Bài viết trình bày việc xác định các kiểu tái sắp xếp (TSX) gen IGH và trình tự vùng nối đặc trưng cho bệnh nhân đa u tủy mới chẩn đoán và có điều trị đặc hiệu tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học.
KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU XÁC ĐỊNH CÁC KIỂU TÁI SẮP XẾP GEN IGH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG NỐI ĐẶC TRƯNG CHO BỆNH NHÂN ĐA U TỦY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC Phan Ngô Quang Thạch1, Nguyễn Vũ Hải Sơn1, Nguyễn Tấn Bỉnh2, Phan Thị Xinh2, Cao Sỹ Luân2 TÓM TẮT 50 Mục tiêu: Xác định kiểu tái xếp (TSX) gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng cho bệnh nhân đa u tủy chẩn đốn có điều trị đặc hiệu Bệnh viện Truyền máu Huyết học Phương pháp nghiên cứu: Mô tả loạt ca Trong nghiên cứu, sử dụng kĩ thuật multiplex PCR với đoạn mồi thiết kế vùng VH (FR1/FR2/FR3) vùng JH để khuếch đại gen IGH Sau đó, sử dụng kĩ thuật giải trình tự phân tích phần mềm Immunogenetics (IMGT)/V-QUEST để xác định kiểu TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng cho bệnh nhân đa u tủy Kết quả: Từ tháng 04/2020 đến tháng 11/2021, thu thập mẫu dịch hút tủy xương thời điểm chẩn đoán sau điều trị 40 trường hợp đa u tủy Kết xác định có 25 trường hợp (62,5%) ghi nhận biểu mạnh dựa điện di sản phẩm PCR với thạch agarose 2% 21 (52,5%) trường hợp xác định biểu mạnh đơn dòng dựa điện di mao quản Sau đó, trường hợp biểu mạnh đơn dịng tiến hành giải trình tự, phân tích Đại học Y Dược TP.HCM Bệnh viện Truyền Máu - Huyết Học Chịu trách nhiệm chính: Cao Sỹ Luân SĐT: 0917.862.262 Email: caosyluan@gmail.com Ngày nhận bài: 15/8/2022 Ngày phản biện khoa học: 15/8/2022 Ngày duyệt bài: 26/9/2022 416 phần mềm IMGT/V-QUEST với kết tất trường hợp xác định kiểu TSX gen IGH trình tự vùng đặc trưng Kết luận: Chúng tơi xác định kiểu TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng cho trường hợp ghi nhận biểu mạnh đơn dòng (52,5%) Kết sở để thiết kế đoạn dò đặc hiệu cho vùng nối kiểu TSX gen IGH đặc trưng cho bệnh nhân, sử dụng để đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu cho bệnh nhân sau điều trị đặc hiệu Từ khóa: Đa u tủy, tái xếp gen IGH, trình tự vùng nối đặc trưng SUMMARY DETERMINING THE REPERTOIRE AND JUNCTION OF IGH GENE REARRANGEMENTS IN MULTIPLE MYELOMA PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL Objective: Identifying the repertoire and specific junction of IGH gene rearrangements in Vietnamese newly diagnosed multiple myeloma patients who received chemotherapy at Blood Transfusion Hematology hospital Method: A case series The clonal IGH gene rearrangements are detected by multiplex PCR using designed primers at VH (FR1/FR2/FR3) and JH region, then the repertoire and specific junction of IGH gene rearrangements are identified by sequencing technique and IMGT/VQUEST Software TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Results: From April 2020 to November 2021, there were 40 cases of multiple myeloma being treated with chemotherapy or transplantation, and had their bone marrow collected for further monitoring after treatment While 25 patients’ gene expressed (62,5%) strongly on agarose gel electrophoresis, monoclonal strongly expression was noted in only 21 cases (52,5%) on capillary electrophoresis Using sequencing technique and IMGT/V-QUEST Software, we were able to identify the repertoire and specific junction of IGH rearrangment in all cases Conclusions: We identified the repertoire and specific junction of IGH gene rearrangements in patients with monoclonal strongly expression on capillary electrophoresis Quantification of these IGH gene rearrangements would be an essential marker for MRD detection Keywords: Multiple myeloma, IGH rearrangement, specific junction I ĐẶT VẤN ĐỀ Đa u tủy bệnh lý đứng thứ hai tần suất mắc, chiếm 1,4% bệnh lý huyết học ác tính Đa u tủy đặc trưng tăng sinh đơn dịng tương bào ác tính tủy xương, tăng globulin miễn dịch (Ig) đơn dòng, thiếu máu tổn thương đa quan thận, xương, để lại nhiều hậu nặng nề, gây tàn phế tử vong [3] Điểm đặc trưng bệnh lý đa u tủy tỉ lệ tái phát cao, dù điều trị với phác đồ hóa trị liệu tiêu chuẩn, khoảng 16% tái phát năm đầu điều trị [5] Hiện nay, đời phương pháp điều trị kháng thể đơn dòng hay thuốc ức chế phân tử nhỏ, kết hợp với điều trị tiêu chuẩn ghép tế bào gốc trước đó, góp phần tăng tỉ lệ lui bệnh hoàn toàn (complete remission – CR) kéo dài thời gian sống không tái phát (relapse free survival – RFS) Do đặc tính thường xuyên tái phát bệnh lý này, việc đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu (mimimal residual disease – MRD) sau điều trị kĩ thuật có độ nhạy cao cần thiết, vừa giúp cho bác sĩ lâm sàng thay đổi điều trị sớm hơn, vừa liên quan đến tiên lượng thời gian tái phát (time to progression – TTP) [6] Bên cạnh kĩ thuật tế bào dòng chảy (flow cytometry) thường sử dụng, theo y văn, dấu ấn dùng để đánh giá MRD nghiên cứu đa u tủy xương tái xếp (TSX) gen IGH Quá trình TSX đoạn gen V-D-J có tượng chèn ngẫu nhiên hay vài nucleotide (N) hai đầu vùng nối đoạn gen D, tạo vùng V-N-D-N-J, gọi trình tự vùng nối đặc trưng Trình tự vùng nối đặc trưng cho dòng tương bào nên sử dụng dấu ấn để phân biệt tương bào ác tính tương bào bình thường [4] Do đó, việc xác định kiểu TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng cho dịng tương bào ác tính dấu ấn quan trọng giúp theo dõi đáp ứng điều trị cho bệnh nhân đa u tủy xương Hiện nay, kĩ thuật PCR định lượng với trình tự chuyên biệt (allele specific oligonucleotide – ASO RQ-PCR), chuẩn hóa EuroMRD, khảo sát kiểu TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng Ở Việt Nam, tác giả Nguyễn Hải Sơn cộng nghiên cứu báo cáo tỷ lệ kiểu TSX gen IGH biểu mạnh bệnh nhân đa u tủy chẩn đốn [1] Tuy nhiên, chưa có báo cáo xác định kiểu TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng bệnh nhân đa u tủy chẩn đốn có điều trị đặc hiệu Việt Nam Do đó, chúng tơi tiến hành xác định kiểu TSX gen 417 KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU IGH trình tự vùng nối đặc trưng gen này, làm tiền đề cho việc khảo sát bệnh tồn lưu tối thiểu sau điều trị II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu: Mô tả loạt ca Đối tượng nghiên cứu: bệnh nhân đa u tủy xương chẩn đoán bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH) từ tháng 04/2020 đến tháng 11/2021, điều trị đặc hiệu theo dõi sau điều trị Tiêu chuẩn nhận bệnh: bệnh nhân chẩn đoán Đa u tủy theo tiêu chuẩn Hiệp hội nghiên cứu Đa u tủy xương quốc tế (International Myeloma Working Group IMWG) năm 2014 BVTMHH từ tháng 04/2020 đến tháng 11/2021 Các bệnh nhân đồng ý điều trị hóa trị liệu thu thập mẫu dịch hút tủy xương thời điểm chẩn đoán sau giai đoạn cơng q trình điều trị Quy trình thu thập mẫu thực xét nghiệm Mẫu dịch hút tủy xương tích khoảng 2ml, bảo quản chất chống đông EDTA chuyển đến phịng thí nghiệm khoa Di truyền học phân tử, BVTMHH Mẫu ly trích DNA kit ReliaPrep™ Blood gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau đó, sản phẩm ly trích đo độ tinh nồng độ DNA máy quang phổ, pha loãng để thu nồng độ 50 ng/ul Mẫu DNA sau pha loãng thực phản ứng Multiplex PCR, sử dụng đoạn mồi (primer) vùng VH (FR1/FR2/FR3) vùng JH Sản phẩm PCR điện di thạch agarose 2% để xác định mức độ biểu kiểu TSX gene IGH đặc trưng Nếu kết điện di thạch agarose cho thấy có biểu mạnh TSX gene IGH sản phẩm PCR kiểm tra tính chất dịng (đơn hay đa dịng) xác định mức độ biểu mạnh đơn dòng kiểu TSX gen IGH đặc trưng phương pháp điện di mao quản phân tích phần mềm GeneMapper® Hình 4: Mơ hình thiết kế đoạn mồi VH - JH Multiplex PCR 418 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Các sản phẩm PCR thể tính chất đơn dịng giải trình tự kĩ thuật giải trình Sanger, liệu phân tích sơ phần mềm SeqScape (Life Technologies, Hoa Kỳ) Sau đó, chúng tơi sử dụng phần mềm ImMunoGeneTics (IMGT) V-QUEST để xác định trình tự TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng Cuối cùng, sử dụng phần mềm thiết kế mồi đoạn dò PrimerQuestTMTool (IDT, Mỹ) để thiết kế đoạn mồi đoạn dò đặc hiệu cho phản ứng PCR định lượng để đánh giá MRD cho bệnh nhân Mức độ biểu TSX gen IGH phương pháp điện di thạch agarose 2%: Điểm 0: không biểu Điểm 1: biểu yếu Điểm 2: biểu bình thường Điểm 3: biểu mạnh Điểm 4: biểu mạnh Điểm 5: biểu mạnh Hình 5: Hình minh họa thang điểm đánh giá mức độ biểu TSX gen IGH dựa độ đậm băng điện di sản phẩm PCR thạch agarose 2% [1] Xử lí số liệu Số liệu xử lí phần mềm R Project for Statistical Computing Các biến định tính trình bày dạng tần số tỉ lệ Các biến định lượng không phân phối chuẩn mô tả số trung vị khoảng tứ phân vị III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Từ tháng 04/2020 đến tháng 11/2021, BVTMHH, ghi nhận 40 trường hợp bệnh nhân đa u tủy chẩn đoán theo tiêu chuẩn Hiệp hội nghiên cứu Đa u tủy xương quốc tế (International Myeloma Working Group - IMWG) năm 2014, điều trị đặc hiệu hóa trị liệu ghép tế bào gốc Đặc điểm lâm sàng Trong 40 bệnh nhân Đa u tủy thỏa tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu, 50% trường hợp tăng đơn dòng IgG, khoảng 1/3 số bệnh nhân không tiết chuỗi nặng Đa số trường hợp tăng tiết chuỗi nhẹ Kappa đơn dòng Một số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân trình bày Bảng 419 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU Bảng 9: Đặc điểm lâm sàng lúc nhập viện 40 trường hợp Đa u tủy Đặc điểm Bệnh nhân (n = 40) Tuổi lúc chẩn đoán (tuổi) 57 Nam 17 (42,5) Giới tính (n, %) Nữ 23 (57,5) Thiếu máu (n, %) 28 (70) Suy thận (n, %) 15 (37,5) Tăng calci máu (n, %) (22,5) IgG 25 (62,5) Tiết chuỗi nặng đơn IgA (10) dịng (n, %) Khơng tiết 11 (27,5) Kappa 31 (77,5) Tiết chuỗi nhẹ đơn dòng (n, %) Lambda (22,5) Các kiểu TSX gene IGH Trong 21 trường hợp biểu mạnh đơn Tại thời điểm chẩn đoán, chúng tơi nhận dịng, chúng tơi xác định vùng VH, thấy 25 bệnh nhân tổng số 40 trường DH JH kiểu TSX gen IGH hợp có biểu mạnh TSX gen IGH dựa tồn trường hợp, có trường hợp kết điện di thạch agarose 2% không xác định vùng DH Trong (chiếm 62,5%) Khi chúng tơi tiến hành phân vùng VH vùng VH3 chiếm tỷ lệ cao tích phân đoạn phương pháp điện di (57,1%), vùng VH (28,6%); mao quản, 21 40 bệnh nhân (chiếm vùng DH vùng DH3 chiếm 52,5%) ghi nhận có biểu mạnh tỉ lệ cao (35%); vùng JH đơn dịng kiểu TSX, trường hợp vùng JH4 chiếm tỉ lệ cao (42,9%) (Bảng lại ghi nhận tăng đa dòng globulin 10) miễn dịch Bảng 10: Tỉ lệ kiểu TSX đọạn VH-DH- JH TSX đoạn VH TSX đoạn DH TSX đoạn JH Kiểu VH N (%) Kiểu DH N (%) Kiểu JH N (%) VH1 (4,8) DH1 (15) JH1 (4,8) VH2 (4,8) DH2 (15) JH2 (0) VH3 12 (57,1) DH3 (35) JH3 (19) VH4 (28,4) DH4 (5) JH4 (42,9) VH5 (0) DH5 (10) JH5 (9,5) VH6 (4,8) DH6 (20) JH6 (23,8) DH7 (0) (4,8) 420 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Dựa trình tự kiểu TSX V-D- tắc (1) nhiệt độ nóng chảy: nhiệt độ tối ưu J gen IGH, thiết kế cho đoạn mồi 60-64oC đoạn dị đoạn mồi (primers) xi ngược, cao 6-8oC so với mồi Bên cạnh đó, nhiệt đoạn dị (probe) gắn đặc hiệu với trình tự độ nóng chảy hai đoạn mồi chênh vùng nối đặc trưng Nguyên tắc thiết kế đoạn không 2oC, (2) nồng độ GC: trì 35 – mồi đoạn dò dựa số nguyên 65%, tối ưu 50% Bảng 11: Kết thiết kế đoạn mồi đoạn dị dựa trình tự đoạn gen IGH kiểu TSX gen IGH biểu mạnh đơn dịng Nhiệt độ Nồng độ Kích Loại sản Chiều Trình tự nóng chảy GC thước phẩm dài o ( C) (%) (bp) GAG GAC ACG GCT Mồi xuôi 23 63,8 52,2 GTC TAT TAC TG Mồi CTT ACC TGA GGA 22 65,1 59,1 111 ngược GAC GGT GAC C GAT CGC CTA TCG Đoạn dò 25 69,4 60 TTC GGG GAC CAA C IV BÀN LUẬN Sự TSX vùng V, D J gen IGH giúp cho tế bào lympho B trưởng thành có kiểu TSX đặc trưng Việc thêm hay bớt vài nucleotid vào vị trí vùng nối V(D)J tạo nên trình tự vùng nối đặc trưng, chuyên biệt xem “dấu vân tay” dòng tế bào lympho B giai đoạn phát triển khác dòng tế bào lympho B ác tính [6] Gen IGH có vùng VH, vùng JH vùng DH Trong nghiên cứu chúng tôi, vùng VH3 ghi nhận nhiều (>50%), tương đồng với nghiên cứu trước từ tác giả Kiyoi cs (1996), Gonzalez cs (2005), Hadzidimitriou cs (2006) Điều lí giải vùng VH3 chứa nhiều thành phần nhóm vùng VH khác Tương tự, vùng DH3 chiếm tỷ lệ vượt trội vùng DH [2] Theo y văn, TSX gen Ig phát 95% bệnh lí ác tính dịng lympho định lượng kỹ thuật RQ-PCR với độ nhạy đạt đến 104 đến 105 tế bào bình thường, đặc biệt theo dõi bệnh tồn lưu tối thiểu Tuy nhiên, cách tiếp cận ứng dụng rộng rãi bệnh cảnh bạch cầu cấp dòng lympho (> 90%), bệnh lí tế bào lympho B trưởng thành lại chưa áp dụng nhiều (42 – 75% bệnh nhân đa u tủy) Do trình trưởng thành tế bào lympho B hạch lympho xảy kiện siêu đột biến tế bào sinh dưỡng (Somatic hypermutation-SHM) dẫn tới thay đổi trình tự nucleotide vị trí vùng nối đặc trưng làm dấu ấn lúc chẩn đoán ảnh hưởng tới việc theo dõi bệnh tồn lưu tối thiểu Đây điểm hạn chế sử dụng TSX gen IG làm dấu ấn để đánh giá MRD Điều lý giải tỉ lệ ghi nhận số trường hợp mang TSX IGH biểu mạnh đơn dòng 50% nghiên cứu Theo Bruno cs (2015), để giảm tỉ lệ âm tính giả nên sử dụng 421 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU nhiều kiểu TSX gen IG kết hợp với để đánh giá MRD, chẳng hạn ngồi TSX gen IGH kết hợp thêm với TSX gen IGK, IGL, đặc biệt TSX bị ảnh hưởng đột biến SHM IGH (DH-JH) IGK (VK-Kde Intron-Kde) Trong nghiên cứu này, thiết kế đoạn mồi đoạn dò đặc hiệu cho trình tự vùng nối đặc trưng bệnh nhân, dựa nguyên tắc nhiệt độ nóng chảy nồng độ GC Chúng tơi thiết kế đoạn mồi đoạn dò cho tất trường hợp có TSX gen IGH biểu mạnh đơn dịng Đây sở cho chúng tơi theo dõi định lượng bệnh tồn lưu tối thiểu bệnh nhân điều trị Trong nghiên cứu tiếp theo, sử dụng kĩ thuật PCR định lượng, dựa đoạn mồi đoạn dò thiết kế, xác định giá trị chu kì ngưỡng (cycle threshold – Ct) ngoại suy số ban đầu Phương pháp lặp lại sau giai đoạn hóa trị, ghép tế bào gốc, để định lượng bệnh tồn lưu tối thiểu giúp theo dõi đáp ứng điều trị V KẾT LUẬN Chúng xác định 52,5% trường hợp ghi nhận có TSX gen IGH biểu mạnh đơn dịng thông tin vùng VH, DH JH kiểu TSX Đồng thời, dựa trình tự kiểu TSX gen IGH thiết kế đoạn mồi đoạn dò bắt cặp đặc hiệu trình tự vùng đặc trưng cho bệnh nhân, làm sở cho việc đánh giá MRD sau điều trị 422 VI LỜI CÁM ƠN Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học cơng nghệ TP Hồ Chí Minh, Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Vũ Hải Sơn, Lai Kim Phương, Cao Sỹ Luân, Phan Thị Xinh (2021) "Khảo sát TSX gene IGH bệnh nhân đa u tủy Bệnh viện Truyền máu Huyết học kỹ thuật PCR" Tạp chí Y học Việt Nam, 505 (2) David Gonza´lez, Mirjam van der Burg, Ramo´n Garcı´a-Sanz, et al (2007) "Immunoglobulin gene rearrangements and the pathogenesis of multiple myeloma" Blood Elizabeth O.D., Francesca C., Noopur R., et al (2016) "Myeloma" 9th edition Even H Rustad, Kristine Misund, Elsa Bernard, et al (2019) "Stability and uniqueness of clonal immunoglobulin CDR3 sequences for MRD tracking in multiple myeloma" Am J Hematol., 94 (12), pp 1364-1373 Majithia N., Rajkumar S V., Lacy M Q., et al (2016) "Early relapse following initial therapy for multiple myeloma predicts poor outcomes in the era of novel agents" Leukemia, 30 (11), pp 2208-2213 Paiva B., van Dongen J J M., Orfao A (2015) "New criteria for response assessment: role of minimal residual disease in multiple myeloma" Blood, 125 (20), pp 3059-3068 ... báo cáo xác định ki? ?u TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng bệnh nhân đa u tủy chẩn đốn có đi? ?u trị đặc hi? ?u Việt Nam Do đó, chúng tơi tiến hành xác định ki? ?u TSX gen 417 KỶ Y? ?U CÁC CÔNG TRÌNH... TRÌNH NGHIÊN C? ?U KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN M? ?U IGH trình tự vùng nối đặc trưng gen này, làm tiền đề cho việc khảo sát bệnh tồn l? ?u tối thi? ?u sau đi? ?u trị II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP... hóa EuroMRD, khảo sát ki? ?u TSX gen IGH trình tự vùng nối đặc trưng Ở Việt Nam, tác giả Nguyễn Hải Sơn cộng nghiên c? ?u báo cáo tỷ lệ ki? ?u TSX gen IGH bi? ?u mạnh bệnh nhân đa u tủy chẩn đốn [1] Tuy