Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thông báo kết quả nghiên cứu phân lập, phân loại chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để sinh[r]
(1)NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP LACCASE CÓ KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG
ĐỂ NHUỘM VẢI MAY QUÂN TRANG
Phùng Khắc Huy Chú1,3*, Đào Thị Ngọc Ánh2, Đặng Thị Cẩm Hà2
Tóm tắt: Từ số 45 mẫu nấm đảm thu thập, phân lập từ rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội, lựa chọn chủng FBV40 có khả sinh tổng hợp laccase thô cao Dựa theo đặc điểm hình thái trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng FBV40 xác định thuộc chi Rigidoporus đặt tên Rigidoporus sp FBV40 Hoạt tính laccase thô cao chủng đạt 107.708 U/l môi trường TSH1 sau ngày nuôi cấy có khả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vải may quân trang mức độ khác nhau, hiệu suất loại màu MN.FBN với nồng độ 100 mg/L đạt cao 88,11% có mặt 200 µM ViO sau 24 h Ở nồng độ màu MN.FBN 10 mg/L hiệu suất loại màu đạt 92,72% Từ minh chứng thu cho thấy laccase sinh tổng hợp chủng nấm đảm FVB40 có khả ứng dụng xử lý nước thải nhà máy dệt nhuộm vải may quân trang cho quân đội.
Từ khóa: Laccase, Rigidoporus, Loại màu, Thuốc nhuộm hoạt tính, Vải quân trang
1 MỞ ĐẦU
Laccase enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase số enzyme nghiên cứu từ kỷ thứ 19 Sự quan tâm loại laccase gia tăng năm gần tiềm ứng dụng chúng việc khử độc chất ô nhiễm xử lý sinh học hợp chất phenol [7, 4] Chúng cần oxy nguyên tử phản ứng xúc tác, chúng phù hợp ứng dụng công nghệ sinh học xử lý hỗn hợp chất ô nhiễm cố định chất mang phù hợp [13] Vai trò laccase xác định ứng dụng loại màu thuốc nhuộm, phân hủy sinh học hóa chất thải có độc tính hợp chất hữu clo, hydrocarbon thơm mạch vòng, chất vịng thơm có nitro thuốc chất trừ sâu chế tạo sensor sinh học [11, 6]
Hiện nay, công nghiệp dệt nhuộm sử dụng khoảng 2/3 tổng lượng thuốc nhuộm tiêu thụ lượng lớn nước hoá chất [5] Các hoá chất sử dụng đa dạng thành phần hoá học, chủng loại từ hợp chất vô để tổng hợp đến sản phẩm hữu Có khoảng 100.000 loại thuốc nhuộm thương mại với 7.105 thuốc nhuộm sản xuất hàng năm Các vấn đề nảy sinh ô nhiễm thuốc nhuộm khả sinh chất gây ung thư benzidine hợp chất vòng thơm khác [4] Hầu hết phương pháp để xử lý nước thải dệt nhuộm không đạt hiệu không kinh tế mong muốn Do đó, việc nghiên cứu phát triển phương pháp dựa laccase chuyên hoạt động chất xúc tác giải pháp có tiềm cao loại màu thuốc nhuộm có cấu trúc hố học đa dạng [15] Hiện tại, chưa có cơng bố việc nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm cơng nghiệp quốc phịng sử dụng laccase hay hỗn hợp nhiều laccase để xử lý loại hình nhiễm
(2)với phổ chất đặc biệt nghiên cứu nâng cao tính ổn định quan trọng để triển khai ứng dụng quy mô công nghiệp
Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thơng báo kết nghiên cứu phân lập, phân loại chủng nấm đảm có khả sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để sinh tổng hợp laccase cao so sánh khả loại số màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng công đoạn nhuộm vải may quân trang nhà máy X20/Bộ Quốc phòng
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
Các chủng nấm đảm thu thập từ đất gỗ mục độ cao 600m rừng Quốc gia Ba vì, thành phố Hà Nội
2.2 Hóa chất môi trường nuôi cấy
Tám loại màu tổng hợp hoạt tính cung cấp nhà máy X20, Tổng Cục cơng nghiệp Quốc phịng, Bộ Quốc phịng Sử dụng môi trường nuôi cấy TSH1 (100 ml dịch chiết khoai tây, 10 g/L glucose, g/L cám gạo, g/L bột đậu tương, 100 µM Cu2+); PDB (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose); PDB + 1%BDT (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose, 10g/l bột đậu tương); Czapeck (Saccharose 30 g/l, MgSO4 0,5 g/l, KH2PO4 g/l, NaCl g/l, NaNO3 g/l, KCl 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, pH 7); Dịch chiết khoai tây (Khoai tây 200g/l, pH 7); MEG (KH2PO4 g/l, Na2HPO4 g/l, NaCl 0,2 g/l, MgSO4 0,2 g/l, CaCO3 0,5 g/l, cao men g/l, cao malt g/l, glucose g/l, pH 6,5) Vis (pepton g/l, glucose 10 g/l, KH2PO4 0,6 g/l, ZnSO4 0,001 g/l, K2HPO4 0,4 g/l, FeSO4 0,0005 g/l, MnSO4 0,05 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6)
2.3 Phân lập chủng nấm
Các mẫu nấm đất có gỗ mục thu thập tươi từ rừng Quốc gia Ba Vì, mang phịng thí nghiệm chụp ảnh Sau đó, tiến hành đo hoạt tính laccase mẫu tươi (gọi hoạt tính in-situ) Tiến hành phân lập, làm môi trường thạch chứa dịch chiết khoai tây, agar 18g/l bổ sung guaniacol % để song song nhận biết khả sinh tổng hợp oxydoreductase (laccase, LiP MnP) thông qua vịng màu nâu đỏ sản phẩm oxy hóa guaniacol
2.4 Phương pháp xác định hoạt tính laccase
Để phân biệt xác laccase, LiP hay MnP sinh tổng hợp chủng nấm nghiên cứu, hoạt tính laccase xác định dựa oxy hóa ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) laccase theo phương pháp Eggert [1] 2.5 Phân loại chủng nấm
DNA tổng số nấm tách chiết theo mô tả Eric Boehm Sản phẩm PCR nhân lên từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) [18] Trình tự đoạn gene xử lý phần mềm FinchTV so sánh với chủng công bố GenBank (NCBI database) Cây phát sinh chủng loại xây dựng phần mềm MEGA 6.06
2.6 Sàng lọc khả loại màu hoạt tính laccase thơ
(3)trong 10 phút đệm natri acetate 20 mM pH4 Hiệu loại màu thuốc nhuộm đánh giá vịng 24 tính cơng thức:
D = 100*(Ai - At)/Ai Trong đó: D: Phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%);
Ai: Độ hấp thụ ban đầu; At: Độ hấp thụ thời gian t
2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CGK ViO lên khả loại màu thuốc nhuộm MN.FBN
Tổng thể tích phản ứng loại màu MN.FBN ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) nồng độ CGK ViO với nồng độ 0; 100; 200; 400; 600; 800 1000 µM Mẫu đối chứng có chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt 100oC 10 phút đệm natri acetate 20 mM pH4 Hiệu suất loại màu tính tốn khoảng thời gian khác vịng 24 Các thí nghiệm lặp lại lần
2.8 Nghiên cứu khả loại màu nồng độ khác laccase thô chủng FBV 40
Tổng thể tích loại màu MN.FBN 5ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc nhuộm nồng độ màu 5; 10; 15; 20; 30; 40 50 mg/L, dịch laccase thô nồng độ cuối 1000 U/L nồng độ CGK 600 µM Mẫu đối chứng có chứa màu nồng độ khác nhau, enzyme bị biến tính nhiệt 100oC 10 phút đệm natri acetate 20 mM pH4 Hiệu suất loại màu tính tốn khoảng thời gian khác vịng 24 Các thí nghiệm lặp lại lần
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các chủng nấm phân lập
Từ 45 mẫu nấm đất có gỗ mục thu thập khu vực lấy mẫu, sau xử lý bề mặt lắc gạt môi trường PDA bổ sung chất thị guaiacol 0,01% Sau ngày ni cấy, chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng bề mặt môi trường, hệ sợi nấm bơng xốp có màu trắng, khơng mịn tạo vịng nâu đỏ mơi trường có chứa chất thị guaiacol Hoạt tính laccase insitu trường tiến hành Kết thu chứng tỏ chủng có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (MnP, LiP) oxidoreductase (laccase) Các kết thể bảng
Bảng 1. Các chủng nấm có khả sinh tổng hợp laccase
Tên mẫu Mặt trước (B) Mặt sau (C) Hoạt tính in situ
(U/L)
A46 35
(4)BT5 50
BT8 23
BT9 25
FBV40 150
Chú thích: Hình thái khuẩn lạc (mặt trước - B mặt sau - C) hoạt tính laccase in situ (là hoạt tính mẫu trước phân lập) chủng nấm nuôi cấy môi trường PDA bổ sung 0,01% guaiacol làm chất thị
Dựa vào kết đo hoạt tính enzyme laccase bảng 1, cho thấy chủng FBV40 có hoạt tính cao nhất, khả phát triển nhanh nên lựa chọn để nghiên cứu phân loại, khả sinh tổng hợp laccase khả loại màu thuốc nhuộm Chủng nấm phân loại kết hợp hai phương pháp truyền thống so sánh độ tương đồng trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng với chủng đại diện GenBank
Hình 1. Hình thái sợi bào tử chủng FBV40 kính hiển vị điện tử quét JOLE với độ phân giải x 1.500
(5)cặp mồi ITS1-ITS4 chủng nấm FBV40 Sử dụng phần mềm mô tả phần phương pháp, phát sinh chủng loại xây dựng hình Từ phát sinh chủng lồi cho thấy chủng FBV40 gần gũi với đại diện thuộc chi Basidiomycetes với mức độ tương đồng 96 đến 99% tương ứng với chủng B sp HKC4 thu thập từ vùng biển Hawai (Mỹ) [10] chủng B sp C2-14 thu thập từ rặng san hồ Phúc Kiến (Trung Quốc) 93 đến 99% với chi đại diện Rigidoporus lần lượt là R Vinctus C1-9được phân lập từ vùng biển san hô vùng biển Phúc Kiến và R Vinctus FRIM 142 phân lập từ rừng nhiệt đới Malaysia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Hiện chưa có nhiều nghiên cứu đặc điểm hình thái khả sinh tổng hợp laccase chủng nấm Từ phát sinh chủng loại, đặc điểm hình thái, chủng nấm FBV40 thuộc chi Rigidoporus đặt tên Rigidoporus sp FBV40
Hình 2. Cây phát sinh chủng loại chủng FBV40
(6)Môi trường phù hợp để sinh tổng hợp laccase
Bảy môi trường nuôi cấy lựa chọn để khảo sát khả sinh tổng hợp laccase thô chủng FBV40, kết mơ tả hình
Từ kết hình 3, mơi trường TSH1 chủng FBV40 có khả sinh tổng hợp laccase thô cao lên tới 107.708 U/L sau ngày nuôi cấy Tiếp đến mơi trường PDB có bổ sung 1% bột đậu tương đạt 41.343 U/L sau ngày nuôi cấy môi trường Czapeck, Vis MEG với hoạt tính thu 5; 13; 12 68,7 U/L môi trường để ni cấy nấm hoạt tính laccase thô thu lại thấp Theo nghiên cứu Cambria cs chủng nấm R lignosus có hoạt tính 120.000 U/L 75.000 U/L bổ sung chất cảm ứng phenylhydrazine, guaniancol môi trường ni cấy có bổ sung 25mM Nito 500 µg/L CuSO4 môi trường sau 21-24 ngày nuôi cấy [8] Ở Việt Nam, nghiên cứu khả sinh tổng hợp laccase chủng nấm Trichoderma sp FCP3 phân lập từ gỗ mục rừng Quốc gia Cúc Phương hoạt tính đạt cao bổ sung NaNO3 KNO3 (tỷ lệ 3:7) với nồng độ g/l vào mơi trường có hoạt tính 132 U/l Như vậy, thấy thành phần mơi trường ni cấy có ảnh hưởng lớn tới khả sinh tổng hợp laccase chủng FBV40 Môi trường TSH1 môi trường phù hợp số môi trường khảo sát để FBV40 có khả sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao
Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase thơ
Với mục đích sử dụng enzyme thơ để phục vụ khảo sát khả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính để nhuộm vài may quân trang, chủng nấm FBV40 ni lắc mơi trường TSH1 hoạt tính laccase cao thu sau ngày nuôi cấy 107.708U/L Kết chứng minh laccase thô từ chủng FBV40 có khả loại màu hoạt tính mức độ khác nhau, sử dụng phương pháp đánh giá khả loại màu thiết bị UV-VIS Kết loại màu trình bày bảng
Bảng 2. Khả loại màu số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng trong quân đội laccase thô chủng FBV40
C T MT BES
T C
NY S3R
C T
MY BES
C
(7)Chú thích: C- Đường biểu diễn màu đối chứng; T- Đường biểu diễn màu thí nghiệm Đối với màu thuốc nhuộm hoạt tính khơng sử dụng CGK, laccase chủng nấm FBV40 có khả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng nghiên cứu Hiệu suất loại màu laccase thô chủng FBV40 khơng có CGK dao động khoảng từ đến 5,56% sau 24 thí nghiệm, cao đạt 5,56% màu MR.EBR
Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase thơ sử dụng CGK ViO sau 24 cao Với hiệu suất loại màu hoạt tính thương mại nằm khoảng rộng từ 4,22% đến 88,11%, đó, hiệu suất loại màu thấp màu MY-BES đạt 4,22% cao màu MN FBN lên tới 88,11% sau 24h phản ứng Kết thu cho thấy vai trò CGK phản ứng loại màu laccase chủng FBV40 màu thuốc nhuộm hoạt tính từ nhà máy X20, đó, đặc biệt khả loại màu MN.FBN với hiệu suất tăng từ 0,22% đến 88,11% màu NN.SG từ 0,11% đến 77,05% Đặc biệt, hiệu suất loại màu khơng có biến động lớn sau 24 có mặt CGK Từ kết cho thấy vai trò CGK quan trọng việc loại màu thuốc nhuộm laccase thô chủng FBV40 Số liệu thực nghiệm cho thấy, enzyme thơ chủng FBV40 có hiệu cao việc loại màu thuốc nhuộm thuộc nhóm màu có gốc azo có màu xanh xanh đen (đây màu sử dụng để nhuộm vải may quân trang cho quân đội nay), cịn màu mang nhóm màu có gốc azo đơn có màu vàng, đỏ xanh da trời, laccase thô từ chủng FBV40 loại màu nhiều Theo nghiên cứu sử dụng 09 chủng tập đoàn HN1 loại màu 83,89% màu 100 mg/L Reactive Blue 222 (MN.FBN) sau 15 h nuôi lắc [2] Khi loại màu RB 222 phản ứng phenton loại màu gần 90% tăng lên đạt 96,88% đạt 95,23% sau xử lý hiếu khí chủng nấm đảm trắng P.ostreatus IBL-02 P chrysosporium IBL-03 [14] Chủng Pseudomonas sp D4 phân lập từ nước thải nhà máy nhuộm có khả loại màu cao màu 100 mg/l RB 222 sau 24 h đạt 70% pH nhiệt độ nuôi cấy 350C [18] Hiện chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu nước quốc tế sử dụng laccase thô để loại màu RB 222 Khi nghiên cứu khả loại màu laccase tinh với hoạt tính 20 U/L rLac15 thu từ chủng vi khuẩn nước biển có
T
C MR EBR
C
T
MN FBN
NY FN2R C
T
T