truyền thống nên chúng liên tục thải vào mơi trường nước Những hợp chất có cấu trúc bền vững nên khó phân hủy nhiều tác nhân khác Chính mà chúng ảnh hưởng tới sinh vật nhạy cảm dù với nồng độ thấp (Yunlong cộng 2012) 3.1.2.2 Bisphenol A Bisphenol A (BPA) hợp chất carbon tổng hợp có cơng thức hóa học (CH3)2C(C6H4OH)2  thuộc nhóm dẫn xuất diphenyl-mê-tan bisphenols, với hai nhóm hydroxyphenyl Nó sử dụng thương mại từ năm 1957 (Gemma cộng sự., 2014) BPA chất phá hủy nội tiết (Krishnan cộng sự, 1993; Fujimoto cộng sự, 2006) biết gây độc cấp tính cho sinh vật với nồng độ 1-10lgL (Alexander cộng sự, 1988.) Hình 1.1 Cơng thức hóa học Bisphenol A BPA sử dụng làm nguyên liệu ban đầu cho sản xuất nhựa polycarbonate nhựa epoxy Nó xuất mơi trường nhà máy sản xuất BPA, kết hợp BPA thành nhựa (Staples cộng sự, 1998), lọc chất thải nhựa (Sajiki Yonekubo, 2003) bãi chôn lấp (Asakura cộng sự, 2004) thải Nồng độ BPA lên tới 21 µgl-1 bề mặt nước biển (Belfroid cộng sự, 2002) lên đến 702 ngl -1 nước thải Vi khuẩn có khả giảm BPA phân lập từ nhà máy xử lý nước tải (Lobos cộng sự, 1992) nước sông (Kang cộng sự, 2004) BPA chất phá hủy hệ nội tiết (Krishnan cộng sự, 1993; Fujimoto cộng 2006) biết có khả gây độc cho sinh vật nước nồng độ từ 1-10 g/L (Alexander cộng 1988) Đã có số nghiên cứu trước cho thấy BPA bị loại bỏ enzyme từ nấm (Kim Nicell, 2005; Cabana cộng 2012) 3.1.2.3 Triclosan Triclosan (2,4,4 '-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether) hợp chất đa vịng thơm có chứa clo Nhóm chức bao gồm phenol ete Triclosan lần đăng ký thuốc trừ sâu vào năm 1969 (Cabana cộng sự, 2006) Hình 1.2 Cơng thức hóa học Triclosan TCS tác nhân kháng khuẩn có phổ rộng Nó sử dụng nhiều loại PCP kem đánh răng, lăn khử mùi, xà phịng nước rửa tay TCS tìm thấy chủ yếu nước thải cặn từ nhà máy xử lý nước thải Nồng độ TCS nước thải từ nhà máy xử lý nước thải lên tới 37.8 µgl-1 (Hua cộng sự, 2005) mặt nước lên đến 431 ngl -1 (Morrall cộng sự, 2004) Do tính kị nước cao hóa chất (Log K ow = 4.8), tản mơi trường nước xảy hấp phụ hạt trầm tích thường tích lũy sinh vật nước (AdolfssonErici cộng sự, 2002) TCS ý có giống cấu trúc hóa học với BPA xenoestrogen chất gây nhiễm có độc tính cao dioxin Một số thơng tin cho thấy TCS có khả can thiệp suy giảm hệ nội tiết Các nghiên cứu medaka (Oryzias latipes) cho thấy TCS chất androgenic yếu (Foran cộng sự, 2000) sản phẩm chuyển hóa hoạt động thụ thể đối kháng estrogen (Ishibashi cộng sự, 2004) TCS loại bỏ tới 65% sau sử dụng enzyme laccase từ chủng nấm Coriolopsis polyzona (Cabana cộng sự, 2007) 3.1.3 Chất hóa học sử dụng để nghiên cứu Các chất hóa học sử dụng nghiên cứu bao gồm Bisphenol A, Triclosan, Violuric acid, ABTS, guaiacol, di-sodium hydrogen phosphate buffer, sodium acetate, citric acid, methanol, HCl, CuSO 4, NaOH v.v từ Sigma- Alrich, Merck, Fermentas 3.1.4 Thiết bị máy móc Nghiên cứu thực trang thiết bị phịng Cơng nghệ Sinh học Tái tạo mơi trường viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các thiết bị bao gồm: bình tam giác, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, tủ lạnh cách loại ºC, -20ºC; máy đo quang phổ Novaspec II, lị vi sóng, pipet man hãng Eppendorf, đầu cơn, v.v.Thiết bị phân tích LC-MS/MS HPLC-DAD Trung Tâm I, Bộ KHCN 3.2 Phương pháp 3.2.1 Phương pháp phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme ngoại bào Các chủng vi sinh vật phân lập theo phương pháp pha loãng– gạt đĩa thạch theo nồng độ pha loãng hay đặt trực tiếp mẫu gỗ mục rơm mục (kích thước 2-3 mm) có sợi nấm lên đĩa thạch chứa mơi trường có chất thị Phương pháp thường nhanh sợi nấm xuất sau 16-20 Chất thị sử dụng để nhận biết khả sinh tổng hợp laccase chủng nấm guaiacol (0,01%) Trên môi trường thạch, chủng oxy hóa guaiacol tạo màu nâu đỏ chủng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có laccase Cuối cùng, FBV41, FBV25 FPT5 ni cấy mơi trường thích hợp để tạo laccase thơ 3.2.2.Xác định hoạt tính laccase Phương pháp xác định laccase Eggert cộng (1996) công bố xem phương pháp thường qui sử dụng cho nghiên cứu Nguyên tắc: Hoạt độ laccase xác định tăng độ hấp thụ ánh sáng sản phẩm tạo thành bước sóng 420 nm điều kiện phịng thí nghiệm Hỗn hợp phản ứng đo hoạt tính laccase gồm 0,2 ml ABTS 2,5 mM; 0,6 ml đệm natri axetat 20 mM 0,2 ml dịch enzyme laccase thô ly tâm Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase lượng enzyme cần thiết để tạo thành µM sản phẩm từ chất ABTS (2,2-azino-bis 3ethylbenzothiazoline-6sulfonic acid) thời gian phút, điều kiện phịng thí nghiệm 3.2.3 Thí nghiệm loại bỏ MPs Hỗn hợp phản ứng gồm mg/L chất BPA TCS, enzyme laccase thô FBV41, FBV25 FPT5, đệm citrate disodium hydrogen phosphate pH 1% v/v methanol Hoạt tính laccase phản ứng 1000 U/L Ngồi ra, 50µM Violuric acid bổ sung với vai trò chất gắn kết phản ứng loại bỏ MPs Các mẫu thí nghiệm ủ 40oC Dừng phản ứng cách đun sôi dung dịch 15 phút Dung dịch sau đun phân tích HPLC-DAD (Bisphenol A) LC-MS/MS (Triclosan) 3.2.4 Đánh giá hiệu suất loại bỏ MPs Như đề cập Triclosan phân tích phương pháp LCMS/MS theo giao thức chuẩn (QHFSS Document No 27701:PPCP nước; chuẩn bị phân tích SPE LCMSMS) Bisphenol A phân tích HPLC-DAD 3.3.Kết 3.3.1 Hiệu suất loại bỏ MPs Sau phản ứng, dung dịch phân tích thiết bị chuyên dụng chủ yếu nêu Hệ số thu hồi phản ứng tốt nằm khoảng 100 % 5.044 mg/L BPA 4.995 mg/L TCS (Bảng 3.1) Hiệu suất loại bỏ Bisphenol A Triclosan laccase thô từ chủng FPT5, FBV25, FBV41 từ 85.66 – 100% sau phản ứng (Bảng 3.1) Trong laccase từ chủng FBV41 loại MPs tốt Bisphenol A Triclosan 100 99,8% Kết lý thú thu khơng cần có chất gắn kết có laccase đơn lẻ chủng hiệu suất loại loại MPs nghiên cứu cao từ 85,66 - 97,7% (Bảng 3.1) Bảng 3.1: Hiệu suất loại bỏ bỏ Bisphenol A Triclosan Mẫu MPs BPA TCS Đối chứng Nồng độ (mg/ L) 5,04 4,99 Chủng FPT5 Laccase Laccase +VIO Nồng Hiệu Nồng Hiệu độ suất độ suất (mg/ loại (mg/ loại L) (%) L) (%) 0,43 91,46 0,26 94,8 0,72 85,66 0,24 95,3 Chủng FBV25 Laccase Nồng độ (mg/ L) 0,21 0,38 Hiệu suất loại (%) 95,9 92,5 Chủng FBV41 Laccase+VIO Nồng độ (mg/ L) 0,25 0,19 Hiệu suất loại (%) 95,08 96,30 Laccase Nồng độ (mg/ L) 0,611 0,12 Hiệu suất loại (%) 87,8 97,7 Laccase+VIO Nồng độ (mg/L) 0,000 0,013 Hiệu suất loại (%) 100 99,8 3.3.2 Ảnh hưởng chất gắn kết (CGK) tới hiệu suất loại bỏ MPs Việc sử dụng chất oxy hóa có trọng lượng phân tử thấp nhóm chất xúc tác laccase nâng cao hoạt tính enzyme Q trình oxy hóa trung gian gồm hai bước oxy hóa Trong bước đầu, laccase oxy hóa chất nền, chất gắn kết Chất hoạt động hợp chất vận chuyển electron Sau đó, chất gắn kết chuyển electron cho chất cần phản ứng Những chất gắn kết tăng khả phản ứng laccase (Bourbonnais Paice, 1990) Trong nghiên cứu Violuric acid (ViO) sử dụng làm chất gắn kết để tìm hiểu vai trị phản ứng xúc tác laccase khả thay đổi cấu trúc MPs nêu Đối với chủng FBV25, FPT5, chất gắn kết vai trị để tăng hiệu xử lý Nhìn sắc ký đồ, peak BPA TCS giảm rõ rệt so với mẫu đối chứng (hình 3.1,3.2,3.3,3.4), BPA gần bị loại bỏ hồn tồn Cịn TCS, bị loại bỏ phân hủy thành hợp chất khác Đối với mẫu sử dụng laccase từ chủng FBV41, chất gắn kết đóng vai trị rõ rệt tăng hiệu suất loại bỏ từ 87.8% (khi không dùng CGK) lên 100 % sử dụng CGK Peak BPA khơng cịn nhìn thấy sắc ký đồ (Hình 3.5) Khi có mặt ViO xuất peak mới, đốn chất gắn kết “giúp” laccase hoạt động theo chiều hướng khác để tạo nên chất háo học Tuy nhiên phải có thêm nghiên cứu để xác định chất tạo có chất háo học gì? 100 100 200 200 175 175 75 50 50 50 25 240 220 200 200 180 180 160 160 140 Peak BPA 100 140 120 75 120 100 80 60 50 40 25 25 100 Peak BPA 80 60 40 20 0 Minutes A 10 11 12 13 14 15 20 Minutes B 10 11 Minutes C Hình 3.1: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA laccase từ FPT5 (A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO) 10 11 mAU 125 100 75 DAD-CH1 217 nm 14-11-BPA-PT5EM-ch.dat Retention Time Area Name ESTD concentration 150 125 75 25 220 150 150 125 225 mAU 125 Peak BPA mAU 150 175 mAU 175 240 Retention Time Area Name ESTD concentration mAU 200 4.867 5269240 Bis phenol A 5.044 200 mAU DAD-CH1 217 nm 14-11-BPA-PT5E-ch.dat 225 225 4.627 866712 0.000 4.800 271375 Bis phenol A 0.260 250 DAD-CH1 217 nm 14-11-BPA-C-Ch.dat Retention Time Area Name ESTD concentration 225 4.893 446556 Bis phenol A 0.427 250 Peak TCS Peak BPA Peak TCS Peak TCS Peak BPA A B Peak BPA C Hình 3.2: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS laccase từ FPT5 (A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO) A B C Hình 3.3: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA laccase từ FBV25 (A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO) Peak TCS Peak TCS A Peak TCS B C Hình 3.4: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS laccase từ FBV25 (A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO) Peak BPA Peak BPA A B Peak BPA C Hình 3.5: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ BPA laccase từ FBV41 (A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO) Peak TCS Peak TCS Peak TCS A B C Hình 3.6: Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng loại bỏ TCS laccase từ FBV41 (A: Đối chứng; B: Laccase; C: Laccase + VIO) 3.3.3 Thảo luận Để nghiên cứu khả loại bỏ MPs laccase từ chủng nấm FPT5, FBV25 FBV41, đề tài thiết kế thực thí nghiệm tìm hiểu phản ứng xúc tác loại laccase từ chủng nấm đảm nêu với Bisphenol A Triclosan đại diện MPs dự đặc tính enzyme tham khảo công bố quốc tế Các minh chứng thu khẳng định với laccase có nguồn gốc khác loại bỏ Bisphenol A Triclosan với hiệu suất cao có mặt khơng có mặt chất gắn kết (tử 85,66-100%) Hơn enzyme laccase từ chủng phân lập Việt Nam có kiểu xúc tác khác để không loại bỏ MPs mà cịn tạo chất trao đổi chất có chất khơng giống Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cần tiếp tục ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian phản ứng, hoạt tính laccase đến hiệu suất loại màu Hơn nữa, kết hợp lúc cảu hay nhiều laccase cần phải khảo sát Việc cố định enzyme lên vật liệu nano định hướng quan trọng để áp dụng thực tế qui mơ cơng nghiệp Trước mắt sử dụng chủng sinh laccase, hay laccase thô để loại màu thuốc nhuộn hay MPs mang tính khae thi cao Bên cạnh đó, sắc ký đồ có cho thấy sản phẩm trao đổi chất khác điều kiện có khơng có chất gắn kết nguồn laccase khác chất hóa học chưa xác định Theo Hirano đồng tác giả (2000), sau Bisphenol A loại bỏ laccase, chất tạo thành sau phản ứng xác định 4-isopropylphenol hexestrol Các chất nêu không cịn độc tính BPA So với cơng bố liệt kê Bảng 3.2 tiềm loại laccase từ chủng FBV41, FPT5 FBV25 cao loại bỏ MPs Bảng 3.2: So sánh hiệu suất loại bỏ Bisphenol A Triclosan laccase với công bố quốc tế tương tự MPs BPA TCS Hiệu loại bỏ (%) Điều kiện thí nghiệm Nồng độ MPs (mM) 88,3 97 0,75 100 100 0,022 80 ~96 Chủng Paraconiothyrium variabile Hoạt tính enzyme (U/L U/g) Nhiệt độ (0C) pH Thời gian (h) Nồng độ CGK (mM) 5000 50 ABTS 0,5 Grifola frondosa 1,5 28 HBT Chaetomiaceae 50 40 - - 24 5 40 ABTS 0,001 Coriolus versicolor 10 - - 2,33 0,12 Trametes versicolor 150 25 ABTS 1 18 0,670,87 Trametes versicolor 888 7,3 40 - - 2,53 100 0,01 Trametes polyzona 640 28 HBT 50 0,22 Trametes versicolor 100   30 HBT 0,2 0,5 77 0,2 250-600 4,5 30 - - 72 100 0,022 FBV41 1000 40 Vio 0,05 65 0,018 Coriolopsis polyzona 5 50 ABTS 0,001 56,5 0,2 30 - - 24 90 0,2 30 HBT 24 100 0,05 Trametes versicolor 250 40 - - 60 0,05 Cerrena unicolor 43 U/g (cố định) - - 99,75 0,023 1000 0,05 Coriolopsis polyzona Hetero Basidium Ganoderma lucidum Ganoderma lucidum FBV41   40 Vio Tác giả Asadgol cộng sự, 2014 Nitherano nt cộng sự, 2011 Saito cộng sự., 2004 Cabana cộng sự, 2007 Okazaki cộng sự, 2002 Kim Nicell , 2005 Margot cộng sự, 2013 Chairin cộng sự, 2012 Tsutsumi cộng sự, 2000 Lee cộng sự, 2005 Nghiên cứu Cabana cộng sự, 2007 Murugesa n cộng sự, 2009 Cabana cộng sự, 2011 Debaste cộng sự, 2013 Nghiên cứu KẾT LUẬN  Với hoạt tính 1000 U/L, điều kiện phản ứng pH 40oC, laccase thô thu từ chủng nấm FPT5, FBV25 FBV41 loại chất ô nhiễm nồng độ thấp Bisphenol A Triclosan nồng độ 5mg/L với hiệu cao từ 85,66 -100% có mặt khơng có mặt chất gắn kết ViO  Tạo chất trao đổi chất khác sử dụng laccase có nguồn gốc từ chủng nấm đảm chất gắn kết khác  Hiệu suất loại bỏ Bisphenol A Triclosan FPT5 91,46 % BPA, 94,8 % có mặt chất gắn kết 85,66 % TCS, 95.27 % khi có chất gắn kết  FBV25 loại 95,9 % BPA, 95,08 % có mặt chất gắn kết; loại 92,45% TCS 96,3% có mặt chất gắn kết  FBV 41 loại 87,78 % BPA 100 % có mặt chất gắn kết; 97,69 % TCS 97,7% có bổ sung chất gắn kết  Cơng trình mở triển vọng mang tính ứng dụng công nghiệp để xử lý loại bỏ chất Micropollutant nước thải, sinh hoạt chất đa vòng thơm khác V LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Phó Giáo sư, Tiến sĩ Đặng Thị Cẩm Hà Thạc sỹ Ngô Thị Huyền Trang thành viên khác phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Tái tạo môi trường, người cho em hướng dẫn tận tình suốt quãng thời gian em tham gia nghiên cứu (từ năm 2012) Đồng thời, em xin cảm ơn tới trường THPT Việt Đức ban tổ chức thi khoa học kỹ thuật INTEL-ISEF cho em hội thực đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO Bolong N, Ismail AF, Salim MR, Matsuura T.Areview of the effects of emerging contaminants in wastewater and options for their removal Desalination 2009;239:22946 H Cabana, J P Jones, S N Agathos, 2007:Elimination of Endocrine Disrupting Chemicals using White Rot Fungi and their Lignin Modifying Enzymes: A Review Hubert Cabana, Jean-Louis Habib Jiwan, Raoul Rozenberg, Vladimir Elisashvili, Michel Penninckxe, Spiros N Agathos, J Peter Jones, 2006: Elimination of endocrine disrupting chemicals nonylphenol and bisphenol A and personal care product ingredient triclosan using enzyme preparation from the white rotfungus Coriolopsis polyzona Deblonde T, Cossu-Leguille C, Hartemann P Emerging pollutants in wastewater: A review of the literature Int J Hyg Envir Heal 2011;214:4428 Hirano T, Honda Y, Watanabe T, Kuwahara M Degradation of bisphenol A by the lignin-degrading enzyme, manganese peroxidase, produced by the white-rot basidiomycete, Pleurotus ostreatus Biosci Biotechnol Biochem 2000;64(9):1958–62 Kim, Y.J., Nicell, J.A., 2006 Impact of reaction conditions on the laccasecatalyzed conversion of bisphenol A Bioresour Technol 97, 1431– 1442 Margot J, Maillard J, Rossi L, Barry DA, Holliger C (2013b) Influence of treatment conditions on the oxidation of micropollutants by Trametes versicolor laccase N Biotechnol 30(6):803-813  Yunlong L., Wenshan G., Huu H.N., Long D.N., Faisal I.H., 2012 A review on the occurrence of micropollutants in the aquatic environment and their fate and removal during wastewater treatment ... cộng sự, 2004) TCS loại bỏ tới 65% sau sử dụng enzyme laccase từ chủng nấm Coriolopsis polyzona (Cabana cộng sự, 2007) 3.1.3 Chất hóa học sử dụng để nghiên cứu Các chất hóa học sử dụng nghiên cứu... 3.1.1 Laccase Các chủng nấm FBV25 phân lập từ gỗ mục từ rừng quốc gia Ba Vì FPT5 từ tỉnh Phú Thọ Riêng chủng FBV41 nhóm nghiên cứu chúng tơi phân lập từ đất rừng Ba Vì năm 2012 sử dụng để loại. .. thuật sử dụng enzyme laccase từ nấm đảm chủ động phân lập từ Việt Nam với nguồn đa dạng cao, hoạt tính laccase cao sản xuất dễ dàng để xử lý ô nhiễm môi trường MPs vốn chưa có giải pháp loại bỏ