Luận văn phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật pcr dgge và tạo dõng

1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ 1.1 Rơm rạ Theo thống kê Tổ chức Nông Lƣơng Liên Hợp Quốc (FAOFood and Agriculture Organization) [1], sản xuất lúa gạo giới chạm mức kỷ lục 759,6 triệu lúa (503,9 triệu gạo) năm 2017 năm 2018 tiếp tục tăng sản lƣợng thêm 10,3 triệu lên mức cao 769,9 triệu lúa (510,6 triệu gạo) Dự báo sản lƣợng tăng trƣởng 1,4% năm 2019, khu vực sản xuất lúa gạo tập trung Châu Á chính, vùng sản xuất lớn Nam Á Đông Nam Á với mức tăng sản lƣợng tuyệt đối lớn đƣợc dự đoán Ấn Độ, sản xuất tăng đáng kể nƣớc nhƣ Bangladesh, Sri Lanka, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines Thái Lan, Việt Nam xem bảng 1.1 Tƣơng ứng với việc tăng trƣởng sản xuất lúa gạo hàng năm sản lƣợng rơm rạ đƣợc thải đồng ruộng toàn cầu lớn, nhƣng tới chƣa có thống kê xác lƣợng rơm rạ thải sau thu hoạch lúa, tùy thuộc vào văn hóa địa, loại giống lúa trồng trọt, vùng canh tác điều kiện thổ nhƣỡng Nhƣng tổng thể ƣớc lƣợng trung bình sản xuất gạo thải khoảng 1,5 rơm rạ Bảng 1.1 Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất Thế giới Khu vực/Quốc gia Thế giới Châu Trung Quốc Ấn Độ Indonesia Bangladesh Việt Nam Thai Lan Số lƣợng gạo (triệu tấn) 758.9 686.4 210.1 165.3 74.2 53.1 44 33.3 Khu vực/Quốc gia Châu Phi Ai Cặp Nigeria Madagascar Tanzania Mali Guinea Nam Mỹ Số lƣợng gạo (triệu tấn) 30.7 6.2 5.3 3.5 3.1 2.8 2.2 24.9 Myanmar Philippines Nhật Bản Pakistan Camphuchia Triều Tiên Nepal Lào Malaysia Sri Lanka 28.3 18.6 10.7 10.3 9.7 5.5 5.4 3.1 Brazil Colombia Peru Bắc Mỹ Mỹ Trung Mỹ Châu Âu Nga Úc 11.9 2.6 3.1 9.1 9.1 2.9 4.1 1.1 0.9 Việt Nam trở thành nƣớc xuất gạo đứng đầu giới nay, tốc dộ tăng trƣởng sản xuất lúa gạo từ năm 2012 đạt sản lƣợng 43,7 triệu lúa Đến năm 2018, sản lƣơng tăng lên khoảng 55 triệu tấn, xuất gạo đạt 6,1 triệu tấn, nâng giá trị 3,06 tỷ USD Theo liệu thống kê năm gần Bộ Nông nghiệp Phát Triển Nông thôn Việt Nam, vụ mùa 2015/16 đạt 44,13 triệu lúa, vụ mùa 2016/17 đạt 44,52 triệu vụ mùa 2017/18 đạt đƣợc 44,96 triệu Dự kiến năm 2019 diện tích trồng lúa nƣớc 7,53 triệu ha, sản lƣợng gạo dự kiến tƣơng đƣơng năm 2018 Bên cạnh thống kê tổ chức GAIN (Global Agriculture Information Network) Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ diện tích gieo trồng, suất sản lƣợng gạo Viêt Nam từ năm 1993 đến 2017 tăng trƣởng liên tục diện tích suất xem hình 1.1 Những nỗ lực đem lại lợi ích từ sản xuất lúa gạo ngày gia tăng tăng thu nhập cho nơng dân, nhƣng song song với lƣợng rơm rạ thải hàng năm nƣớc ta trung bình khoảng 55 triệu Đây thách thức cho việc xử lý giảm thiểu ô nhiễm rơm, bên cạnh tận dụng nguồn tài nguyên phế phụ phẩm nông nghiệp nƣớc ta Trong 55 triệu Rơm thải hàng năm có khoảng 20% đƣợc sử dụng cho gia sức gia cầm, trồng nấm rơm, phân ủ, lại đốt bỏ lại đồng ruộng gây ô nhiễm môi trƣờng đồng ruộng lãng phí nguồn tài nguyên tái sinh dồi Hình 1.1 Diện tích gieo trồng, suất sản lƣợng gạo Việt Nam Vấn đề đặt làm nhƣ để tận dụng nguồn tài nguyên tái tạo dồi nhƣ rơm rạ Để đạt hiệu cao trƣớc tiên phân tích phân tích thành phần cấu tạo dinh dƣỡng rơm 1.2 Thành phần cấu tạo Rơm Thành phần cellulose, lignocellulose lignin nguồn sinh khối tế bào thực vật nói chung rơm rạ nói riêng Rơm nguồn nguyên liệu đƣợc tái sinh tự nhiên, thành phần cấu tạo rơm có thay đổi dựa vào phát triển chủng loại lúa, điều kiện thổ nhƣỡng canh tác khác nhau, yếu tố môi trƣờng khắc nghiệt, côn trùng mầm bệnh Thành phần hóa học rơm tính theo khối lƣợng khô gồm cellulose 60%, lignin 14%, đạm hữu (protein) 3%, chất béo (lipid) 2% Nếu tính theo nguyên tố cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, nitơ (N) khoảng 0,92%, lƣợng nhỏ photpho (P), lƣu huỳnh (S) kali (K) Theo kết phân tích thành phần đƣờng rơm bao gồm hexose (glucose, galactose, mannose), pentose (xyloza, arabinose), lignin (cả axit hịa tan khơng hịa tan), tro, silica Ngồi cịn có thành phần phi cấu trúc chủ yếu bao gồm protein (khoảng 3%) pectin (khoảng 2,8%) với lƣợng nhỏ đƣờng tự do, diệp lục, chất béo, dầu sáp đƣợc nêu bảng Bảng 1.2 1.3 [2, 3, 4, 5] Bảng 1.2 Thành phần cấu tạo chung rơm rạ Thành phần Glucose Xylose Arabinose Mannose Galactose Acid soluble lignin Acid insoluble lignin Ash and silica Extractive (i.e., protein, pectin,) other nonstructural components) Hàm lƣợng (w/w%) 34.0 - 43.7 19.0 - 22.0 2.0 - 3.6 1.8 -2.0 0.4 2.2 - 6.0 13.0 - 22.7 7.8 - 20.3 16.1- 19.3 Bảng 1.3 Thành phần hóa học Rơm Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng Carbon Hydrogen Nitrogen Sulphur Oxygen Tổng Thành phần hóa học Nguyên tố halogen Chlorine (Cl) Bromine (Br) Fluorine (F) Nguyên tố Aluminium (Al) Potassium (K) Sodium (Na) Calcium (Ca) wt% wt% wt% wt% wt% wt% 47.92 6.54 0.53 0.09 44.80 100.00 mg/kg mg/kg mg/kg 1,109.4 0.0 0.0 mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) 143.0 8,668.0 162.0 3,899.0 Silicon (Si) Magnesium (Mg) Iron (Fe) Phosphorus (P) Titanium (Ti) Nguyên tố phụ Cadmium (Cd) Cobalt (Co) Chromium (Cr) Copper (Cu) Manganese (Mn) Nickel (Ni) Lead (Pb) Vanadium (V) Zinc (Zn) Barium (Ba) Nguyên tố khác Strontium (Sr) Boron (B) Tungsten (W) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) 6,734.0 571.0 100.0 558.0 3.6 mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) 0.0 15.0 1.7 3.0 17.0 1.5 1.0 0.3 6.6 22.5 mg/kg (dry) mg/kg (dry) mg/kg (dry) 26.0 2.7 13.0 Những kết phân tích cho thấy thành phần chất xơ rơm rạ chủ yếu cellulose, hemicellulose lignin Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử polymer mạch thẳng, đơn vị disaccharide gọi cellobiose, có cấu tạo từ hai phân tử D-glucose Các đơn vị D-glucose liên kết với liên kết β-1,4 đƣợc giữ chặt liên kết hydro liên chuỗi liên chuỗi mạnh để tạo thành vi sợi Chúng cung cấp độ bền học cho thành tế bào thực vật dài vài µm rơm đƣờng kính khoảng 12-35nm [6, 7] Các công bố cho thấy mức độ trùng hợp D-glucose rơm rạ cao chút so với dƣ lƣợng nông nghiệp khác nhƣ rơm lúa mì bã mía nhƣng thấp đáng kể so với gỗ cứng gỗ mềm [8] Hemicellulose heteropolysaccharide với cellulose có màng tế bào thực vật, khơng hịa tan đƣợc nƣớc nhƣng hịa tan đƣợc dung dịch kiềm bị thủy phân acid dễ dàng so với cellulose Hemicellulose liên kết phần với lignin liên kết cộng hóa trị, mối liên kết hemicelluloses cellulose thông qua liên kết hydro Trong cỏ lồi động vật nhai lại có vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase phân giải đƣợc cellulose Cellulose hemicellulose hợp chất tiêu hóa đƣợc.Nhƣng cấu tạo cellulose vách tế bào rơm rạ qua nhiều liên kết cấu trúc không gian phức tạp, nên enzyme hệ vi sinh vật khơng dễ dàng tác động đƣợc Lớp ngồi thành tế bào đƣợc tạo thành chủ yếu từ phức chất lignohemicellulose mà enzyme vi sinh cỏ phân giải chậm làm cản trở lớp cellulose bị tác động hệ enzyme vi sinh vật Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa rơm rạ chất xơ khác, nhà nghiên cứu tiến hành xử lý rơm nhiều phƣơng pháp nhƣ: lý học, hóa học, vi sinh vật [9, 10] Thành phần thứ ba đáng ý xơ lignin, lignin kèm với cellulose hemicellulose thành phần tế bào, khơng hịa tan nƣớc, dung mơi hữu bình thƣờng bền vững enzyme hệ sinh vật cỏ Nhƣng dƣới tác dụng kiềm lignin phần bị phân giải chuyển vào dung dịch Lignin polymer có nhiều thứ hai trái đất sau cellulose, lignin chủ yếu bao gồm ba loại cấu trúc chủ yếu monolignols, hydroxycinnamyl (p- coumaryl, coniferyl rƣợu sinapyl) liên kết với loại liên kết ether carbon-carbon khác nhƣ β-O-4, 4-O- 5, -, β- β- để tạo đơn vị phenylpropanoid nhƣ p - hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) syringyl (S) Trong số này, liên kết β-O-4 liên kết ether chiếm ƣu (khoảng 40 - 60%) rơm rạ Lignin đƣợc gắn vào carbohydrate este benzyl, ete benzen phenyl glycoside Do mối liên kết hóa học liên kết vật lý chặt chẽ này, khó để loại bỏ lignin dạng nguyên sinh [11] 1.3 Giá trị kinh tế rơm rạ Thành phần phân tích cho thấy nguồn giá trị từ rơm chƣa đƣợc quan tâm mức thời gian dài, phần lớn rơm rạ thƣờng để mục, tự phân hủy đồng ruộng hay đốt chỗ để trả lại khống chất cho ruộng, phần cịn lại đƣợc đem làm thức ăn cho gia súc, phục vụ đun nấu gia đình hay trồng nấm rơm Hơn 20% rơm đƣợc sử dụng khoảng 50% rơm bị đốt cháy để lại đồng ruộng, họ sẵn sàng cho vụ mùa Đốt rơm ảnh hƣởng khí nhà kính mà cịn nhiễm độc hại đƣợc báo cáo mà cịn góp phần đến hen suyễn rối loạn hô hấp khác trẻ nhỏ ngƣời già [12, 13] Do đó, cần phải phát triển giải pháp nghiên cứu nhằm tận dụng rơm để nông dân nhận đƣợc lợi nhuận cao cho việc thu gom từ ruộng kềm chế đốt rơm gây thêm ô nhiễm môi trƣờng Năm 2009, liệu báo cáo Tổ chức Nông Lƣơng Liên Hợp Quốc lúa đƣợc trồng chủ yếu vùng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới, nhiên số sản xuất lúa vùng khí hậu Địa Trung Hải Khu vực sản xuất lúa gạo tập trung Châu Á chính, vùng sản xuất lớn Nam Á Đông Nam Á Đối với lúa mì, nhà sản xuất đƣợc đặt Nam Á, Đơng Âu, Bắc Mỹ Đông Trung Á Đối với Liên minh châu Âu, lúa mì loại trồng chiếm ƣu so với trồng lúa gạo.Thống kê sản lƣợng lúa gạo sản lƣợng rơm đƣợc tạo ta toàn giới nêu bảng 1.4 Bảng 1.4 Số liệu thống kê sản lƣợng gạo rơm rạ giới (FAO) Diện tích(ha) Gạo (tấn) Rơm rạ (tấn) Thế giới 158,511 684,595 727,400 Nam Á 59,449 202,889 215,600 Đông Nam Á 48,203 197,777 210,100 Tây Á 32,999 216,630 230,200 Đông Á 5,114 10,392 11,000 Nam Mỹ 5,253 25,568 27,200 Đông Phi 3,147 6,701 7,100 Trung Phi 691 663 700 Bắc Phi 590 5,593 6,000 462 3,152 3,350 Liên Minh Châu Âu Caribbean 456 1,246 1,300 Nam Âu 418 2,906 3,100 Trung Mỹ 326 1,228 1,300 Đông Âu 225 1,183 1,250 Trung Á 193 696 740 Tây Á 153 927 990 Tây Âu 24 138 150 Châu Đại Dƣơng 14 82 90 3 Nam Phi Lƣợng lớn rơm hàng năm toàn cầu xem nhƣ nguồn nhiên liệu vơ lớn Nhiều khía cạnh phân tích công bố thành phần rơm cho thấy giá trị kinh tế nguồn phụ phẩm nông nghiệp đem lại lớn đa dạng để sản xuất dầu sinh học, than sinh học khí sinh học từ rơm rạ Dầu sinh học rơm rạ đƣợc báo cáo bao gồm số thành phần phụ nhƣ ketone, aldehyd, axit carboxylic, phenol, furfural levoglucosan, than sinh học đƣợc sản xuất từ rơm tạo độ phì đất, tăng lƣu trữ carbon giảm phát thải khí nhà kính Năng suất, chất dinh dƣỡng, hàm lƣợng chất dễ bay hơi, khả trao đổi ion dƣơng, kali phốtpho có sẵn hàm lƣợng than sinh học giảm tăng nhiệt độ nhiệt phân, độ kềm hàm lƣợng chất thơm Than sinh học có nguồn gốc từ rơm cho thấy khả hấp thụ ion Cu (II) cyromazine, loại thuốc trừ sâu hữu [14, 15, 16] Q trình khí hóa rơm rạ để xử lý chất thải gần thu hút đƣợc quan tâm để sản xuất khí Hydro Metan Rơm đƣợc sử dụng làm nhiên liệu cho nồi để sản xuất điện phân tích kinh tế kỹ thuật cho thấy lựa chọn khả thi để tạo điện nông thôn dựa lƣới điện nhỏ vùng sâu vùng xa Quốc gia phát triển Khi mà vấn đề biến đổi khí hậu tồn cầu trở nên nóng bỏng việc sử dụng khối lƣợng lớn rơm cho hợp lí điều mà nhà khoa học quan tâm đến, nghiên cứu gần tập trung vào việc tận dụng nguồn nhiên liệu cellulose rơm để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuels) cho tƣơng lai nhằm thay nguồn tài nguyên dầu mỏ ngày cạng kiệt Trong thành phần rơm chủ yếu cellulose sản phẩm phân giải cuối có giá trị D-glucose, việc phân giải thu nhân sản phẩm glucose làm nguồn nguyên liệu khác đƣợc quan nhiều nghiên cứu Trong có phƣơng pháp hóa học phân hủy thu nhận cellulose mà phƣơng pháp sinh học sử dụng phân giải tự nhiên hệ enzyme đƣợc sinh từ hệ vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều 1.2 HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM RẠ 1.2.1 Hệ Enzyme cellulase chế phân giải cellulose Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy vi sinh vật điều kiện yếm khí hiếu khí thời gian dài sản phẩm phân giải cuối glucose Q trình diễn nhiều nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp loại enzyme có phức hệ enzyme cellulase phân giải cellulose Chính thế, phân giải cellulose điều kiện tự nhiên thƣờng chậm không triệt để Sự tham gia enzyme phân hủy cellulose đƣợc nhà khoa học chia làm ba nhóm chủ yếu nhƣ sau [17, 18] 1,4 β-D-Glucan cellobiohydrolase: enzyme cắt đầu không khử chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme cịn có loạt tên khác nhƣ: cellobiosehydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase avicellase Enzyme khơng có khả phân giải cellulose dạng kết tinh mà làm thay đổi tính chất hóa lý chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng 1,4β-D-glucan glucanohydrolase: enzyme tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid cellulose lichenin β-Dglucan Sản phẩm trình phân giải cellodextrin, cellobiose glucose.Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh 10 Enzyme cịn có tên khác nhƣ: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase Ccellulase β-D-glucoside glucohydrolase: enzyme tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose Trong tài liệu khoa học chúng cịn có tên cellobiase β-glucosidase Sự thủy phân cellulose có tham gia tất ba loại enzyme exoglucanase, endoglucanase, β-glucosidase Trong nghiên cứu riêng rẽ loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đƣa kết luận chung loại enzyme cellulase thay thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối glucose xem hình 1.2 Hình 1.2 Qui trình phân giải cellulose thành glucose Phân giải cellulose trình sinh học đƣợc tạo kiểm soát enzyme cellulase Cellulase enzyme đa dạng với chức xúc tác cho phản ứng đơn, đóng vai trị phản ứng thủy phân cầu 45 Hình 3.7 Kết 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 thể gel agarose 1% đƣợc ly trích thu nhận từ vi kuẩn E.coli JM109 đƣợc chèn vào vector pGEM@-T Easy (A B) 3.8 Kết kiểm tra gene V3 sau tạo dòng kỹ thuật DGGE Lấy kết sản phẩm PCR hình 3.7(A, B) thực phƣơng pháp DGGE từ kết vị trí mẫu gene V3 cho thấy gene tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 30 tƣơng ứng với gene Rn4 So sánh sản phẩm DGGE với hình 3.5D cho thấy vị trí đoạn gene phƣơng pháp DGGE tạo dòng điều cho kết giống 46 Hình 3.8 Kết 30 sản phẩm DGGE chạy hệ thống BioRad với nguồn điện 200volt/300phút gel polyarylamide 40-60% (A, B) Chọn đại diện đoạn gene V3 sản phẩm tạo dòng tƣơng ứng với vị trí đoạn gene Rn cho mẫu nhƣ sau; gene 5, 26, xem hình 3.8 (A,B) sản phẩm tạo dòng Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 sản phẩm DGGE xem hình 3.5(D) giải trình tự gene so sánh kết liệu gene đoạn V3 ngân hàng liệu NCBI với công cụ BLAST Kết trình tự đoạn gene giống Rn1, gene 26 giống Rn2, gene giống Rn3 tƣơng tự gene với Rn4 Dựa vào so sánh tính tƣơng đồng mẫu trình tự Rn với tham chiếu Genbank với mức cụ thể nhƣ sau; Kết cho thấy gene (Rn1) tƣơng đồng với chi Agrobacterium 96%, gene 26 (Rn2) gene (Rn3) thuộc chi Clostridium với mức độ tƣơng đồng gần với chủng Clostridium thermocellum, Clostridium aurantibutyricum lần lƣợt tƣơng ứng 99%, 98% gene (Rn4) có mức độ tƣơng đồng với loài Agrobacterium 95% xem hình 1.9 Thơng qua kỹ thuật PCR-DGGE tạo dịng với kết thu đƣợc giống mẫu Rn, cịn lại hai chi Clostridium, Agrobacterium Vì giai đoạn rơm ủ nhiệt độ tăng khoảng 70-800C thời gian ủ kéo dài khoảng 18 ngày, làm cho diện tính đa dạng dịng vi khuẩn khơng cịn nhƣ mẫu rơm ban đầu nhƣ kết phân tích hình 1.1D 1.2 [70] 47 Hình 3.9 Cây phát sinh loài vi khuẩn mẫu Rn Dựa phân tích trình tự vùng gen V3 (Rn1, Rn2, Rn3 Rn4) với chủng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI Các vi khuẩn đƣợc xác định phổ biến gặp phải đống phân ủ giai đoạn cuối chu kỳ ủ phân đại diện cho vi khuẩn ƣa ấm, nhiệt độ 10-400C (mesophilic bacteria) phát triển nhƣ Staphylococcus sp, Staphylococcus aureus, Bacillus sp B subtilis, B brevis, B polymyxa loài chiếm ƣu bắt đầu trình ủ phân tất loại phân ủ dần biến hoàn toàn sau 20 ngày, cịn lại nhóm vi khuẩn Bacillus sp có khả tạo bào tử Ngồi có nhóm nấm Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Fusarium moniliforme, Rhizopus nigricans, Penicillium citrinum nhiều công bố nghiên cứu [69.70.71] 48 3.9 Kết sơ định tính enzyme cellulase mẫu Rn Xác định khả tồn enzyme cellulase mẫu Rn (Rn1, Rn2 Rn3) thông qua phƣơng pháp đĩa CMC nhằm kiểm tra kết sơ định tính có diện enzyme cellulase tạo vịng phân giải CMC mơi trƣờng thạch đĩa xem hình 3.10 Hình 3.10 Thử khả sinh cellulase đĩa CMC mẫu Rn Kết cho thấy mẫu rơm rạ sau có enzyme cellulase Chứng tỏ nhóm vi khuẩn tồn mẫu rơm rạ suốt q trình ủ có khả sinh enzyme cellulase nhằm phân hủy cellulose rơm rạ cung cấp nguồn glucose cho tồn phát triển Tóm lại: Mẫu Rơm (Rn) đƣợc thu nhận xã Tân Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp cho kết sản phẩm PCR từ thu nhận DNA gene nhân đoạn gene V3 thuộc vùng gene 16S rDNA dựa cặp mồi chung 357F-GC 517R Thông qua phân tích cộng đồng vi khuẩn kỹ thuật DGGE cho đoạn gene V3 Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 Kỹ thuật Tạo dòng cho phân đoạn gene tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần cịn lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 30 tƣơng ứng với gene Rn4 Ngoài mẫu Rơm (R) cho thấy tính đa dạng vi khuẩn mẫu chƣa thông qua ủ khoảng chi lại khoảng chi vi khuẩn sau giai đoạn ủ Kỹ thuật phân tích PCR-DGGE Tạo dịng áp dụng cho việc phân tích cộng đồng vi khuẩn nói riêng 49 nhóm vi sinh nói chung loại mẫu khác nhau, điều kiện hệ vi sinh luôn thay đổi bên cạnh giúp định hƣớng phân lập giống vi khuẩn hỗ trợ cho nghiên cứu từ kết phân tích kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng 50 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Kết phân tích mẫu rơm trƣớc ủ (R) với phƣơng pháp PCR-DGGE thu đƣợc gene R1 ứng với chi Agrobacterium, R2 thuộc chi Clostridium, R3 tƣơng ứng với chi Bacteroidetes, R4 tƣơng tự chi Thermopolysporasa R5 thuộc chi Bacillus Kết phân tích mẫu rơm sau ủ (Rn) với phƣơng pháp PCR-DGGE tạo dòng cho thấy gene Rn1 (gene 5) gene Rn4 (gene 3) tƣơng đồng với chi Agrobacterium, gene Rn2 (gene 26) gene Rn3 (gene 8) thuộc chi Clostridium Kết liệu gene mẫu R có đa dạng vi khuẩn khoảng chi, cịn mẫu Rn tính đa dạng vi khuẩn khoảng chi Điều cho thấy biến động đa dạng vi khuẩn giai đoạn rơm ủ Việc sử dụng so sánh kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng với mẫu Rn cho kết hoàn toàn giống vị trí gel polyacrylamide trình tự gene đoạn gene V3 mẫu Rn Điều sử dụng độc lập kỹ thuật PCR-DGGE tạo dịng phân tích cộng đồng vi sinh vật kết hợp hai phƣơng pháp với 4.2 Kiến nghị Cần phân tích thơng số ngoại sinh ảnh hƣởng trực tiếp gián tiếp ụ rơm ủ nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, pH kết hợp kiểm tra thay đổi cộng đồng vi khuẩn liên tục theo ngày chất lƣợng rơm suốt giai đoạn ủ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2017, Rice Market Monitor FAO Su HJ., Bo SK.,Joo SK., 2008, Production of bio-oil from rice straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis plant equipped with a fluidized bed and a char separation system, J Anal Appl Pyrolysis, 82, pp 240–247 Kapoor M., Soam S., Agrawal R., Gupta RP., Tuli DK and Kumar R., 2017, Pilot scale dilute acid pretreatment of rice straw and fer-mentable sugar recovery at high solid loadings, Bioresour Technol, 224, pp.688-693 Wi SG., Choi IS., Kim KH., Kim HM., Bae HJ., 2013, Bioethanol production from rice straw by popping pretreatment, Biotechnol Biofuel, 6(1) Pp 1-7 Belal EB., 2013, Bioethanol production from rice straw residues, Braz Microbiol, 44(1), pp 225-234 Yang B., Dai Z., Ding SY., Wyman C E., 2011, Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass, Biofuels, 2(4), pp.421-449 Abe K., Yano H., 2009, Comparison of the characteristics of cel-lulose microÞ bril aggregates of wood, rice straw and potato tuber, Cellulose, vol 16(6), pp 1017-1023 Hallac BB., Ragauskas AJ., 2011, Analyzing cellulose degree of polymerization and its relevancy to cellulosic ethanol, Biofuels Bioprod Bioref, 5(2), pp.215-225 Lê Đức Ngoan, 2005, Giáo trình thức ăn gia súc, Nhà xuất Nông nghiệp 10 Fan G., Wang M., Liao C., Fang T., Li J., Zhou R., 2013, Isolation of cellulose from rice straw and its conversion into cellulose acetate catalyzed by phosphotungstic acid, Carbohydr Polym, 94(1), pp.71-76 52 11 Wang H., Ben H., Ruan H., Zhang L., Pu Y., Feng M., 2017, Effects of lignin structure on hydrodeoxygenation reactivity of pine wood lignin to valuable chemicals, ACS Sustain Chem Eng, 5(2), pp.1824-1830 12 Oladosu Y., RaÞi MY., Abdullah N., Magaji U., Hussin G., Ramli A., 2016, Fermentation quality and additives: a case of rice straw silage, Biomed Res Int, p.1-14 13 Nguyen HV., Nguyen CD., Tran TV., Hau HD., Nguyen NT., Gummert M., Energy effciency, greenhouse gas emissions, and cost of rice straw collection in the mekong river delta of vietnam Field Crops Res, 198, pp.16-22 14 Balagurumurthy B., Srivastava V., Vinit KJ., Biswas B., Singh R., 2015, Value addition to rice straw through pyrolysis in hydrogen and nitrogen environments, Bioresour Technol, 188, pp.273-279 (2015) 15 Jung SH., Kang BS., Kim JS., 2008, Production of bio-oil from rice straw and bamboo sawdust under various reaction conditions in a fast pyrolysis plant equipped with a ß uidized bed and a char separation system, J Anal Appl Pyrolysis, 82(2), pp.240-247 (2008) 16 Wu W., Yang M., Feng Q., McGrouther K., Wang H., Lu H., 2012, Chemical characterization of rice straw-derived biochar for soil amendment, Biomass Bioenerg, 47, pp.268-276 (2012) 17 Nguyễn Đức Lƣợng, 2010, Công nghệ sản xuất enzyme Nhà xuất Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh 18 Yang B., 2011, Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass Biofuels 2, pp.421-449 19 Shewale J., 1982, β-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose, International Journal of Biochemistry, 14, pp.435443 53 20 Wiseman JWA., 1983, Fungal and other β-dglucosidases: their properties and applications, Enzyme and Microbial Technology, 4, pp 73– 79 21 Wilson DB., 2008, Three microbial strategies for plant cell wall degradation, Annals of the New York Academy of Sciences, 1125, pp.289297 22 Oyeleke S., Okusanmi T., 2008 Isolation and characterization of cellulose hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants, African Journal of Biotechnology 23 Huang S., 2012, Isolation and identification of cellulolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae), International journal of molecular sciences, 13, pp.2563-2577 24 Hu X., 2014, Cellulolytic bacteria associated with the gut of Dendroctonus armandi Larvae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), Forests, 5, pp.455-465 25 Schwarz W., 2001, The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria, Applied microbiology and biotechnology, 56, pp.634649 26 Rastogi G., 2009, Isolation and characterization of cellulosedegrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA, Journal of industrial microbiology & biotechnology, 36, pp.585-598 27 Kluepfel D.,1986, Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans, Applied microbiology and biotechnology, 24, pp.230-234 28 Semêdo L., 2004, Streptomyces drozdowiczii sp nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazil, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 54, pp 1323-1328 54 29 Schrempf H., Walter S., 1995, The cellulolytic system of Streptomyces reticuli, International journal of biological macromolecules, 17, pp.353-355 30 Chang CC., 2009, Activity of cellulase from Thermoactinomycetes and Bacillus spp isolated from Brassica waste compost, Scientia Agricola, 66, pp.304-308 31 Mba CC., 1997, Rock phosphate solubilizing Streptosporangium isolates from casts of tropical earthworms, Soil Biology and Biochemistry, 29, pp.381-385 32 Shahriarinour M., 2011, Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palm empty fruit bunch fibre, Biotechnology, 10, pp.108-113 33 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2008, Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục 34 Ausubel FM., Brent R., Kinhston RE.,, Moore DD., Seidman JG., Smith JA., Struhl K., 1992, Current protocols in molecular biology, New York: Greene Publishing Association; Wiley-Interscience, vol.1 35 Zhu H., Qu F., Zhu LH., 1993, Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride, Nucleic Acids Res, 21, pp.5279- 5280 36 Zhou J., Bruns MA., Tiedje JM., 1996, DNA recovery from soils of diverse composition, Appl Environ Microbiol, 62, pp.316 - 322 37 Jara C., Mateo E., Guillamón JM., Torija MJ., Mas A., 2008, Analysis of several methods for the extraction of high quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for characterization by PCR based methods, International Journal of Food Microbiology, 128, pp.336-321 38 Jia X., Han J., Zhao YH., Zhou YM., 2006, Comparisons of extraction and purification methods of soil microorganism DNA from rhizosphere soil, Journal of Forestry Research, 17, pp 31 - 34 55 39 Sabine W., Stephan S., Ralf C., 2001, Bacterial Populations Colonizing and Degrading Rice Straw in Anoxic Paddy Soil, Appl Environ Microbiol, 67, pp.1318- 1327 40 Sung HG., 2007, Low ruminal pH reduces dietary fiber digestion via reduced microbial attachment, Association Animal Production Societies, 20, pp 200 - 207 41 Vila RC., Kazuo M., Susumu A., Makoto K., 2003, Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis, Soil Sci Plant Nut, 49, pp 619 - 630 42 Haruta S., Cui Z., Huang Z., Li M., Ishii M., Igarashi Y., 2002, Construction of a stable microbial community with high cellulose degradation ability, Appl Microbiol Biotechnol, 59(4), pp 529 - 534 43 Saiki R., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., 1985, Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science, 230, pp.1350-4 44 Arvind Kumar Singh, 2012, Molecular taxonomy: use of modern methods in the identification of species, Indian J.L.Sci, 2(1), pp.143-147 45 Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H., 1986, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 51, pp.63-73 46 Mullis K., Faloona F., 1987, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, Methods Enzymol,155, pp.335-350 47 Arvind Kumar Singh, 2012, Molecular taxonomy: use of modern methods in the identification of species, Indian J.L.Sci, 2(1), pp.143-147 48 Adam K., Anna K., Hubert S., Michał N., Marta M., 2017, A Review of Conventional PCR Assays for the Detection of Selected Phytopathogens of Wheat, J Mol Microbiol Biotechnol, 27, pp.175–189 56 49 Daniela B., Paola C., Lorenzo B., Fabio Q., Milena B., Daniele D., Piero A., 2009, Endophytic bacterial diversity in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves described by 16S-rDNA gene sequence analysis and length heterogeneity-PCR, Journal of Microbiology, 47, pp 393 - 401 50 Lucia A., Ilaria M., Roberto P., Lucia C., Francesca C., 2004, Amplified ribosomal DNA restriction analysis for the characterization of Azotobacteraceae : a contribution to the study of these free-living nitrogenfixing bacteria, Journal of Microbiological Methods, 57, pp.197 - 206 51 Lu JJ., Perng CL., Lee SY., Wan CC., 2000, Use of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestions for detection and indentification of common bacterial pathogens in cerebrospinal fluid, Journal of Clincical Microbiology, 38, pp.2076 – 2080 52 Elmilson RG., Yoko BR., 2002, Phylogentic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer sequences, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, pp.355- 361 53 Fircher SG., Lerman LS., 1983, DNA fragments differing by single base pair subtitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory, Proc Natl Acad Sci USA, 80, pp.1579 1583 54 Muyzer G., Brinkhoff T., Nuben U., Santegoeds C., Schofer H., Wawer C., 1997, Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology, Molecular Microbial Ecology manual, pp.1-27 55 Wang J., Ma T., Zhao L., Li J., Zhao L., Li G., 2008, PCR-DGGE method for analyzing the bacterial community in a high temperature petroleum reservoir, World of Journal Microbioal Biotechnol, 21, pp.19811987 56 Learn HLC., Shiran MS., Vui CMWL., Nurul SAM., Son R., Andrase HM., 2012, Andrade Identification of actinomycete communities 57 in Antarctic soil from Barrientos Island using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis, Genetics and Molecular Research, 11 , pp.277-291 57 Okada H., 2010, Technical report on the PCR-DGGE analysis of soil Nematode community, Ver.2.3 58 Tomoyukihori, Shin H., Yohiyuki U., Masaharu I., Yasuo I., 2006, Direct comparinson of singlestand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragments, Journal of Microbiological Methods, 6, pp 6165–169 59 Takeshi W., Susumu A., Asumi., Kazunari N., Makoto K., 2004, DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil FEMS Microbiology letters, 232, pp.15-163 60 Cheon J., Hidaka T., Mori S., Koshikawa H., Tsuno H., 2008, Applicability of random cloning method to analyze microbial community in full-scale anaerobic digesters, J Biosci Bioeng, 106(2), pp.134-40 61 Steger K., Sjogren AM., Jarvis A., Jansson JK., Sundh I., 2007, Development of compost maturity and Actinobacteria populations during full-scale composting of organic household waste, Journal of Applied Microbiology, 103, pp 487 – 498 62 Vila RC., Kazuo M., Susumu A., Makoto K., 2003, Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis, Soil Sci Plant Nut 49, pp.619 – 630 63 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng Đặng Thị Cẩm Hà, 2008, Xác định đa dạng vi khuẩn bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6, pp 59 - 65 64 Nghiêm Ngọc Minh, 2004, Sử dụng kỹ thuật điện di gel gradient biến tính để nghiên cứu đa dạng vi sinh vật, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, pp.397 - 406 58 65 Nguyễn Thanh Thủy, La Thị Phƣơng Đặng Thị Cẩm Hà, 2004, Sử dụng phƣơng pháp điện di gel gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng vi sinh vật công thức thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, pp.381- 388 66 N.Đ.Duy, H.N.P.Thảo, H.Q.Khánh, N.T.Nguyên, P.Đ.Tuấn, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Kouji Yoshida, Yasuo Igarashi, 2013, Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn Rơm rạ huyện Lai Vung, Đồng Tháp, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 51 (3A), pp.1-16 67 Ngo.Đ.D, Nguyen T T.V, Dao.T.T.H, Hoang Q K, Mannix P., Yamada C., Yoshida K., Igarashi Y, 2012, Phân tích Cộng đồng vi khuẩn phân ủ phƣơng pháp DGGE, Tạp chí Sinh học 34(SE), pp.118124 68 Brown TA., 1998, Gene cloning in Research and Biotechnology Gene cloning an introduction, Stanley Thornes (Publishers) Ltd 69 Mohd LCJ., Latifah AM., Puziah AL., 2013, Composting of rice straw with effective microorganisms (EM) and its influence on compost quality, Iranian J Environ Health Sci Eng, 10(1), pp 17 56 70 Irnis AZ., Siti NBK., Norhasykin MR., 2018, Effect of pH, temperature and moisture content during composting of rice straw burning at different temperature with food waste and effective microorganisms, International Conference on Civil & Environmental Engineering, vol 34 71 Mohamed H., Mohamed G., Osama MN., 2013, Microbial diversity during composting cycles of rice straw, International journal of Advanced Biological and Biomedical Research, 1, pp.232-245 72 Tang JC., Shibata A., Zhou Q., Katayama A., 2007, Effect of temperature on reaction rate and microbial community in composting of cattle manure with rice straw, J Biosci Bioeng, 104(4), pp.321-8 73 Yu S., Bukin Y., Galachyants P., Morozov IV., Bukin1 SV., Zakharenko AS., Zemskaya TI., 2019, Data Descriptor: The effect of 16S 59 rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results, https://doi.org/10.1038/sdata.2019.7 ... nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tạo dịng PCR- DGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn chƣa công bố Mục tiêu nghiên cứu sử dụng hai kỹ thuật PCR- DGGE tạo dịng phân tích cộng đồng vi khuẩn rơm rạ Nhằm định... kỹ thuật PCR DGGE phân tích hệ vi sinh vật lên men kỵ khí rơm rạ Cùng nghiên cứu hệ vi sinh phân giải rơm rạ có báo cáo sử dụng kỹ thuật xác định giải trình tự chủng vi khuẩn lên men kỵ khí rơm. .. mẫu Rơm (R) cho thấy tính đa dạng vi khuẩn mẫu chƣa thơng qua ủ khoảng chi cịn lại khoảng chi vi khuẩn sau giai đoạn ủ Kỹ thuật phân tích PCR- DGGE Tạo dịng áp dụng cho vi? ??c phân tích cộng đồng vi