LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ bã đậu nành (okara)

Ðậu nành và các sản phẩm chế biến từ nó, có đầy đủ protein, lipid, carbohydrat, cellulose và các hoạt chất sinh học quý như polyphenols, lecithin, saponin, phytoestrogen (isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans…) có tính năng đa dạng bảo vệ cơ thể phòng, chống nhiều bệnh hiểm nghèo đồng thời là nguồn dinh dưỡng tuyệt hảo của nhân loại giúp giải quyết cho chúng ta rất nhiều vấn đề liên quan đến sức khỏe và tình trạng thiếu ăn trên thế giới. Protein đậu nành còn có tác dụng hữu hiệu giảm cholesterol trong máu, giảm thiểu nguy cơ các bệnh liên quan đến tim mạch, chúng cũng ngăn cản sự phát triển các mầm ung thư, ngăn ngừa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh xốp xương, và các triệu chứng rối loạn tiền mãn kinh phụ nữ [18].Tuy giá trị dinh dưỡng của đậu nành rất cao, song giá trị thực sự của đậu nành trong nền kinh tế thị trường còn rất thấp, thể hiện ở năng lực cạnh tranh của đậu nành và các sản phẩm. Năm 1999, Viện Nghiên cứu quản lý Trung ương trên cơ sở áp dụng phương pháp phân tích tĩnh đã báo cáo về năng lực cạnh tranh của 40 sản phẩm và dịch vụ, chia thành 3 nhóm [30]Lý do quan trọng làm giảm sức cạnh tranh của đậu nành là các sản phẩm từ đậu nành cho đến nay phần lớn là các loại sản phẩm truyền thống, trong số đó có ít sản phẩm công nghiệp song có loại lại tạo độc tố như nhóm cloropropanol, phải tiêu hủy hàng loạt. Các sản phẩm nước chấm chứa nhiều muối, không dùng được lượng lớn trong một khẩu phần. Ngoài ra ít các sản phẩm khác có giá trị công nghiệp và công nghệ sinh học. Bên cạnh đó, ở Việt Nam, ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành hàng năm thải ra lượng xác bã rất lớn 1200 tấn/ngày [12]. Mặc dù lượng xác bã này còn chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng không thể làm thực phẩm cho người do có nhiều hợp chất khó tiêu hoá như cellulose… Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả dĩ có thể tận dụng được phế phẩm này để phục vụ lại con người là rất quan trọng. Một trong những giải pháp đó là sử dụng enzyme protease vi sinh vật B.amyloliquefaciens và sinh khối nấm sợi Linh chi như enzyme cellulase . Sinh khối nấm sợi là giai đoạn đầu và không thể thiếu trong chu trình phát triển của bất kỳ một loại nấm nào. Chúng phát triển rất nhanh, ở nấm lớn, thời gian từ nuôi trồng nấm trong bao PE chứa cơ chất đến lúc thu hoạch chỉ mất 3-4 tuần (so với 6-8 tuần đối với thể quả) ; ở nấm vi thể (nấm mốc) tơ nấm sinh trưởng còn nhanh hơn nhiều, toàn bộ chu trình sinh trưởng kéo dài chỉ 7-8 ngày [20]. Các hoạt chất sinh học như dẫn xuất Adenosine, Cyclooctasulfur, Lingzhi-8….. của sinh khối nấm sợi cũng phong phú và có thể so sánh với tai nấm về thành phần và hàm lượng các enzyme dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm: nước tương, nước chấm, nấu cồn sản xuất rượu, acid citric, acid gluconic; trong công nghiệp dược: sản xuất kháng sinh penicillin, sephalosporin..., ecgoalcaloit, các steroid, alkaloid, saponin...; trong sản xuất thuốc sinh học trừ sâu (Beauveria bassiana); trong sản xuất kích thích tố sinh trưởng thực vật (gibberellin...)...) [20].Với những ý tưởng trên, tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ chế phẩm bã đậu nành (okara) ” nhằm các mục đích:Tận dụng được phần chế phẩm là bã đậu nành ( okara) gồm chủ yếu là xơ, chất béo, và protein không tan trong nước của công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hủ.Sử dụng nấm sợi Linh chi làm vỏ bọc sinh học vừa để định hình khối cho sản phẩm, vừa để chống oxy hóa cho cơ chất đồng thời để thu được các hoạt chất sinh học quý tương đồng với những chất có trong thể quả của nấm Linh chi, kết hợp tạo ra enzyme cellulase trong việc thủy phân cellulose của nguyên liệu okara.Sử dụng vi khuẩn B. amyloliquefaciens thủy phân các thành phần dinh dưỡng không tan còn tích trữ lại trong thành phần okara như protein, do hệ enzyme protease của B. amyloliquefaciens hoạt động mạnh. Đồng thời cơ chất đậu nành cũng là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển.Phối trộn các thành phần dinh dưỡng thiết yếu khác như isomalt để giảm vị đắng của nấm Linh chi phù hợp cho người tiêu dùng.Đáp ứng xu hướng giảm tiêu thụ chất đạm và béo động vật thay vào đó là dùng những thực phẩm có nguồn gốc thực vật, điển hình là đậu nành.

TÓM TẮT ĐỒ ÁN

Nghiên cứu này với mục đích tận dụng nguồn phế phẩm là bã đậu nành Trước đây,

bã đậu nành thường được các nhà sản xuất sữa đậu nành bán cho các hộ gia đình haytrang trại để làm thức ăn cho gia súc vì hàm lượng xơ không tan và protein khôngtan còn lại trong bã đậu nành với hàm lượng lớn không thể sử dụng làm thức ăn chongười, qua công đoạn sấy và nghiền thì bã đậu nành sẽ ở trạng thái dạng bột mịnđược gọi là Okara vớithành phần đạm của Okara chiếm từ 35%-36%, thành phần xơchiếm 2%-10% Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả dĩ có thể tận dụng đượcphụ phẩm Okara này để tạo ra một sản phẩm bột dinh dưỡng phục vụ lại con người

là rất quan trọng Một trong những giải pháp đó là sử dụng enzyme protease vi sinh

vật B.amyloliquefaciens và sinh khối nấm sợi Linh chi như enzyme cellulose.

Ứng dụng công nghệ sinh học bằng cách cấy giống Linh chi vào cơ chất là bột okara

đã qua công đoạn phối trộn với nước với tỷ lệ okara: nước(g:g) là 1:3 tạo ra bộtokara với hàm ẩm thích hợp 50,4%, với mục đích Linh chi sẽ tiết ra enzymecellulase thuỷ phân cellulose có trong okara, sau khi sinh khối nấm sợi Linh chi lan

ra khắp bề mặt và trong lòng cơ chất thì tiến hành xay nhuyễn khối Linh chi đó và

để khoảng một ngày trong tủ lạnh để enzyme thuỷ phân sâu vào cơ chất cắt mạch

cellulose càng ngắn càng tốt Tiếp theo cấy giống vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens để vi khuẩn này tiết ra enzyme protease thuỷ phân protein không

tan thành các peptid mạch ngắn, các acid amin

Nghiên cứu cách cấy tỷ lệ giống cho phù hợp và thời gian để hệ enzyme thuỷ phâncác hợp chất không tan càng nhiều càng tốt, tiến hành xác định các chỉ tiêu dinhdưỡng có trong bán thành phẩm Bán thành phẩm sau khi xử lý sẽ được sấy chânkhông và nghiền mịn để tạo ra sản phẩm bột dinh dưỡng, tuy nhiên sản phẩm nàycòn vị đắng nhẫn của nấm Linh chi, để hạn chế nhược điểm trên thì tiến hành phốitrộn đường isomalt với tỷ lệ bột: isomalt (g:g) 1:2 tạo sản phẩm hoàn thiện về mặtcảm quan

Sự biến đổi mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus amylolyquefaciens qua kết quả khảo sát thời gian tăng sinh cho thấy được vi khuẩn B.A tăng trưởng tốt ở điều kiện pH 7,

nuôi trong 24 giờ với mật độ 3,8 *10^13 CFU/ml

Hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn B.A đạt cực đại khi cấy tăng sinh vi khuẩn

này trong 24 giờ với hoạt độ xác định lá 20,42 (đvht/ml MT) Qua đó, tạo tiền đề

cho việc cấy giống vi khuẩn B.A vào sinh khối nấm sợi Linh chi đã được khảo sát

bằng cách đo hàm lượng đạm formol qua các thời gian thuỷ phân khác nhau và kếtquả khảo sát cho thấy ứng với thời gian thuỷ phân là 24 giờ, tỷ lệ giống 10%, hàm

lượng đạm formol 2,74% là phù hợp cho việc cấy vi khuẩn B.A

Đối với nấm Linh chi, qua kết quả khảo sát hoạt độ enzyme cellulase cho thấy hoạttính enzyme này đạt cực đại trong thời gian nuôi nấm 8 ngày với hoạt độ xác địnhđược là 15,657 UI/ml

Các chỉ tiêu quan trọng của sản phẩm bột dinh dưỡng như sau : độ ẩm 8,3%, đạmtổng số 2,457%, đạm formol Nformol 2,74%, đường tổng 2,341%, đường khử 0,625%,hàm lượng lipid 2,32%, hàm lượng cellulose 0.34% Tổng năng lượng mà sản phẩmcung cấp cho người sử dụng là 37 Kcal

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Phiếu giao khóa luận/ đồ án tốt nghiệp

Lời cảm ơn

Tóm tắt đồ án

Mục lục iii

Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt x

Danh mục các hình xi

Danh mục các bảng xiii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về đậu nành 4

1.1.1 Đặc điểm của cây đậu nành 4

1.1.2 Thành phần dinh dưỡng của đậu nành 4

1.1.3 Công dụng của đậu nành 7

1.2 Tổng quan về bã đậu nành okara 8

1.2.1 Giới thiệu 8

1.2.2 Tình sử dụng và nghiên cứu bột okara ngoài nước 9

1.2.3 Tình sử dụng và nghiên cứu bột okara trong nước 9

1.2.4 Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g) 10

1.2.5 Quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành 15

1.3 Tổng quan về Linh chi 15

1.3.1 Hệ thống phân loại 15

1.3.2 Đặc tính sinh học của nấm Linh chi 16

1.3.3 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 17

1.3.4 Công dụng của nấm Linh chi 19

1.3.5 Enzyme cellulase trong nấm Linh chi 19

1.4 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 20

1.4.1 Hệ thống phân loại 20

1.4.2 Đặc điểm phân bố 20

1.4.3 Đặc điểm hình thái 21

1.4.4 Cấu trúc 21

1.4.5 Sự hình thành bào tử 23

1.4.6 Hệ enzyme của B amyloliquefaciens 23

1.4.7 Công dụng của B.amyloliquefaciens 24

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu 25

2.2 Dụng cụ và thiết bị 25

2.2.1 Dụng cụ 25

2.2.2 Các thiết bị 25

2.3 Sơ đồ nghiên cứu vi sinh vật 25

2.3.1 Nghiên cứu hình thái và đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.A 25

2.3.1.1 Quan sát hình thái của vi khuẩn B.A bằng phương pháp nhuộm Gram 26 2.3.1.2 Quan sát bào tử của B.A bằng phương pháp nhuộm bào tử 26

2.3.1.3 Định tính enzyme protease của vi khuẩn B.A 26

2.3.1.4 Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.A bằng cách khảo sát ảnh hưởng pH đến sự tăng sinh B.A 27

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học, đặc điểm sinh hoá

của nấm sợi Linh chi 28

2.3.2.1 Phương pháp làm tiêu bản để quan sát nấm sợi Linh chi 28

2.3.2.2 Phương pháp xác định các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi 29

2.3.2.3 Phương pháp định tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi bằng cách đo đường kính vòng phân giải 30

2.4 Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật 30

2.4.1 Xác định hoạt độ protease của vi khuẩn B.A theo phương pháp Anson cải tiến 30

2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase của Linh chi 33

2.4.3 Nghiên cứu quy trình công nghệ chế biến sản phẩm bột dinh dưỡng từ chế phẩm bã đậu nành Okara 36

2.4.3.1 Quy trình sản xuất dự kiến 36

2.4.3.2 Bố trí thí nghiệm 38

2.5 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng 44

2.5.1 Phương pháp phân tích độ ẩm 44

2.5.2 Xác định hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 44

2.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng N amoniac 45

2.5.4 Phương pháp xác định hàm lượng N formol 45

2.5.5 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng 45

2.5.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 46

2.5.7 Phương pháp xác định hàm lượng lipid 46

2.5.8 Phương pháp xác định hàm lượng cellulose 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48

3.1 Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các vi sinh vật và nấm

Linh chi 48

3.1.1 Bacillus amyloliquefaciens 48

3.1.1.1 Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.A bằng cách khảo sát thời gian tăng sinh B.A 48

3.1.1.2 Định tính enzyme protease của vi khuẩn B.amyloliquefaciens 50

3.1.2 Nấm Linh chi 50

3.1.2.1 Kết quả định tính các chất có hoạt tính sinh học của nấm Linh chi 50

3.2 Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật dùng trong đề tài 53

3.2.1 Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme protease của vi khuẩn B.amyloliquefaciens theo thời gian 53

3.2.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của nấm Linh chi theo thời gian .54

3.3 Kết quả chế biến sản phẩm 55

3.3.1 Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước (okara:nước) 55

3.3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ giống vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens cấy vào khối nấm Linh chi đến hàm lượng đạm formol và chất lượng cảm quan 56

3.3.3 Kết quả cảm quan sản phẩm xác định tỷ lệ phối trộn isomalt và bột dinh dưỡng .60

3.4 Kết quả phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm 62

3.4.1 Độ ẩm 62

3.4.2 Chỉ tiêu đạm tổng số Nts 63

3.4.3 Chỉ tiêu đạm formol Nformol 63

3.4.4 Chỉ tiêu đạm NH3 63

3.4.5 Đường tổng 64

3.4.6 Đường khử 64

3.4.7 Hàm lượng lipid 64

3.4.8 Hàm lượng cellulose 65

3.4.9 Hoạt lực enzyme có trong 1 g sản phẩm 66

3.5 Cảm quan sản phẩm 66

3.6 Kết quả tính nhu cầu năng lượng cần thiết của người trong ngày 67

3.6.1 Tính nhu cầu năng lượng cả ngày 67

3.6.2 Kết quả tính toán năng lượng cung cấp cho người từ sản phẩm 68

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69

4.1 Kết luận 69

4.2 Đề nghị 69 TÀI LIÊU THAM KHẢO I PHỤ LỤC IV Phụ lục A Một số môi trường, hóa chất dùng trong đề tài IV Phụ lục B Các đường chuẩn dùng trong đề tài VI Phụ lục C Cách tiến hành thí nghiệm nhuộm vi sinh vật và định tính enzyme

cellulase VII PL.C.1 Nhuộm Gram của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VII PL.C.2 Nhuộm bào tử của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens VIII

PL.C.3 Định tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi bằng cách đo đườngkính vòng phân giải VIIIPhụ lục D Các phương pháp phân tích chỉ tiêu chất lượng IXPL.D.1 Phương pháp phân tích độ ẩm IXPL.D.2 Xác định hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl XPL.D.3 Phương pháp xác định hàm lượng N amoniac XIPL.D.4 Phương pháp xác định hàm lượng N formol XIIPL.D.5 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng XIII PL.D.6 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử XVPL.D.7 Phương pháp xác định hàm lượng lipid XVI

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B.A : Bacillus amyloliquefaciens

CFU: colony forming unit

TCA: trichloracetic acid

PGA: Plate Count Agar

UV: ultra violet

NB: Nutrient broth

CMC: Carboxyl Methyl Cellulose

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Quả đậu nành 4

Hình 1.2 Okara dạng bột 8

Hình 1.3 Cellulose 11

Hình 1.4 Hemicellulose 12

Hình 1.5 Pectin 12

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành 15 Hình 1.7 Nấm Linh chi 15

Hình 1.8 Chu trình sống của Linh chi 17

Hình 1.9 Khuẩn lạc B amyloliquefaciens 20

Hình 1.10 Hình nhuộm tế bào vi khuẩn B.amyloliquefaciens 21

Hình 1.11 Cấu trúc và bề mặt vi khuẩn B.amyloliquefaciens 22

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ protease 32

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme cellulase 35

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến bột dinh dưỡng 36

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trương nước của okara 39

Hình 2.5.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tỷ lệ giống vi khuẩn cấy 40

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tỷ lệ phối trộn bột thành phẩm: isomalt 41

Hình 3.1 Khuẩn lạc B amyloliquefaciens 48

Hình 3.2 Tế bào vi khuẩn B.A 48

Hình 3.3 Đồ thị sự biến đổi mật độ tế bào B.A theo thời gian ở pH 7 49

Hình 3.4 Phản ứng thủy phân casein 50

Hình 3.5 Hình thái nấm sợi Linh chi 50

Hình 3.6 Định tính saponin - phản ứng Liebermann-Burchard 50

Hình 3.7 Định tính alkaloid 51

Hình 3.8 Định tính steroid - phản ứng Salkowki 51

Hình 3.9 Vòng phân giải CMC 50

Hình 3.10 Nấm Linh chi nuôi cấy bằng cơ chất bã đậu nành okara trong bao 300g sau 3 tuần 52

Hình 3.11 Đồ thị biến thiên hoạt tính enzyme protease của B.A theo thời gian .53 Hình 3.12 Đồ thị đường biến thiên hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi theo thời gian 54

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ giống và thời gian thuỷ phân đến sản phẩm 57

Hình 3.14 Sản phẩm bột dinh dưỡng 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Hàm lượng các chất dinh dưỡng của hạt đậu nành 5

Bảng 1.2: Hàm lượng đạm của hạt đậu nành Việt Nam ( %/100g protein) 5

Bảng 1.3: Thành phần hydratcacbon trong đậu nành 6

Bảng 1.4: Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g) 10

Bảng 1.5: Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi 18

Bảng 2.1 : Bố trí thí nghiệm cảm quan bằng phép thử so hàng thị hiếu 42

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến sự tăng sinh B.A 48

Bảng 3.2: Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn B.A 53

Bảng 3.3: Sự biến thiên hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi theo thời gian 54

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước của okara 55

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.A để chế biến sản phẩm từ okara 56

Bảng 3.6: Kết quả xác định đạm NH3 58

Bảng 3.7 Kết quả tỷ lệ NNH3/ Nformol 59

Bảng 3.8: Kết quả cảm quan sản phẩm 60

Bảng 3.9: Bảng tổng hạng giữa các mẫu và nhóm ý nghĩa cho từng sản phẩm 61

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát nguyên liệu (% /100g) 62

Bảng 3.11: Kết quả đo đạm tổng số 63

Bảng 3.12: Kết quả xác định đường tổng 64

Bảng 3.13: Kết quả xác định đường khử 64

Bảng 3.14: Kết quả xác định hàm lượng lipid 64

Bảng 3.15: Kết quả xác định hàm lượng cellulose 65

Bảng 3.16 Hệ số nhu cầu năng lượng cả ngày của người trưởng thành theo chuyển hoá cơ sở 67

Bảng 3.17 Kết quả tính nhu cầu năng lượng cả ngày đối với từng đối tượng lao động khác nhau 68

LỜI MỞ ĐẦU

Ðậu nành và các sản phẩm chế biến từ nó, có đầy đủ protein, lipid,carbohydrat, cellulose và các hoạt chất sinh học quý như polyphenols, lecithin,saponin, phytoestrogen (isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans…) có tínhnăng đa dạng bảo vệ cơ thể phòng, chống nhiều bệnh hiểm nghèo đồng thời lànguồn dinh dưỡng tuyệt hảo của nhân loại giúp giải quyết cho chúng ta rất nhiều vấn

đề liên quan đến sức khỏe và tình trạng thiếu ăn trên thế giới Protein đậu nành còn

có tác dụng hữu hiệu giảm cholesterol trong máu, giảm thiểu nguy cơ các bệnh liênquan đến tim mạch, chúng cũng ngăn cản sự phát triển các mầm ung thư, ngăn ngừabệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh xốp xương, và các triệu chứng rối loạn tiền mãnkinh phụ nữ [18]

Tuy giá trị dinh dưỡng của đậu nành rất cao, song giá trị thực sự của đậunành trong nền kinh tế thị trường còn rất thấp, thể hiện ở năng lực cạnh tranh củađậu nành và các sản phẩm Năm 1999, Viện Nghiên cứu quản lý Trung ương trên cơ

sở áp dụng phương pháp phân tích tĩnh đã báo cáo về năng lực cạnh tranh của 40 sảnphẩm và dịch vụ, chia thành 3 nhóm [30]

Lý do quan trọng làm giảm sức cạnh tranh của đậu nành là các sản phẩm từđậu nành cho đến nay phần lớn là các loại sản phẩm truyền thống, trong số đó có ítsản phẩm công nghiệp song có loại lại tạo độc tố như nhóm cloropropanol, phải tiêuhủy hàng loạt Các sản phẩm nước chấm chứa nhiều muối, không dùng được lượnglớn trong một khẩu phần Ngoài ra ít các sản phẩm khác có giá trị công nghiệp vàcông nghệ sinh học

Bên cạnh đó, ở Việt Nam, ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành hàngnăm thải ra lượng xác bã rất lớn 1200 tấn/ngày [12] Mặc dù lượng xác bã này cònchứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng không thể làm thực phẩm cho người do có nhiềuhợp chất khó tiêu hoá như cellulose… Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả dĩ

có thể tận dụng được phế phẩm này để phục vụ lại con người là rất quan trọng Mộttrong những giải pháp đó là sử dụng enzyme protease vi sinh vật

B.amyloliquefaciens và sinh khối nấm sợi Linh chi như enzyme cellulase Sinh khối

nấm sợi là giai đoạn đầu và không thể thiếu trong chu trình phát triển của bất kỳ một

loại nấm nào Chúng phát triển rất nhanh, ở nấm lớn, thời gian từ nuôi trồng nấmtrong bao PE chứa cơ chất đến lúc thu hoạch chỉ mất 3-4 tuần (so với 6-8 tuần đốivới thể quả) ; ở nấm vi thể (nấm mốc) tơ nấm sinh trưởng còn nhanh hơn nhiều, toàn

bộ chu trình sinh trưởng kéo dài chỉ 7-8 ngày [20]

Các hoạt chất sinh học như dẫn xuất Adenosine, Cyclooctasulfur, 8… của sinh khối nấm sợi cũng phong phú và có thể so sánh với tai nấm về thànhphần và hàm lượng các enzyme dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm: nướctương, nước chấm, nấu cồn sản xuất rượu, acid citric, acid gluconic; trong côngnghiệp dược: sản xuất kháng sinh penicillin, sephalosporin , ecgoalcaloit, cácsteroid, alkaloid, saponin ; trong sản xuất thuốc sinh học trừ sâu (Beauveriabassiana); trong sản xuất kích thích tố sinh trưởng thực vật (gibberellin ) ) [20]

Lingzhi-Với những ý tưởng trên, tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sản xuất bột dinh dưỡng từ chế phẩm bã đậu nành (okara) ” nhằm các mục đích:

Tận dụng được phần chế phẩm là bã đậu nành ( okara) gồm chủ yếu là xơ,chất béo, và protein không tan trong nước của công nghiệp sản xuất sữa đậu nànhhay đậu hủ

Sử dụng nấm sợi Linh chi làm vỏ bọc sinh học vừa để định hình khối cho sảnphẩm, vừa để chống oxy hóa cho cơ chất đồng thời để thu được các hoạt chất sinhhọc quý tương đồng với những chất có trong thể quả của nấm Linh chi, kết hợp tạo

ra enzyme cellulase trong việc thủy phân cellulose của nguyên liệu okara

Sử dụng vi khuẩn B amyloliquefaciens thủy phân các thành phần dinh

dưỡng không tan còn tích trữ lại trong thành phần okara như protein, do hệ enzyme

protease của B amyloliquefaciens hoạt động mạnh Đồng thời cơ chất đậu nành

cũng là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển

Phối trộn các thành phần dinh dưỡng thiết yếu khác như isomalt để giảm vịđắng của nấm Linh chi phù hợp cho người tiêu dùng

Đáp ứng xu hướng giảm tiêu thụ chất đạm và béo động vật thay vào đó làdùng những thực phẩm có nguồn gốc thực vật, điển hình là đậu nành

 Nét mới của đề tài:

1. Khẳng định khả năng nuôi được sinh khối nấm sợi Linh chi trên bã đậu nànhquy mô 300g/bao với độ ẩm thích hợp là 50% [20] trong khoảng thời gian 3 tuần

2. Khẳng định khả năng dùng nấm sợi của Linh chi để:

- Phân giải cellulose của bã đậu nành thành các glucid mạch ngắn mà conngười có thể tiêu hoá

- Sử dụng các hợp chất sinh học quý tương tự như trong quả thể của nấm Linhchi song ở dạng hoàn toàn tươi sống không qua xử lý trước khi dùng nhưAdenosine, Cyclooctasulfur… có tác dụng ức chế giải phóng histamine và

ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn cơ, giảm đau

3. Dùng B amyloliquefaciens thuỷ phân các protein không tan của bã đậu nành

để chế biến sản phẩm bột dinh dưỡng

4. Bước đầu tạo sản phẩm mới bột dinh dưỡng từ phụ liệu bã đậu nành

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 1.1 Giới thiệu về đậu nành

1.1.1 Đặc điểm của cây đậu nành [ 1]

Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Fabales

Họ: Fabaceae Phân họ: Faboideae Chi: Glycine

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học Glycine max (L Merrill) là loại

cây họ Đậu (Fabaceae) giàu hàm lượng protein, được trồng để làm thức ăn chongười và gia súc Cây đậu tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng.Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thôhoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữađậu nành, okara đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của ngườicũng như gia súc

1.1.2 Thành phần dinh dưỡng của đậu nành

Trong hạt đậu nành có các thành phần hoá học sau: protein (40%), lipid (12-25%),glucid (10-15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1,B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose Đậu nành có đủ các acid amin cầnthiết: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin, arginin,histidin, threonin nên được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứamột lượng đáng kể các acid amin không thay thế cần thiết cho cơ thể

Bảng 1.1 Hàm lượng các chất dinh dưỡng của hạt đậu nành

Nhận xét : theo số liệu bảng 1.1 ta thấy hàm lượng đạm trong hạt đậu nành là rất

cao Chủ yếu tập trung nhân và phôi hạt chiếm trên 40% trong toàn khối hạt, ngoài

ra hàm lượng lipid và carbohydrate chiếm khá cao, điều đó cho thấy hạt đậu nànhloại ngũ cốc giàu chất dinh dưỡng như protein, lipid, glucid

Theo số liệu phân tích của công ty Ajinomoto, Thái Lan, 1994, hàm lượng dinhdưỡng của hạt đậu nành Việt Nam như sau:

Bảng 1.2 Hàm lượng đạm của hạt đậu nành Việt Nam ( %/100g protein)

Nhận xét: theo bảng 1.2 ta thấy trong các thành phần hóa học của đậu nành, thành

phần protein chiếm một tỉ lượng rất lớn Protein đậu nành được tạo bởi các acidamin, trong đó có đủ các loại acid amin không thay thế có số lượng khá cao tươngđương lượng axit amin có trong thịt và một số thực phẩm quan trọng

Hàm lượng protein tổng dao động trong hạt đậu nành từ 29,6– 48%; trung bình 36 –40% Có thể nói protein đậu nành gần giống protein của trứng

Trong protein đậu nành globulin chiếm 85-95% Ngoài ra còn có một số lượng nhỏalbumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutenlin

Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành Phần hydratcacbon có thể chia ralàm hai loại, loại tan trong nước và loại không tan trong nước Loại tan trong nướcchỉ chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon

Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành

Nhận xét : thành phần hydratcacbon hoà tan chiếm với hàm tương tương đối không

cao dao động trong khoảng 1%- 5% nhưng hàm lượng xơ không tan lại vượt trộihơn hẳn như cellulose, hemicelluloses trên 15% vì thế trong công nghiệp sản xuấtsữa đậu nành sau quá trình ly tâm tách các protein hoà tan thì trong xác bã vẫn cònmột lượng protein không tan lớn cho nên cần phải thuỷ phân các hợp chất khó tiêuhoá này thành các chất dễ tiêu hoá là việc rất quan trọng và cần thiết

Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành, trong đóđáng chú ý nhất là calci, phospho, mangan, kẽm và sắt Ngoài ra trong đậu nành còn

có chứa rất nhiều vitamin khác nhau, trừ vitamin C thành phần vitamin như sau :vitamin B, H, K, A, E, riboflavin, niacin, pyridocin, acid pantothenic, acid folic,inositol…

Trong công nghiệp thực phẩm, đậu nành được coi như là một nguyên liệu quantrọng để sản xuất dầu thực vật, thức uống dinh dưỡng, các sản phẩm lên men và cácloại thực phẩm khác.

1.1.3 Công dụng của đậu nành [ 21]

Đậu nành có chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và là nguồn cung cấpcalcium, chất xơ, sắt và vitamin B Các hợp chất isoflavon và các chất hóa học trongđậu nành như phytochemicals khác trong đậu nành có khả năng phòng ngừa và điềutrị một số bệnh như: đau tim, tai biến mạch máu não, ung thư vú, ung thư kếttràng… (Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại họcAlabama Minnesota, Iowa và Helsinki, Phần Lan) Những chất hóa học trong đậunành gồm có: protease inhibitors, phytates, phytosterols, saponins, acid phenolic,lecithin, acid béo omega 3, và isoflavones (phytoestrogens)

Protease inhibitors: có khả năng ngăn ngừa sự tác động của một số gene di truyền

gây nên chứng ung thư Nó cũng bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi trườngsống xung quanh như tia nắng mặt trời và các chất ô nhiễm trong không khí Tuynhiên, protease inhibitors bị mất bớt đi sau khi đậu nành được chế biến qua phươngpháp làm nóng

Phytates: là một hợp thể phosphorus và inositol, có khả năng ngăn cản tiến trình

gây bệnh ung thư kết tràng và ung thư vú Ngoài ra nó còn có khả năng tiêu diệtnhững tế bào bị ung thư và phục hồi những tế bào bị hư hại

Phytosterols: có khả năng phòng ngừa các bệnh về tim mạch bằng cách kiểm soát

lượng cholesterol trong máu, đồng thời nó cũng có khả năng làm giảm thiểu sự pháttriển các bướu ung thư kết tràng và chống ung thư da

Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa để bảo vệ tế bào cơ thể khỏi các tác

hại của các gốc tự do Nó cũng có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thưkết tràng và làm giảm lượng cholesterol trong máu

Acid Phenolic: là một dược chất hóa học chống oxy hóa và phòng ngừa các DNA bị

tế bào ung thư tấn công

Lecithin: là một hóa chất thực vật quan trọng, đóng vai trò quyết định trong việc

kích thích sự biến dưỡng ở khắp các tế bào cơ thể Có khả năng làm gia tăng trí nhớbằng cách nuôi dưỡng tốt các tế bào não và thần kinh, làm chắc các tuyến, tái tạo các

mô tế bào cơ thể, có khả năng cải thiện hệ thống tuần hoàn, bổ xương, và tăngcường sức đề kháng

Acid béo omega-3: là loại chất béo không bão hòa có khả năng làm giảm lượng

cholesterol xấu LDL đồng thời làm tăng lượng cholesterol tốt HDL trong máu Acidbéo omega-3 còn gọi là alpha-linolenic acid gồm 2 thứ EPA và DHA cũng có trongmột vài loại cá biển và trong cá sống ở những vùng nước nóng

Isoflavones (phytoestrogens): là một hóa chất thực vật tương tự hormone sinh dục

nữ và hoạt động giống estrogen, có khả năng chống lại các tác nhân gây nên chứngung thư liên hệ đến hormone

1.2 Tổng quan về bã đậu nành okara

1.2.1 Giới thiệu

Bã đậu nành (tên tiếng Nhật là okara và

“okara” đã trở thành thuật ngữ quốc tế

để gọi bã đậu nành) còn gọi là pulp” (sẽ gọi tắt là okara) là phần bã vàcác chất dinh dưỡng khác không tantrong nước còn lại sau khi đã tách khỏidịch các chất tan hoặc huyền phù trongnước của công nghiệp sản xuất sữa đậunành hay đậu hũ [7] [10]

“soy-Hình 1.2 Okara dạng bột

Okara là thứ bã màu trắng hay trắng ngà, thường nằm trên mặt lưới lọc sữa đậunành, sau sấy khô có màu vàng, chứa một lượng lớn protein, carbohydrate, lipid, có

cả calci, sắt, riboflavin [10]

1.2.2 Tình sử dụng và nghiên cứu bột okara ngoài nước:

-Ở Mỹ, theo FAO, 2003, sản lượng đậu nành hàng năm khoảng 67 triệu tấn Bã đậunành chủ yếu được sử dụng cho chăn nuôi, làm phân bón và đốt

-Ở Nhật (Ohno và cộng sự; 1993), sản lượng bã đậu nành khoảng 700.000 tấn/ năm.Theo quy trình sản xuất sữa đậu nành, cứ 1 kg hạt đậu nành thải ra 1,1kg bã tươi.Tuy nhiên, phần lớn thợ làm đậu hũ ở Nhật thường bỏ okara hoặc thải cho trại nuôiheo Ở Thụy Sĩ, okara được dùng nuôi bò [25]

Okara tươi, mới, có thể được dùng ngay hay có thể giữ 2-3 ngày trong tủ lạnh hoặchơn 4-5 tháng nếu đông lạnh

Bột okara khô có giá trị ở Nhật, Châu Á nhờ lợi ích về dinh dưỡng của nó Okaratươi hoặc khô đã được nghiên cứu ở Nhật bằng cách cấy nấm bào ngư và vi khuẩn

Bacillus subtilis để thuỷ phân các hợp chất khó tiêu hoá sau đó sản phẩm được dùng

để chế biến nhiều loại thức ăn mềm, mịn với nước hoặc sữa, nấu cháo với cácnguyên liệu khác như bột bắp, lúa mạch hay làm salad, bánh mì [25]

1.2.3 Tình sử dụng và nghiên cứu bột okara trong nước:

 Theo các thông tin của công ty sữa Việt Nam (Vinamilk) cung cấp cho Viện Sinhhọc Nhiệt đới thì ở nước ngoài, có khi giá của bột okara không thấp hơn nhiều sovới giá của đậu nành hạt do hàm lượng dinh dưỡng của nó khá cao Còn ở nước tatại công ty Sữa Việt Nam, nơi có công nghệ sản xuất sữa đậu nành tận thu bột okarahiện đại của nước ngoài thì okara có thành phần như sau [28]:

Okara dạng ướt có hàm ẩm: 17,76%, xơ: 1,75%, béo 11,26%, đạm 35,23%

Okara dạng bột có hàm ẩm: 6,7%, béo: 10,59%, xơ: 7,99% và đạm: 36,43%

- Thời điểm cuối năm 2006, lượng okara do Vinamilk sản xuất (có hàm lượng đạm39,5% và xơ thô 8,36%) trên dây chuyền thiết bị hiện đại của nước ngoài (có côngsuất khoảng 10 tấn/giờ) mới chỉ dùng làm thức ăn thô cho chăn nuôi [9]

- Tại công ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa 1 lần chỉ thu đượckhoảng 50% protein của hạt đậu nành (ở nước ngoài lọc 2 lần sẽ thu được khoảng 65

– 70%) Từ 1kg đậu nành thu được 1,5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm), chứa khoảng20% chất khô Bã ướt là dạng phế liệu cuối cùng của công nghệ sản xuất sữa đậunành và hiện nay mới chỉ được sử dụng cho chăn nuôi [12]

 Cho tới vài năm gần đây chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về okara và tất cảtập trung tại TP.Hồ Chí Minh Vũ Văn Độ và các cộng tác viên nghiên cứu dùngnấm sợi của các loại nấm lớn (Linh chi - Ganoderma lucidum, Bào ngư- Pleurotusflorida) xử lý okara để chế biến bánh bistcuit, trà túi lọc Lê Chiến Phương và cáccộng tác viên (2004) [17] xử lý okara bằng nấm mốc Mucor và vi khuẩn lactic NgôĐại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay Lại Mai Hương vàcác cộng tác viên dùng enzyme kết hợp với phương pháp cơ học xử lý cellulosetrong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ sung vô một số thực phẩm [10].Chưa có sản phẩm nào trong số các sản phẩm nêu trên được triển khai sản xuất thử ởquy mô công nghiệp

Điều này cho thấy ở Việt Nam ngay cả nơi có sản xuất okara ở quy mô công nghiệp,hiện đại như công ty sữa Việt Nam, loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa đượctận dụng có hiệu quả vào các mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi

1.2.4 Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g) [10] [32]

Bảng 1.4 Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g)

Nhận xét: Trong okara thành phần protein chiếm với lượng cao so với các thành

phần khác 3,22g Ngoài protein ra thì trong okara chứa gần như đầy đủ các khoángchất và vitamin, điều đó cho thấy tuy chỉ là phụ phẩm nhưng okara vẫn tồn tại nhiềuthành phần dinh dưỡng cần thiết cho con người nên việc tận dụng nguồn phu phẩmnày là một việc quan trọng mang lại lợi nhuận kinh tế cao

 Chất xơ trong bã đậu nành [26] [27]

Trong bã đậu nành hàm lượng xơ không tan chiếm đa số, các xơ tan thì chiếm vớihàm lượng thấp bao gồm các thành phần sau:

• Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được cấu tạo bởi

các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose.Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước lạnh), tan trong acid vàkiềm Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose cònkhi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo nên disaccharidecellobiose.Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì không tiêuhóa được ở ống tiêu hóa Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ dàng cellulose vì trongruột của chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme cellulase là enzymethủy phân cellulose

Hình 1.3 Cellulose

• Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước, chỉ tan được

trong dung dịch kiềm Hemicellulose cũng là thành phần của thành tế bào thực vật

và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu Khi thủy phânhemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose,galactose) và nhóm pentose (như arabinose, xilose) Trong thiên nhiên, loạihemicellulose dễ gặp nhất là xylan Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ…

Hình 1.4 Hemicellulose

Xơ tan [26] [27]: gồm pectin, β-glucan, galactose, mannan, gum… Chất xơ hòa tan

khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinhdưỡng vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa

• Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây Trong thực vật, pectin

tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan (tồn tại chủ yếu ở thành tế bào) vàdạng hòa tan của pectin (tồn tại ở dịch tế bào) Dưới tác dụng của acid, enzymeprotopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan Đặctính quan trọng của pectin là khi có mặt acid và đường, nó có khả năng tạo thànhchất gel, vì vậy nó được ứng dụng rộng rãi trong kỹ nghệ sản xuất mứt kẹo

Hình 1.5 Pectin

Công dụng của chất xơ hoà tan [27]: vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã đưa

ra bằng chứng về những tác dụng đáng kể của chất xơ trong việc phòng và chữabệnh, ngoài một vài tác dụng đã biết đến từ rất lâu Tác dụng phòng và điều trị củachất xơ chủ yếu tập trung vào các chứng bệnh mạn tính gắn với tuổi già:

- Phòng ngừa táo bón: do có đặc tính hút nước, chất xơ không hòa tan trương lên khi

ở trong ruột, làm nở và mềm khối phân, kích thích thành ruột, tăng nhu động ruộtkhiến việc đẩy phân ra ngoài dễ dàng hơn Tác dụng này được coi là một tác dụngkinh điển của chất xơ Ngoài ra, chất xơ có tác dụng hấp phụ các chất độc có trong

hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch của hệ thống này, tăng cường hoạt động của hệ

vi khuẩn đường ruột nên giảm được nguy cơ nhiễm trùng đường tiêu hóa, nhất làbệnh tiêu chảy

- Phòng ngừa bệnh ung thư: các chuyên gia về ung thư học của Mỹ đã khẳng địnhrằng: chất xơ có tác dụng rất mạnh trong việc phòng ung thư đường tiêu hóa mà đặcbiệt là ung thư đại tràng Nó làm tăng khả năng miễn dịch của hệ thống tiêu hóa,khuyến khích hệ vi khuẩn hữu ích trong ruột phát triển Chính hệ vi khuẩn này đãtác động thường xuyên lên thành ruột, hạn chế sự phân chia bất thường của các tếbào, kìm hãm sự phát sinh, phát triển các túi nang bất thường trên thành ruột Hơnnữa, khi ở trong ruột, chất xơ còn tạo môi trường có tính khử cao, chống lại các chấtoxy hóa, chất độc phát sinh trong quá trình chuyển hóa thức ăn ở đại tràng

Các chất xơ hòa tan giữ vai trò trong chuyển hóa lipid, glucid và lipoprotein Vì thế,

nó làm giảm thời gian thức ăn tồn đọng trong hệ tiêu hóa, giúp hệ thống này ít phảichịu sức ép của thức ăn về góc độ khối lượng cũng như sinh hóa

Chất xơ còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ Với những phụ nữ

có chế độ ăn nhiều chất xơ, ít chất béo và đạm thì nguy cơ ung thư vú có liên quanđến oestrogen giảm đáng kể Ở những trẻ em gái có chế độ ăn như vậy, tuổi xuấthiện kinh nguyệt cũng muộn hơn và vì thế sẽ ít bị ung thư vú hơn khi trưởng thành

- Giảm mỡ máu: khi các chất xơ không hòa tan hút nước, chúng giữ luôn một phầnmuối mật nên kích thích cơ thể tăng cường sản xuất muối mật để bù vào lượng thiếuhụt, vì thế mà tăng sử dụng cholesterol Lượng cholesterol tích lũy sẽ giảm đi kéo

theo lượng cholesterol trong máu cũng giảm Còn các chất xơ hòa tan tác động lênquá trình chuyển hóa lipid nên giảm nguy cơ xơ vữa động mạch Các chuyên giakhuyên rằng những người bị tăng cholesterol máu nên tăng lượng chất xơ trong khẩuphần hằng ngày

- Phòng ngừa và điều trị tiểu đường: chất xơ làm hạn chế tăng đường huyết sau khi

ăn (nhất là các chất xơ hòa tan) do có khả năng tăng tính nhạy cảm của insulin Nótham gia chuyển hóa triglycerid nên giúp kiểm soát nồng độ đường trong máu mộtcách hiệu quả Đường sẽ được giải phóng từ từ vào máu, duy trì được nồng độđường/máu một cách ổn định Đây chính là mục đích của việc phòng ngừa và kiểmsoát bệnh tiểu đường

- Chống béo phì: chất xơ không có giá trị dinh dưỡng nên chỉ tạo cảm giác no màkhông tăng lượng calo cho cơ thể Vì thế, nó rất lợi cho những người bị béo phì Mặtkhác, do chất xơ có thể hạn chế và kiểm soát lượng đường trong máu nên không tạo

ra tình trạng thừa đường để chuyển hóa thành mỡ dự trữ Ngay trong quá trình tiêuhóa thức ăn, cả chất xơ hòa tan và không hòa tan đều làm tăng tốc độ vận chuyểnthức ăn trong ruột, hạn chế được sự hấp thu các chất dinh dưỡng nên cũng hạn chếtăng cân

- Điều trị sỏi mật: khi kết hợp với acid mật, các chất xơ tự nhiên ngăn chặn nguy cơtạo ra sỏi mật Chất xơ quan trọng như vậy nhưng vẫn ngày càng giảm đi trong khẩuphần ăn hằng ngày Theo một khảo sát gần đây, lượng chất xơ trong khẩu phần ăncủa chúng ta hiện nay chỉ bằng 40-50% so với 30 năm trước Điều này có thể đượcgiải thích là do sự phổ biến loại thực phẩm tinh chế (đã bị loại bỏ gần hết chất xơ).Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc các cănbệnh của xã hội hiện đại như ung thư, tim mạch, tiểu đường Với người Việt Nam,

để có đủ chất xơ trong một ngày, mỗi người cần ăn tối thiểu 300 g rau xanh và 100gquả tươi

1.2.5 Quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành [23]

Hình 1.6 Sơ đồ quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành

1.3 Tổng quan về Linh chi [4]

1.3.1 Hệ thống phân loại

Ngành: Mycota

Ngành phụ:

Basidiomycota Lớp: Hymenomycetes Bộ: Aphyllophorales Họ: Ganodermataceae Giống: Ganoderma Loài: Ganoderma lucidum

Hình 1.7 Nấm Linh Chi

1.3.2 Đặc tính sinh học của nấm Linh chi

Nấm Linh chi đã nổi tiếng từ ngàn xưa ở các nước Á Đông, phiên âm theo tiếngTrung Quốc gọi là Lingzhi, theo tiếng Nhật là reishi, ở Việt Nam thì hay gọi là nấmLim Nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác như: Bất lão thảo, Vạn niên nhung,Mộc Linh chi… nhưng tên Linh chi có lẽ mang tính tiêu biểu và được sử dụng phổbiến hơn cả (tên Linh chi chính thức được sử dụng trong sách “Thần nông bản thảo”cách đây hơn 2000 năm)

Linh chi thường mọc ký sinh trên các cây gỗ trong nhiều năm Cây gỗ bộ Đậu(Fabales) là những cây chủ ưa thích của chúng, ta thường gặp Linh chi trên các câyLim, phượng vĩ, so đũa và một số loài cây khác đã chết, mục hoặc cả trên cây sốngnhư xoài, mít, mãng cầu, phi lao, dừa v.v…

Tính đa dạng của các loài Linh chi ở Việt Nam bộc lộ qua biến dị hình thái thể quả.Cuống thể quả biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡhàng 5-10cm hoặc rất dài 20-25cm Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm doquá trình liên tán mà thành Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xòe hình quạthoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ,màu vàng nâu – vàng cam - đỏ cam - đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, nhẵn bóng, lángnhư verni Sẫm màu dần khi già Kích thước tán biến động từ 2-30cm dày 0,8-2,5cm Thịt nấm dày từ 0,4-1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt - trắng Nấm mềm daikhi tươi, trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợiphình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ

và bao quanh cuống

 Vòng đời sinh sản của nấm Linh chi

Phần sinh sản là một lớp ống dày từ 0,2-1,7cm gồm các ống nhỏ, thẳng, miệng tròn,đảm mang 4 đảm bào tử hình trứng Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầmphồng căng hay lõm thụt vào mà thành Bào tử đảm có cấu trúc vỏ kép, lõm ở đầu,màu vàng mật ong sáng, kích thước 5-6 x 8,5-12µm

Hình 1.8 Chu trình sống của Linh chi

Các bào tử đảm đơn bội khi gặp điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo ra hệ sợi sơ cấp(primary hyphae) Hệ sợi sơ cấp đơn nhân đơn bội nhanh chóng phát triển, phối hợpvới nhau tạo ra hệ sợi thứ cấp hay còn gọi là hệ sợi song hạch, phân nhánh rất mạnhtràn ngập khắp giá thể Lúc này, thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tínhmàng dày dễ rụng và khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ cho ra hệ sợi song hạch tái sinh.Tiếp sau đó là giai đoạn phân hóa hệ sợi: các hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợicứng màng dài, ít phân nhánh bện kết lại thành cấu trúc bó được cố kết bởi các sợibện phân nhánh rất mạnh Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dàithành các trụ tròn mập Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe tán, lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện.Tán lớn dần hình thành bào tầng và phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm giàsẫm màu, khô tóp và lụi dần trong vòng 3-4 tháng

1.3.3 Thành phần dược tính của nấm Linh chi

Số lượng các chủng loài nấm Linh chi được sử dụng trong công nghệ dược liệu,dược phẩm ngày càng tăng và đó cũng là bí quyết của các quốc gia Á Đông Vàothập niên 70-80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi.Một số loài Linh chi đã được phân chất: Ganoderma applanatum, G.boninese,G.lucidum… với các nhóm hoạt chất steroid, triterpenoid, và polysaccharide

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV, IR… đặcbiệt là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP), đã được xác định chínhxác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi Có thể khái quát trong bảngsau:

Bảng 1.5 Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi [29]

Điều đáng lưu ý là các nhóm hoạt chất này gặp khá phổ biến trong cấu trúc nấm,trong thể mang bào tử, trong bào tử đảm và trong hệ sợi (Mycelia), trong nấm tựnhiên hoang dại và nuôi trồng chủ động.

1.3.4 Công dụng của nấm Linh chi [29]

+ Hạ bớt lượng đường trong máu của người bị tiểu đường (nhờ chất Ganoderan)nhất là tiểu đường type 2 (do cơ thể sản xuất insulin không đủ)

+ Tăng cường đào thải các chất phóng xạ nhiễm vào trong cơ thể Dùng uống kèmkhi xạ trị và hóa trị để giảm các triệu chứng xấu như đau đớn, rụng tóc

+ Ức chế sự tạo thành u bướu, ngăn ngừa ung thư

+ Điều hoà huyết áp, dưỡng tim lọc máu, chống tích mỡ trong mạch máu gây rabệnh tim, tai biến mạch máu não

+ Thanh tâm, êm dịu thần kinh giúp dễ ngủ, ăn ngon; chống dị ứng

+ Làm chậm quá trình lão hóa, tăng cường thể lực, giảm mệt mỏi

+ Chống độc: giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc vô cơ và hữu cơ do ăn uống,tiếp xúc, hít thở; các độc tố do ký sinh trùng, vi trùng gây bệnh trong cơ thể, cácbệnh suy gan, suy thận v.v

+ Kích thích quá trình phục hồi hệ miễn dịch (tăng cường tính thực bào, tiết rainterferon) làm tăng sức đề kháng (theo Cổ Đức Trọng) Đây là điểm quan trọngkhiến trên thế giới dùng Linh chi như là thực phẩm vì sức khỏe và được dùng kèmvới các loại thuốc trị bệnh Vì vậy nên dùng nấm ở những thời gian hay xảy ra dịchbệnh cảm cúm để nâng cao sức khỏe

1.3.5 Enzyme cellulase trong nấm Linh chi [13]

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật và chúng được thực vật tổng hợpvới số lượng nhiều nhất trong tự nhiên Cellulose cũng là một trong những chất hữu

cơ có trong tự nhiên chỉ bị vi sinh vật phân giải Thực hiện quá trình phân giải

cellulose trong điều kiện tự nhiên là các loại enzyme cellulase được các nhà khoahọc phân ra làm 2 nhóm chủ yếu đối với Linh chi:

1,4 D-glucanase 4 (EC.3.2.1.4): enzyme này tham gia phân giải liên kết

β-1,4 glucosid trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trìnhphân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Enzyme này còn có các tên khácnhư: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase

C-cellulase β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21):enzyme này phân

hủy cellobiose tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulosenguyên thủy Chúng còn được gọi là cellobiase và β-glucosidase

Trong vòng đời sinh sản của nấm Linh chi các nghiên cứu khoa học chứngminh cho thấy ở giai đoạn tạo sinh khối nấm sợi Linh chi thì enzyme cellulase cóhoạt tính cao nhất dao động trong khoảng 18-32 Đvht/1ml [29]

1.4 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

 Giống (Genus): Bacillus

 Loài : Bacillus amyloliquefaciens

Hình 1.9 Khuẩn lạc B amyloliquefaciens 1.4.2 Đặc điểm phân bố [6]

Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, pH acid – trung tính – kiềm.

Được tìm thấy tự nhiên trong đất và rác lá, có thể dễ dàng phát triển với số lượng

lớn Trong bột mì, B amyloliquefaciens chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo bào tử.

Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lênmen chua)… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinhhọc.

1.4.3 Đặc điểm hình thái [5] [7]

Là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10μm, thường xếp thành cặpm, thường xếp thành cặpđôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông Bào tử hình bầu dục có kíchthước 0,6 – 0,9μm, thường xếp thành cặpm, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc

gần tâm nhưng không chính tâm.

Hình 1.10 Hình nhuộm tế bào vi khuẩn B.amyloliquefaciens

Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao; về già,tiên mao rụng nên mất khả năng di động Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay cómàu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, cómép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch [5]

1.4.4 Cấu trúc [15] [16]

Các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các

đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao Bề mặt tế bào được cấutạo bởi các lớp giáp mạc, lớp bề mặt có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lótpeptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng tế bào

Hình 1.11 Cấu trúc và bề mặt vi khuẩn B.amyloliquefaciens

C=Capsule; S=S-layer; P=Peptidoglycan

S-layers

Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus Chức năng chưa được xácđịnh một cách rõ ràng, nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vikhuẩn

Giáp mạc (capsules)

Thành phần hóa học của lớp vỏ nhày ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau,thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cảpolypeptide, nhưng thành phần chủ yếu vẫn là nước (98%), có nhiệm vụ như mộthàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại quá trình khô

Vách tế bào

Vách tế bào rất mỏng (100-200Å) và trong suốt không màu Vách tế bào có tính chấtđàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao Thành phần hóa học chủyếu là glucid, một số chất béo, protide và các acid amin Thành phần hóa học thayđổi tùy loại vi khuẩn và môi trường sống

1.4.5 Sự hình thành bào tử [6]

Sự hình thành bào tử: một số vi khuẩn vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển sẽ sinh

ra bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào

tử hay nội bào tử Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng

áp suất thẩm thấu Trong thời kỳ nghỉ, không thấy bào tử vi khuẩn thể hiện bất kỳmột hoạt lực trao đổi chất nào cả Người ta gọi đó là trạng thái sống ẩn Bào tử cóthể giữ sức sống từ vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì

sức sống 200-300 năm của bào tử vi khuẩn B.amyloliquefaciens Một trong những đặc điểm quan trọng của B.amyloliquefaciens là khả năng tạo bào tử trong những

điều kiện nhất định

Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện cạn kiệt thức ăn hoặc có tích lũy các sảnphẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử Về mặthình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các giai đoạn:

 Hình thành những búi chất nhiễm sắc

 Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử

 Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ

 Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũynhiều PG và tổng hợp DPA, tích lũy canxi Tính chiết quang tăng cao

 Kết thúc việc hình thành áo bào tử

 Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bắt đầu có tính kháng nhiệt

 Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài

1.4.6 Hệ enzyme protease của B amyloliquefaciens [13][11]

B amyloliquefaciens được nuôi trên môi trường lỏng để kích thích việc sinh tổng

hợp enzyme protease (trung tính và kiềm) Điều kiện tối ưu cho việc sinh tổngenzyme protease là : nồng độ cơ chất: 0,5%, thời gian ủ: 30 giờ, nhiệt độ ủ: 40oC,pH: 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, môi trường dinh dưỡng: nước chiết thịt bò có

bổ sung muối, nguồn C: lactose, nguồn N: (NH4)2SO4, nguồn acid amin: valine Môi

trường dinh dưỡng này rất khắc nghiệt với vi khuẩn B.A vì thế muốn tồn tại và phát triển bắt buộc vi khuẩn B.A phải tiết ra enzyme protease để thuỷ phân protein thành

các acid amin cung cấp cho sự phát triển của chúng

Các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic, acid citric ở các nồng độ khác nhau cóthể làm giảm khả năng sinh tổng hợp protease Enzyme protease được tinh sạchbằng muối (NH4)2SO4 và màng lọc sephadex G200 [4] [11]

Điều kiện để hoạt tính enzyme protease đạt cực đại là: pH 7, dung dịch đệm: đệmphosphate, thời gian ủ: 24 giờ, nhiệt độ ủ: 35oC, B amyloliquefaciens tổng hợp

protease ngoại bào (exoprotease) phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác

có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dànghấp thụ

1.4.7 Công dụng của B.amyloliquefaciens [24] [11]

- Không có tác dụng gây hại cho sức khỏe con người theo nghiên cứu của viện

sinh học nhiệt đới thì vi khuẩn B.A và B.subtilis là lợi khuẩn chúng có khả

năng tiết ra enzyme amylase và protease thuỷ phân tinh bột, protein không tan,ngoài ra chúng không sản sinh ra chất độc nguy hiểm cho con người [11] [17]

- Tạo kháng sinh: eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại vi trùnggây bệnh

- Các enzyme thủy phân protein được tìm thấy ở khắp nơi, trong tất cả các sinhvật sống, quan trọng cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào Mặc dù có nhiềuloài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng chỉ có vài loài sinhtổng hợp được enzyme protease có giá trị thương mại, trong đó

B.amyloliquefaciens có vai trò nổi bật trong các ngành công nghiệp khác nhau

như thực phẩm, sữa, dược, dệt Protease là một trong những nhóm enzymecông nghiệp quan trọng nhất, chiếm gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra,được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa khô, sản xuất các loại thuốctiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do tác nhân virus

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

 Bã đậu nành ( Okara), mua tại công ty sữa Vinamilk

 Giống nấm Linh chi, được cung cấp từ Phòng công nghệ biến đổi sinh học củaViện Sinh Học Nhiệt Đới

 Vi khuẩn B.amyloliquefaciens được cung cấp từ Phòng công nghệ biến đổi sinh

học và phòng vi sinh của Viện Sinh Học Nhiệt Đới

 Isomalt được mua tại công ty BRENNTAG, 202 Hoàng Văn Thụ, Phường 9, Q.Phú Nhuận, Tp.HCM

 Môi trường PGA

 Môi trường nhân giống vi khuẩn sữa đậu nành bổ sung 1% glucose

2.3 Sơ đồ nghiên cứu vi sinh vật

2.3.1 Nghiên cứu hình thái và đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.

amyloliquefaciens

Nghiên cứu vi khuẩn B.A bao gồm: hình thái, sinh lý và định tính hoạt tính enzymeprotease