Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme laccase và đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chúng

Tạp chí Khoa học Công nghệ 50 (3) (2012) 285-295 SINH ENZIM NGOẠI BÀO PEROXIDAZA, LACCAZA VÀ PHÂN HỦY CÁC HỢP CHẤT VÒNG THƠM CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN XKBH1 Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà* Viện Công nghệ sinh học, Viện KHCNVN, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội * Email: dangcha80@gmail.com, dangcha80@yahnoo.com Đến Toà soạn: 15/9/2011; Chấp nhận đăng: 17/11/2012 TÓM TẮT Bốn chủng xạ khuẩn gồm XKBH1, XKBH2, XKBH3 XKBH5 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ sân bay Biên Hòa Các chủng sinh laccaza với hoạt tính ban đầu thấp Dựa phân tích trình tự gen 16S rARN, chủng XKBH1 phân loại thuộc chi Streptomyces đặt tên Streptomyces sp XKBH1 Trình tự gen 16S rARN (khoảng 1489 bp) đăng ký GeneBank với mã số GQ 204110 Chủng XKBH1 sinh trưởng môi trường KG SH1 có chứa dioxin, 2,4,5-T, pyren Anthracen Sau ngày nuôi lắc, chủng phân hủy 72 % pyren, 48,3 % anthracen môi trường KG 63,3 % pyren, 55,8 % anthracen môi trường SH1 với nồng độ ban đầu chất 100 ppm Chủng sinh tổng hợp laccaza môi trường KG SH1 có chứa dioxin, 2,4,5-T, pyren anthracen Khả sinh laccaza chủng XKBH1 môi trường KG cao môi trường SH1 với hoạt tính laccaza 2,7 U/l Chủng sinh tổng hợp laccaza, lignin peroxidaza (LiP) mangan peroxidaza (MnP) môi trường SH1 chứa dioxin 2,4,5-T chất cảm ứng Hoạt tính MnP cao đạt 15,7 U/l môi trường SH1 chứa 2,4,5-T Hoạt tính laccaza xác định pH tăng gấp 74 lần so với pH Đa số chất cảm ứng làm tăng hoạt tính laccaza chủng XKBH1 hoạt tính laccaza cao (1073 U/l) môi trường KG chứa veratryl alcohol nồng độ ban đầu 0,5 mM Từ khóa: Streptomyces, laccaza, peroxidaza, 16S rARN, chất cảm ứng ĐẶT VẤN ĐỀ Ba enzim quan trọng hệ enzim phân hủy lignin gồm có lignin peroxidaza – LiP (EC 1.11.1.14), mangan peroxidaza -MnP (EC 1.11.1.13) laccaza (EC 1.10.3.2) nghiên cứu chứng minh đóng vai trò quan trọng trình phân hủy sinh học [1, 2] Cả ba enzim có khả phân hủy, khoáng hóa nhiều hợp chất mạch vòng phenol, polyphenol, hydrocarbon thơm đa nhân (PAHs), chất diệt cỏ, chất màu công nghiệp, thuốc nhuộm v.v với mức độ khác [1] Ở Việt Nam, trình xử lí tẩy độc đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin điểm nóng Đà Nẵng, kĩ thuật sàng lọc hành Đặng Thị Cẩm 285 Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà Hà Cộng phát có mặt nấm sợi, xạ khuẩn vi khuẩn sinh laccaza, LiP MnP Các chủng nấm sợi chủ yếu thuộc chi Aspergillus, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces vi khuẩn thuộc chi Brevibacillus [3, 4] Tại sân bay Biên Hòa, nơi có độ ô nhiễm 2,3,7,8tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD); 2,4,5-trichlorophenoxyacetic (2,4,5-T); 2,4dichlorophenoxyacetic (2,4-D) mức độ tương đối cao phạm vi rộng [3] Ngoài lượng lớn trichlorophenol (TCP), dichlorophenol (DCP), hợp chất hữu đa vòng thơm (PAH) phát Chính vậy, để chuẩn bị công nghệ tốt cho quy mô xử lí 3384 m3 đất nhiễm chất độc hóa học điểm nóng khảo sát tìm kiếm vi sinh vật có khả sinh enzim LiP, MnP laccaza Xạ khuẩn chiếm số lượng lớn với độ đa dạng cao đất điểm nóng Vậy, xạ khuẩn đóng vai trò trình phân hủy sinh học, chúng có khả sinh enzim ngoại bào không? Để trả lời cho câu hỏi này, nghiên cứu khả sinh trưởng, phân hủy số hợp chất ô nhiễm khả sinh laccaza, MnP LiP bốn chủng xạ khuẩn phân lập Đồng thời khảo sát pH chất cảm ứng ảnh hưởng đến hoạt tính khả sinh tổng hợp laccaza chủng xạ khuẩn XKBH1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin thu thập từ vị trí khác sân bay Biên Hoà Đất lấy giữ bình vô trùng Đây nguồn nguyên liệu để phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật sinh laccaza, LiP MnP 2.1 Môi trường nuôi cấy Các môi trường Gause nghèo (KG), SH1 [5] sử dụng để nghiên cứu khả sinh trưởng, sinh enzim phân hủy hợp chất hữu đa vòng thơm chủng xạ khuẩn 2.2 Nghiên cứu khả sử dụng chất đa vòng thơm Các môi trường SH1 (đánh giá khả phân hủy chất ô nhiễm theo chế đồng trao đổi chất) môi trường KG (đánh giá khả sử dụng chất ô nhiễm làm nguồn carbon lượng nhất) sử dụng để đánh giá khả phân hủy dịch chiết đất chứa dioxin (DCD), dibenzofuran, 2,4,5-T, anthracen pyren chủng xạ khuẩn XKBH1 Khả sử dụng hợp chất đa vòng thơm đánh giá thông qua thay đổi màu môi trường nuôi cấy, sinh khối biến tinh thể hợp chất vòng thơm Sau ngày nuôi lắc 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, hàm lượng PAH môi trường dịch thể xác định theo phương pháp đo quang phân tử [6] 2.3 Xác định hoạt tính enzim ngoại bào Chủng xạ khuẩn nuôi lắc ngày môi trường KG chứa dịch chiết đất (trên 90 % hàm lượng 2,3,7,8-TCDD chất ô nhiễm khác), 2,4,5-T, anthracen pyren để xác định khả sinh enzim ngoại bào Hoạt tính laccaza xác định theo phương pháp Han đồng tác giả [7] sử dụng ABTS làm chất Xác định hoạt tính enzim lignin peroxidaza dựa oxy hóa 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) enzim tạo thành sản phẩm có độ hấp thụ mạnh bước sóng 510 nm [8] Xác định hoạt tính mangan peroxidaza (MnP) dựa oxi hóa phenol đỏ enzim MnP tạo thành hợp chất hấp thụ mạnh bước sóng 610 nm [9] 286 Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza phân hủy hợp chất vòng thơm … 2.4 Xác định trình tự đoạn gen 16S rARN Tách chiết ADN tổng số, nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN chủng xạ khuẩn sử dụng cặp mồi 27F 14927R, gắn sản phẩm PCR vào vector pT257R/T biến nạp vào tế bào khả biến E coli TOP10 Trình tự đoạn gen 16S rARN xác định máy ABI PRISM 3100 Avant Data Analyzer, xử lí so sánh chương trình tin sinh học Bioedit, Clustal X, Blast, NJ đăng ký GenBank KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh enzim ngoại bào Enzim LiP, MnP laccaza ngày thu hút quan tâm nhà khoa học công nghệ tiềm chúng xử lí chất ô nhiễm hữu chứa vòng thơm Do có tính đặc hiệu chất thấp nên khả phân hủy lignin, enzim peroxidaza Laccaza có khả chuyển hóa nhiều hợp chất hữu phenol phenol khó phân hủy khác, chúng enzim có ý nghĩa xử lí môi trường [1, 2] Phân lâp, sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh enzim ngoại bào từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Biên Hòa tiến hành nghiên cứu Bốn chủng xạ khuẩn XKBH1, XKBH2, XKBH3 XKBH5 phân lập từ mẫu đất nghiên cứu Sau ngày nuôi lắc môi trường KG lỏng, hoạt tính enzim laccaza, MnP LiP xác định Bảng Hoạt tính enzim laccaza, LiP MnP chủng xạ khuẩn nghiên cứu laccaza Chủng xạ khuẩn (U/l) MnP LiP (U/l) (U/l) XKBH1 0,8 0,57 - XKBH2 0,38 - - XKBH3 0,49 - - XKBH5 0,62 - - Chú thích: - chưa phát Như vậy, chủng xạ khuẩn phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa có khả sinh enzim laccaza, dao động từ 0,38 U/l đến 0,8 U/l Chưa phát khả sinh MnP chủng xạ khuẩn Ngoài ra, hoạt tính LiP phát chủng XKBH1 (0,57 U/l) Chủng XKBH1 lựa chọn cho nghiên cứu khả sinh không laccaza cao chủng khác mà có khả sinh LiP 3.2 Khả phân hủy chất ô nhiễm sinh tổng hợp enzim ngoại bào chủng XKBH1 287 Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà Đất “điểm nóng” sân bay Biên Hòa Đà Nẵng bị ô nhiễm 2,4,5-T; 2,4-D, 2,3,7,8-TCDD PAH Kết đánh giá khả sinh trưởng sinh enzim ngoại bào hai môi trường KG SH1 chứa nguồn chất độc 2,4,5-T; dịch chiết đất chứa dioxin, anthracene pyrene cho thấy, chủng XKBH1 sinh trưởng tốt môi trường có chứa chất ô nhiễm khác (bảng 2) Bảng Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn XKBH1 môi trường chứa nguồn ô nhiễm Nguồn ô nhiễm KG SH1 Dịch chiết đất chứa dioxin ++ + 2,4,5- T +++ ++ Anthracene ++ ++ Pyrene ++ ++ Chú thích: + sinh trưởng yếu, ++ sinh trưởng trung bình, +++ sinh trưởng tốt Tuy nhiên, chủng sinh trưởng môi trường KG tốt môi trường CNSH1 sinh trưởng tốt môi trường KG chứa 2,4,5-T Hiện nay, có số công bố khả sử dụng 2,4,5-T dioxin chủng vi sinh vật nguồn carbon lượng Chủng xạ khuẩn XKBH1 sinh trưởng hai môi trường KG SH1 chứa chất ô nhiễm cấu trúc đa nhân Hai môi trường có chứa tinh bột số axít hữu cơ, nên chủng xạ khuẩn XKBH1 sử dụng chất ô nhiễm theo đường đồng trao đổi chất Tuy nhiên, cần có thêm phân tích sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 2,4,5T sắc kí khí khối phổ (GC/MS) dioxin để khẳng định hiệu sử dụng đuờng chuyển hóa chất ô nhiễm mẫu đánh dấu carbon 3.3 Khả phân hủy anthracene pyrene chủng XKBH1 Một lượng nhỏ PAH phát đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin quân cũ Mỹ [3] Các PAH có nguồn gốc từ dầu để hòa tan chất diệt cỏ chứa dioxin Do vậy, loại bỏ PAH đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ưu tiên trình tẩy độc đất ô nhiễm phân hủy sinh học Hai loại PAH anthracene có vòng thơm pyrene có bốn vòng thơm nhiều nhà khoa học quốc tế lựa chọn làm mô hình nghiên cứu sử dụng nghiên cứu khả phân hủy PAH chủng XKBH1 (bảng 3) Bảng Khả phân huỷ PAH chủng XKBH1trên môi trường KG SH1 Môi trường KG SH1 PAH Phân hủy (%) Anthracene 48,3 % Pyrene 72 % Anthracene 55,8 % Pyrene 63,3 % 288 Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza phân hủy hợp chất vòng thơm … Chủng XKBH1 phân hủy 72 % pyrene 48,3 % anthracene môi trường KG; 55,8 % anthracene 63,3 % pyrene môi trường SH1 Hiện nay, có nhiều nghiên cứu Việt Nam quốc tế phân hủy sinh học PAH [1, 4, 10] Chủng vi khuẩn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ phân hủy 64,5 % phenanthrene 61,4 % anthracene sau ngày nuôi cấy nồng độ thấp [10] Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp XKDN12 phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học Đà Nẵng sau ngày nuôi cấy phân hủy 32,72 % phenanthrene, 39,01 % anthracene, 23,32 % fluoranthene 32,1 % dibenzofuran với hàm lượng ban đầu 375,5 ppm, 127,8 ppm, 76,5 ppm 594 ppm [5] So với số chủng kể trên, xạ khuẩn XKBH1 phân hủy anthracene pyrene mức trung bình Tuy nhiên, chủng sử dụng 2,4,5-T dịch chiết đất chứa dioxin khả sinh enzim ngoại bào nên xem nguồn nguyên liệu quí phục vụ xử lí ô nhiễm theo hướng bổ sung giống vi sinh vật 3.4 Khả sinh tổng hợp LiP, MnP laccaza chủng xạ khuẩn XKBH1 Nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzim ngoại bào XKBH1 môi trường chứa chất ô nhiễm dịch chiết đất chứa dioxin, 2,4,5-T, pyrene anthracene tiến hành (bảng 4) Bảng Hoạt tính enzim chủng XKBH1 môi trường có chất độc khác KG (U/l) Nguồn ô nhiễm LiP MnP laccaz a LiP MnP DCD 0,9 - - 0,28 1.5 5,73 2,4,5-T 1,0 - - 1,0 0,23 15,7 Pyrene 2,7 1,52 - 0,5 - - 0,1 - 4,9 0,14 - - Anthra cene laccaz a SH1 (U/l) Chú thích: - chưa phát Trên môi trường KG SH1 có chứa chất ô nhiễm khác chủng XKBH1 có khả sinh laccaza với hoạt tính không cao Trong đáng ý, môi trường KG chủng XKBH1 sinh laccaza cao không nhiều so với môi trường SH1 Đặc biệt môi trường KG chứa pyrene, XKBH1 sinh enzim tốt (2,7 U/l) khả phân hủy tốt (72 % pyrene loại bỏ sau ngày nuôi cấy).Trên môi trường SH1 chứa 2,4,5-T chủng sinh laccaza cao so với nuôi cấy môi trường có chất ô nhiễm khác (1 U/l) song đáng tiếc không phân tích khả phân hủy Khả sinh laccaza môi trường KG có chứa pyrene (2,7 U/l) tốt môi trường SH1 chứa pyrene (0,5 U/l), môi trường SH1 chứa anthracene sinh laccaza (0,14 U/l) cao môi trường KG chứa anthracene (0,1 U/l) Chủng FDNR40 nghiên cứu môi trường SH1 chứa chất ô nhiễm DC, 2,4,5-T, anthracene pyrene có khả sinh enzim laccaza Đặc biệt hoạt tính laccaza cao môi trường SH1 chứa có 100 ppm 2,4,5-T (0,49U/l) [4] Trong đó, 289 Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà chủng XKBH1 có khả sinh laccaza có 2,4,5-T 1,0 U/l, cao so với chủng FDNR40 Trên môi trường SH1 có chất ô nhiếm anthracene pyrene, chủng XKBH1 không sinh LiP, môi trường có chứa DC 2,4,5-T lại có khả sinh LiP cao DC (1,5 U/l) Trên môi trường SH1 có chứa 2,4,5 –T sinh MnP cao tới 15,7 U/l Như chủng XKBH1 có khả sinh tổng hợp laccaza enzim peroxidaza môi trường có chất ô nhiễm với hoạt tính không cao, đặc biệt môi trường SH1 có chứa 2,4,5 –T chủng sinh loại enzim có chuyển màu rõ Không giống hai loại enzim peroxidaza, laccaza có khả tham gia xúc tác nhiều phản ứng khác không cần đến H2O2 trình phân hủy hay khoáng hóa chất hữu mạch vòng gây ô nhiễm có triển vọng ứng dụng nhiều công nghiệp công nghệ sinh học nhằm tạo nguyên liệu cho công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học Chính nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính laccaza làm tăng khả sinh tổng hợp enzim cần thiết Hai yếu tố trước tiên nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt tính laccaza ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả sinh laccaza chủng XKBH1 3.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzim laccaza chủng XKBH1 Từ dấu hiệu rõ ràng chọn lọc ban đầu với chất thị đặc hiệu guaiacol chủng XKBH1 thể khả sinh laccaza peroxidaza tương đối tốt so với chủng phân lập khác Tuy nhiên kết xác định hoạt tính enzim cho thấy hoạt lực không cao Nhận thấy pH dung dịch đệm yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzim trình xác định hoạt tính Vậy, pH dung dịch đệm sử dụng có phải nguyên nhân kĩ thuật dẫn đến hoạt tính enzim thấp? Để trả lời câu hỏi nghiên cứu ảnh hưởng pH đo hoạt tính laccaza dung dịch nuôi cấy chủng XKBH1 tiến hành Chủng XKBH1 nuôi môi trường KG với chất cảm ứng 100 ppm pyrene Sau ngày, dịch nuôi cấy thu lại ly tâm loại sinh khối tế bào Dịch sử dụng để xác định hoạt tính laccaza sử dụng dung dịch đệm natri axetat 20 mM với khoảng pH nghiên cứu từ – (bảng 5) Bảng Ảnh hưởng pH hoạt tính laccaza chủng XKBH1 pH thử nghiệm pH pH pH pH pH Hoạt tính laccaza (U/l) 418,2 126 15,2 1,7 Như vậy, pH dung dịch đệm ảnh hưởng lớn đến hoạt tính laccaza chủng XKBH1 Hoạt tính laccaza đo cao 418,2 U/l pH 126 U/l pH 3, hoạt tính pH 1,7 U/l không phát thấy hoạt tính enzim pH Mặc dù pH hoạt tính laccaza gấp 3,3 lần pH song theo số công bố giới pH ABTS bị oxy hóa phần ảnh hưởng đến giá trị hoạt độ enzim Mặt khác, có nhiều nghiên cứu xác định hoạt tính Laccaza sử dụng ABTS làm chất dung dịch đệm có pH Vì vậy, để thuận tiện việc so sánh đánh giá kết thu nghiên cứu pH chọn để xác định hoạt tính laccaza nghiên cứu nhằm dễ dàng so sánh với công bố quốc tế khác Theo nhiều nghiên cứu công bố, sử dụng syringaldazin làm chất để xác định hoạt tính laccaza pH dung dịch đệm từ 5-7 thích hợp Đối với chất ABTS 290 Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza phân hủy hợp chất vòng thơm … dung dịch đệm có pH thích hợp – Hoạt tính laccaza chủng XKBH1 đo pH tăng khoảng 74 lần so với pH Như vậy, kết nghiên cứu trước cho thấy laccaza từ chủng XKBH1 có hoạt tính thấp xác định hoạt tính laccaza theo Han đồng tác giả [7] ABTS sử dụng làm chất dung dịch đệm axetat pH Đây pH thích hợp để xác định hoạt tính laccaza từ chủng xạ khuẩn XKBH1 Bởi chủng phân lập từ đất bị ô nhiễm chất độc hóa học sân bay Biên Hòa Đất có pH axit đến axit yếu, laccaza chủng sinh hoạt động tốt pH phân hủy chất độc hóa học có đất tốt Tuy nhiên cần có thêm nghiên cứu để tách chiết tinh nghiên cứu số đặc điểm quan trọng gồm trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện, độ bền pH bền nhiệt laccaza từ chủng XKBH1 để minh chứng cho giả thuyết 3.6 Nghiên cứu khả sinh enzim laccaza chủng XKBH1 môi trường có chất cảm ứng khác Ngoài thành phần môi trường, chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng đến khả sinh enzim laccaza vi sinh vật Do đó, chất cảm ứng sử dụng nghiên cứu Veratryl Alcohol (VA), Guaiacol (Guai), 4-Hydroxyl axit Benzoic (HBA), Catechol (Cat), Vanillin (Vanil), axit Ferulic (F A), CuSO4 (Cu2+) với nồng độ thử nghiệm ban đầu 0,5mM Khả sinh enzim laccaza chủng XKBH1 nguồn chất cảm ứng khác theo dõi ngày nuôi cấy (hình 1) Hoạt tính laccaza (U/l) 1200 1000 ngày 800 ngày 600 400 200 VA Guai Vanil FA HBA Cat Cu2+ Chất cảm ứng Hình Hoạt tính enzim chủng XKBH1 chất cảm ứng khác Cả chất cảm ứng bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng mạnh hoạt tính laccaza chủng XKBH1 Hoạt tính laccaza chủng XKBH1 cao nuôi môi trường có bổ sung VA (1073 U/l) Vanillin (945,2 U/l) sau ngày nuôi cấy Đối với chất cảm ứng Cu2+ , Guaiacol, Catechol hoạt tính laccaza chủng XKBH1 mức tương đối cao hoạt tính cao sau ngày Cu2+ (905 U/l), Guaiacol (770,3 U/l), Catechol (565 U/l) Hai chất cảm ứng axit Ferulic HBA cho hoạt tính thấp từ 225 – 234,6 U/l sau ngày nuôi cấy Tuy nhiên, đến ngày thứ hoạt tính laccaza môi trường chứa hai chất cảm ứng lại tăng lên với axit Ferulic 430,3 U/l HBA 350,5 U/l Như vậy, chất cảm ứng khác có ảnh hưởng rõ rệt đến trình sinh tổng hợp laccaza thời gian sinh laccaza có hoạt tính cao chủng XKBH1 291 Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà VA tiền chất tạo nên lignin từ thực vật, có cấu trúc tương tự lignin Do VA đóng vai trò đặc biệt quan trọng trình cảm ứng sinh laccaza từ vi sinh vật để phân hủy lignin Đối với chủng XKBH1 khả sinh laccaza tốt sử dụng VA làm chất cảm ứng Tuy nhiên cần có thêm nghiên cứu nồng độ VA thích hợp cho khả sinh tổng hợp laccaza chủng xạ khuẩn Một số nghiên cứu trước cho thấy, bổ sung CuSO4 làm tăng tốc trình sinh tổng hợp laccaza tăng hoạt tính enzim Sadhasivam Cộng công bố bổ sung CuSO4 vào môi trường nuôi T harzianum WL1 với nồng độ mM thu hoạt tính laccaza 4360 U/l [11] Như vậy, nồng độ CuSO4 bổ sung nghiên cứu làm tăng hoạt tính laccaza chủng XKBH1 lên 905 U/l chưa phải nồng độ tối ưu để chủng XKBH1 sinh tổng hợp enzim laccaza Do vậy, cần có thêm nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ Cu2+ đến khả sinh enzim laccaza chủng XKBH1 Các nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng (VA, Cu2+), ảnh hưởng nồng độ ion kim loại, nhiệt độ nuôi cấy, điều kiện lên men v.v làm tăng hiệu sinh tổng hợp laccaza chủng XKBH1 tiếp tục nghiên cứu tiếp 3.7 Phân loại chủng XKBH1 dựa trình tự đoạn gen 16S rARN Streptomyces sp XKDN12 S chromofuscus NBRC 12851 Streptomyces sp XKDNR1 Streptomyces sp XKDN11 S tosaensis NBRC 13798 S thermodiastaticus NBRC 100020 XKBH1 S bluensis ISP5564 0.002 Streptomyces sp XKNA21 S tricolor LMG 20328 T Hình Cây phát sinh chủng loại chủng xạ khuẩn XKBH1 Đoạn gen 16S rARN chủng XKBH1 (1489 bp) xác định so sánh với trình tự gen 16S rARN chủng xạ khuẩn công bố GenBank, EMBL, DDBJ, 292 Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza phân hủy hợp chất vòng thơm … BPD Kết so sánh trình tự gen 16S rARN cho thấy chủng XKBH1 có mức tương đồng cao với chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình 2) Chủng xạ khuẩn XKBH1 có tương đồng 98 % với nhiều chủng khác chi xạ khuẩn Streptomyces Dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử so sánh trình tự gen 16S rARN chủng XKBH1 xếp vào chi Streptomyces có tên Streptomyes sp XKBH1 Trình tự đoạn gen 16S rARN chủng xạ khuẩn XKBH1 đăng ký GenBank với mã số GQ 204110 Chi Streptomyces chi chiếm số lượng lớn đất có vai trò quan trọng hệ sinh thái đất Một số chủng thuộc chi Streptomyces có khả sinh enzim Lac tương đối tốt Chủng Streptomyces cyaneus CECT 3335 có khả sinh enzim Lac với hoạt độ 1.200 U/l sau ngày nuôi cấy [1] Hai chủng S viridosporus T7A S badius 252 khả sinh enzim ngoại bào có khả phân hủy lignin tương đối tốt Các chủng xạ khuẩn đại diện có quan hệ gần gũi với chủng XKBH1 S thermodiastaticus NBRC 100020; S tosaensis NBRC 13798; S.chromofuscus NBRC 12851; S tricolor LMG 20328T chưa phát khả sinh Lac phân hủy PAH chủng có khả loại bỏ hợp chất vòng thơm Chủng Streptomyces sp XKBH1 khả sinh Lac (1073 U/l), LiP MnP (15,7 U/l) phân hủy tốt PAH ba vòng thơm anthracene PAH bốn vòng thơm pyrene Đây đặc tính để lựa chọn chủng vi sinh vật nhằm xây dựng tập đoàn vi sinh vật phục vụ mục đích xử lí chất ô nhiễm hữu khó phân hủy số chất ô nhiễm môi trường khác điều kiện kiểm soát Kết nghiên cứu góp phần khẳng định đa dạng vi sinh vật nói chung nhóm Streptomyces nói riêng đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin đa dạng vi sinh vật sinh enzim ngoại bào KẾT LUẬN Chủng xạ khuẩn XKBH1 có khả sinh tổng hợp laccaza LiP tốt số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Biên Hòa Chủng XKBH1 sinh trưởng sinh laccaza hai môi trường KG SH1 chứa chất ô nhiễm khác gồm có dịch chiết đất chứa dioxin; 2,4,5-T, anthracene pyrene Hoạt tính laccaza chủng môi trường KG tốt môi trường SH1 2,7 U/l với chất cảm ứng pyrene Trên môi trường SH1 có dioxin 2,4,5-T, chủng XKBH1 có khả sinh tổng hợp enzim ngoại bào LiP, MnP laccaza Đặc biệt hoạt tính MnP chủng cao (15,7 U/l) môi trường SH1 chứa 2,4,5-T Sau ngày nuôi cấy, chủng XKBH1 phân hủy 72 % pyrene 48,3 % anthracene môi trường KG; 55,8 % anthracene 63,3 % pyrene môi trường SH1 với nồng độ ban đầu 100 ppm Hoạt tính laccaza chủng XKBH1 xác định pH 126 U/l, gấp 74 lần pH (1,7 U/l) Cả chất cảm ứng làm tăng hoạt tính laccaza chủng XKBH1 0,5 mM Veratryl Alcohol chất cảm ứng cho hoạt tính cao 1073 U/l sau ngày nuôi cấy Dựa trình tự gen 16S rARN, chủng xạ khuẩn xếp vào chi Streptomyces đặt tên Streptomyces sp XKBH1 (trình tự GenBank: GQ204110) Lời cảm ơn Công trình thực với hỗ trợ kinh phí đề tài Độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme ngoại bào laccazacase, manganese peroxidase, lignin peroxidase từ vi sinh vật phục vụ xử lí chất ô nhiễm đa vòng thơm” 293 Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà TÀI LIỆU THAM KHẢO Levin L., Viale A., Forchiassin A - Degradation of organic pollutants by the white rot basidiomycete Trametes trogii, Int Biodeter Biodegra 52 (2003) 1-5 Arias M E., Maria A., Juana R., Juan S., Andrew S B., Manuel H – Kraft Pulp Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate by laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335, Appl Environ Microbiol 169 (4) (2003) 1953-1958 Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đương Nhã, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Nguyên Quang - Khảo sát vi sinh vật vùng nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin khu vực sân bay Đà Nẵng khử độc đất nhiễm điều kiện phòng thí nghiệm, Tạp chí công nghệ sinh học (4A) (2008) 837- 846 Đặng Thị Cẩm Hà, Trần Thị Như Hòa, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Nguyên Quang, Đàm Thúy Hằng, Nguyễn Quang Huy - Phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân sinh tổng hợp peroxidase, laccase chủng vi khuẩn BDNR10 chủng nấm sợi FDNR40, Tạp chí Độc học 14 (8) (2010) 8-13 Nguyễn Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Ngọc Bảo, Đặng Thị Cẩm Hà - Khả phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân dibenzofuran chủng xạ khuẩn XKDN12, Tạp chí Công nghệ Sinh học (1) (2005) 123-132 Nguyễn Ngọc Bảo, Đàm Thúy Hằng, Vũ Đức Lợi, Đặng Thị Thu, Đặng Thị Cẩm Hà Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa vòng số chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhiễm dầu, Tạp chí khoa học công nghệ 46 (6) (2008) 67-75 Han M J., Choi H T and Song H G - Purification and characterization of laccase from the White Rot Fungus Trametes versicolor Microbio 43 (6) (2005) 555-560 Crawford D L, Ramachandra M - Bacterial extracellular lignin peroxidase United States Patent: 5200338 (1993) Derry K M., Iqbal M., Miller P G G., Mccarthy J A - Screening Actinomycetes for extracellular peroxidase activity, Appl Environ Microbiol 62 (6) (1996) 2186 - 2190 10 La Thị Thanh Phương, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà - Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa nhân (PAHs) chủng vi khuẩn MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ Vũng Tàu, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1) (2003) 109 - 117 11 Sadhasivam S., Savitha S., Swaminathan K., Lin F H - Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1, Process Biochem 43 (2008) 736-742 ABSTRACT PEROXIDASE, LACCASE EXTRACELLULAR ENZYME PRODUCTION AND DEGRADATION OF AROMATIC COMPOUNDS BY ACTINOMYCETE XKBH1 STRAIN Nguyen Quang Huy, Nguyen Ba Huu, Nguyen Thi Thanh Ngan, Dang Thi Cam Ha* Institute of Biotechnology, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi * Email: dangcha80@gmail.com or dangcha80@yahnoo.com 294 Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza phân hủy hợp chất vòng thơm … Four actinomycete strains include XKBH1, XKBH2, XKBH3, XKBH5 were isolated from herbicide contaminated soil at Bien Hoa Airport They showed ability to produce laccase with initial activity was low The XKBH1 strain was identified as Streptomyces sp based on 16S rRNA coding gene sequence analysis The sequence of 16S rRNA gene (approximately 1489 bp) was deposited in the GeneBank with assession number GQ 204110 Strain XKBH1 could grow in KG and SH1 media containing dioxin, 2,4,5-T, pyrene and anthracene After days of inoculation, this strain degraded 72 % pyrene, 48.3 % anthracene in KG medium and 63.3 % pyrene, 55.8 % anthracene in SH1 medium with 100 ppm initial concentration of each PAHs This strain also showed ability in production of laccase in broth KG and SH1 media containing dioxin, 2,4,5-T, pyrene, anthracene Laccase production by XKBH1 strain on KG medium was higher than in SH1 medium with activity was 2.7 U/l containing pyrene This strain also produced laccase, LiP and MnP in SH1 medium with dioxin and 2,4,5-T as inducers The highest MnP activity was 15.7 U/l in SH1 medium containing 2,4,5-T Laccase activity measured at pH increased approximative 74 fold in comparision to pH Almost inducers enhancing laccase activity of XKBH1 strain and showed highest laccase activity (1073 U/l) in KG medium containing Veratryl Alcohol with initial concentration of 0.5 mM Keywords: Streptomyces, laccase, peroxidase, 16S rRNA, inducers 295 ... nóng khảo sát tìm kiếm vi sinh vật có khả sinh enzim LiP, MnP laccaza Xạ khuẩn chiếm số lượng lớn với độ đa dạng cao đất điểm nóng Vậy, xạ khuẩn đóng vai trò trình phân hủy sinh học, chúng có khả. .. có khả sinh enzim laccaza, dao động từ 0,38 U/l đến 0,8 U/l Chưa phát khả sinh MnP chủng xạ khuẩn Ngoài ra, hoạt tính LiP phát chủng XKBH1 (0,57 U/l) Chủng XKBH1 lựa chọn cho nghiên cứu khả sinh. .. gen 16S rARN cho thấy chủng XKBH1 có mức tương đồng cao với chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình 2) Chủng xạ khuẩn XKBH1 có tương đồng 98 % với nhiều chủng khác chi xạ khuẩn Streptomyces