Phân tích đánh gias chất lượng thực phẩm (7)

3/6/2011 Q trình chọn lọc tự nhiên CHƯƠNG VII CƠNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT Kỹ thuật tái tổ hợp DNA • Giải đ ợc vấn đề ch ơng trình tạo giống cổ điển • Nhờ xác định dịng hóa gene chun biệt cho tính trạng mong muốn VD: tính trạng chịu rét, chịu mặn, kháng thuốc diệt cỏ, chín chậm, … • Trao đổi vật liệu di truyền  tạo tính trạng mong muốn  gia tăng sản l ợng trồng • Tính trạng đ ợc tạo từ dịng hữu thụ • Khơng loại trừ đ ợc tính trạng khơng mong muốn Kỹ thuật tái tổ hợp DNA • Mục đích thay đổi di truyền • Nguồn, ch c khả tiếp hợp bền vững c a gene chuyển • Phân tích thành phần thực phẩm (hàm l ợng dinh d ỡng, độc tố tích lũy,…) Overview genetic engineering Kỹ thuật tái tổ hợp DNA • Cây trồng chuyển gene th ơng mại đầu tiên: FLAVRSAVR tomato (Calgene Inc ) • c chế gene tạo enzyme polygalacturonase (PG) phân h y pectin nhờ chuyển antisense gene Dịng hóa gene đích • Nguồn gene đích DNA nhiễm sắc thể hay cDNA từ mRNA • Enzyme cơng cụ • Vector tạo dịng 3/6/2011 Các enzyme cơng cụ • Restriction enzymes (Enzyme cắt giới hạn) • Ligase (Enzyme nối) Các vector tạo dịng Cho trình tự DNA: 5’… CCTAGATCTTTAACC…TAGATCTAA…3’ 3’…GGATCTAGAAATTGG…ATCTAGATT…5’ A) Xử lý DNA với enzyme giới hạn BgIII (A/GATCT) Sẽ thu đ ợc đoạn DNA tr ờng hợp DNA cho mạch thẳng mạch vòng Vẽ đoạn DNA đ ợc phóng thích (nếu có) B) Có thể xen đoạn DNA đ ợc phóng thích vào vector đ ợc cắt enzyme BamHI (G/GATCC) hay không? Vẽ hình minh họa  Phage λ: • DNA sợi đơi thẳng • Kích th ớc: 48,5 kb • Chèn DNA có kích th ớc 18-25 kb Electron micrograph of bacterial phage from the host E coli Các vector tạo dòng  Phage M13: • DNA sợi đơn vịng • Kích th ớc: 6,4 kb • Nhiều dạng biến đổi c a M13 có mang polylinker (hay MCS) Các vector tạo dịng  Plasmid: • DNA vịng sợi kép, nằm ngồi NST VK • Chèn DNA có kích th ớc 18-25 kb pBR322 pBR322 pBR322 4361 4361 bp bp 3/6/2011 Các vector tạo dịng  Cosmid: • Là vector plasmid ch a gene cos c a phage λ Tái giống plasmid • Chèn đ ợc đoạn DNA lớn (35-45 kb) Các vector tạo dịng  Phagemid: • Là kết hợp phage M13 với plasmid Tạo plasmid tái tổ hợp Xây dựng DNA library • Việc lựa chọn DNA hay cDNA phụ thuộc vào tính trạng mong muốn chuyên biệt vào hệ ph ơng pháp • Tập hợp đoạn DNA hay cDNA đ ợc gắn vào vector thích hợp (plasmid hay phage) • Chuyển vector vào vi khuẩn để nhân số l ợng chọn lọc  DNA library Sàng lọc gene mục tiêu Chọn lọc: • Vector mang gene kháng kháng sinh (tetracyclin, penicillin hay ampicillin) • Chỉ có dịng ch a vector sống đ ợc môi tr ờng chọn lọc có ch a chất kháng sinh Xây dựng DNA library Sàng lọc gene mục tiêu Sàng lọc: • Gene lacZ’ sản xuất β-galactosidase th y giải X-gal tạo sản phẩm có màu xanh lam • Nếu có DNA gắn xen vào lacZ’  khả th y phân X-gal  khuẩn lạc khơng có màu xanh 3/6/2011 Sàng lọc gene mục tiêu Xác định gene đích: • Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc • Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến tính DNA có ch a probe đánh dấu phóng xạ • Tìm vết phóng xạ • So sánh với đĩa Petri ban đầu Xây dựng DNA library Screening DNA library Chuyển gene gián tiếp nhờ Các ph ơng pháp chuyển gene: • Gián tiếp qua Agrobacterium • Trực tiếp: PEG, xung điện, bắn gene Agrobacterium • Agrobacterium sống lân cận hay rễ  xuyên qua vết th ơng  tổ ch c tế bào thực vật phát sinh b ớu 3/6/2011 Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Tác nhân gây tạo b ớu Plasmid Ti c a vi khuẩn Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Loại bỏ gen gây khối u gen mã hoá opine c a T-DNA thay vào marker chọn lọc Gen chuyển đ ợc xen vào vùng bờ c a T-DNA Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Gene tạo b ớu nằm đoạn T-DNA • Sự di chuyển c a T-DNA vào tế bào thực vật chịu quy định c a gene vir Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Khi DNA vi khuẩn đ ợc hợp với nhiễm sắc thể thực vật, cơng vào hệ thống tổ ch c c a tế bào cách có hiệu sử dụng để đảm bảo cho sinh sôi c a quần thể vi khuẩn Chuẩn bị Agrobacterium mang plasmid Ti ch a gene đích: • Sàng lọc E.coli ch a gene đích • Tiếp hợp E.coli Agrobacterium • Tái tổ hợp t ơng đồng plasmid 3/6/2011 Quy trình chuyển gene nhờ Agrobacterium • • • • • Chuẩn bị mô cấy dịch huyền phù VK Ngâm chung mô với vi khuẩn Nuôi chung mô với vi khuẩn (2 ngày) Rửa mô dung dịch kháng sinh Cấy chuyền mơ sang mơi tr ờng có tác nhân chọn lọc • Tái sinh chuyển gene Một vài yếu tố ảnh h ởng đến hiệu biến nạp • Loại mơ đ ợc biến nạp • Giai đoạn phát triển c a mơ • M c độ khởi đầu c a vi khuẩn A tumefaciens sử dụng • Mơi tr ờng để nuôi cấy mô sau biến nạp • Marker đ ợc sử dụng để chọn lọc thể biến nạp • Loại vector sử dụng • Kiểu gen c a thực vật Các ph ơng pháp chuyển gene: • Gián tiếp qua Agrobacterium • Trực tiếp: PEG, xung điện, bắn gene Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium có hiệu số lồi nh ng khơng phải tất thực vật đ ợc biến nạp đ ờng • Ðặc biệt, lớp mầm bao gồm ngũ cốc giới nh lúa, lúa mì ngơ không đ ợc biến nạp dễ dàng nhờ A tumefaciens • Để DNA dễ xâm nhập đ ợc vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast  Chuyển gene trực tiếp chế vật lý đơn giản, khơng cần có vector • Để nâng cao hiệu biến nạp, xử lý protoplast với PEG dùng xung điện 3/6/2011 Chuyển gene xung điện • Là ph ơng pháp học • Màng tế bào không cho phân tử phân cực nh DNA tự qua Chuyển gene xung điện • B1: Các tế bào ch DNA ngoại lai đ ợc tạo thành dịch huyền phù cho vào cuvette nhựa có điện cực • CT1 đóng: tụ điện nạp điện tích điện áp cao • CT2 đóng: điện áp phóng qua dịch huyền phù tế bào • Kỹ thuật xung điện dựa trạng thái t ơng đối yếu c a t ơng tác kỵ n ớc c a phospholipid kép khả tập hợp lại cách tự động c a sau bị rối loạn  Xung điện chớp nhống gây rối loạn vị trí c a màng cách thời, làm cho phân tử phân cực qua nh ng sau màng đóng kín lại nhanh chóng tế bào khơng bị ảnh h ởng Chuyển gene xung điện • B2: Tạo xung điện máy xung gene (gene pulser) Chuyển gene xung điện • Xung điện cần thiết: 200 - 600 v/cm2 (thay đổi tùy theo kích th ớc c a tế bào) vài phần triệu giây đến phần ngàn giây  tạo lỗ tạm thời • Các phân tử đ ợc nạp điện qua màng tế bào thông qua lỗ cách th c t ơng tự nh điện di 3/6/2011 u điểm • Với số mầm quan trọng (lồi lúa phụ Japonica, ngơ, lúa mì) mà khơng thể thể thực đ ợc ph ơng pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium ng ời ta thành công với ph ơng pháp Hiệu biến nạp cao • Ðoạn DNA ngoại lai đ ợc biến nạp có kích th ớc lớn Nh ợc điểm • Nếu xung điện có c ờng độ chiều dài khơng số lỗ c a tế bào trở nên lớn bị hỏng khơng thể đóng lại sau tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn th ơng bị th ng Nh ợc điểm • Phải tạo protoplast, tái sinh protoplast không đơn giản, tốn nhiều công s c, bị ảnh h ởng c a nhiều yếu tố môi tr ờng Nh ợc điểm • Một hạn chế vận chuyển DNA ngoại lai vào khỏi tế bào suốt thời gian điện biến nạp t ơng đối không đặc hiệu Điều dẫn đến kết không cân ion mà sau làm rối loạn ch c c a tế bào tế bào chết Chuyển gene PEG • PEG tạo lỗ tạm thời màng tế bào  giúp DNA thấm vào tế bào • Tần số chuyển gene ph ơng pháp khơng cao • PEG cịn gây kết dính tế bào trần  ảnh h ởng đến tỉ lệ sống c a tế bào 3/6/2011 Các ph ơng pháp chuyển gene: • Gián tiếp qua Agrobacterium • Trực tiếp: PEG, xung điện, bắn gene Chuyển gene súng bắn gene • Gồm buồng thép không gỉ nối với bơm chân không Chuyển gene súng bắn gene • Tên xác: hệ thống phân phối hạt biolistic (biolistic particle delivery system; biolistics = biology + ballistics) • Là thiết bị sử dụng để đ a thông tin di truyền vào tế bào, đ ợc thiết kế cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật Chuyển gene súng bắn gene • Nguyên lý chung c a ph ơng pháp sử dụng áp lực xung c a khí helium để gia tốc hạt • Ðạn sử dụng cho loại súng hạt kim loại nặng đ ợc bao bọc DNA Chuyển gene súng bắn gene • DNA đ ợc gắn vào hạt tungsten (vàng, bạc) có đ ờng kính khoảng 1μm • Các hạt đ ợc đặt bên đĩa mặt bên c a súng • Sự bùng nổ khí 1000psi làm cho đĩa bắn phía tr ớc • Một chắn làm dừng đĩa lại hạt tungsten đ ợc phóng tế bào đích 3/6/2011 Chuyển gene súng bắn gene • Mục tiêu c a súng bắn gene th ờng callus ni đĩa petri • Khi hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel callus bị phá h y nhiều nh ng có số tế bào tiếp nhận hạt tungsten đ ợc bao bọc DNA  DNA xâm nhập hợp vào NST u điểm • Thao tác dễ dàng • Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế bào, mơ • Các tế bào đ ợc biến nạp có tỉ lệ sống sót cao • Cho phép đ a gene vào tế bào vị trí mong muốn Xác nhận gene chuyển (nhờ reporter gene) • Gene mã hóa β-glucuronidase (GUS) phân giải X-glucuronide (X-gluc) reporter gene hữu hiệu • Mơ thực vật đ ợc chuyển gene có màu xanh 10 3/6/2011 Ph ơng pháp phát • Khi gene đ ợc dịng hóa chuyển tế bào ch , cần phải xác nhận xem gene lạ có đ ợc sát nhập vào NST vật ch hay khơng • Có thể sử dụng ph ơng pháp Southern blot hay Northern blot Ph ơng pháp Southern blot • DNA đ ợc cắt hay vài restriction enzyme  tạo phân đoạn DNA • Tách phân đoạn DNA nhờ điện di gel agarose • DNA gel đ ợc biến tính tạo mạch đơn • Chuyển lên màng nitrocellulose nhờ lực mao dẫn Ph ơng pháp Northern blot • T ơng tự nh Southern blot • Sử dụng mRNA thay DNA • mRNA mạch đơn  khơng cắt restriction enzyme • Probe cDNA bổ sung với mRNA c a gene đ ợc chèn Ph ơng pháp Southern blot • DNA đ ợc gắn lên màng c a DNA gel • Lai với probe có đánh dấu phóng xạ có trình tự bổ sung với DNA ngoại lai • Loại bỏ probe khơng gắn lên màng • Xác nhận diện c a DNA ngoại lai đ ợc chuyển gene • Điểm bất lợi lớn c a tất ph ơng pháp chuyển gene trực tiếp DNA ngoại lai có xu h ớng tái xếp, tái tổ hợp dẫn tới t ợng sát nhập nhiều đoạn DNA tái xếp đoạn gene chuyển • Những cụm gene dễ dẫn đến t ợng tái tổ hợp nội  transgene silencing  Sử dụng vật liệu chuyển gene trực tiếp đoạn DNA 11 3/6/2011 Nghiên c u chuyển gene giới • Chuyển gene chịu mặn từ loài Đ ớc (Rhizophoraceae) vào lúa • Chuyển gene Bt vào nhiều loại trồng nh lúa, bông, ngô, đậu t ơng,… • Chuyển gene tham gia vào trình quang hợp c a C4 vào C3 để tăng hiệu suất quang hợp • Chuyển gene cố định đạm (nif gene) vào lúa Nghiên c u chuyển gene giới • Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ vào lúa • Chuyển gene chín chậm (ripening delay gene) vào cà chua • Chuyển gene mang nhiều đặc tính chữa bệnh có tác dụng làm d ợc phẩm: gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp vitamin A,…  Tăng suất trồng, tăng chất l ợng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi tr ờng Chuyển gene kháng sâu đục thân vào lúa Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Karabi Datta, Swapan Kumar Datta (Viện sinh học nhiệt đới, Viện lúa Quốc tế) Một số nghiên c u chuyển gene Việt Nam • Vật liệu: giống lúa Nàng H ơng Chợ Đào • Mơi tr ờng ni cấy mơ lúa: MS có bổ sung 2,4-D (tạo mô sẹo) NAA, Kinetin (tái sinh cây) • Ch ng VK Agrobacterium tumerfasiens: LBA4404 mang plasmid pBIN-BARUBI-IB-AB mang gene Bt tổng hợp cryIA cryIB, gene Bar 12 3/6/2011 • Chuẩn bị dịch vi khuẩn: trì vi khuẩn mơi tr ờng thạch LB có ch a 50 mg/l Kanamycin 50 mg/l Rifampicin Tăng sinh mơi tr ờng AB lỏng lắc có chất kháng sinh tr ớc gây nhiễm cho tế bào lúa • Chuẩn bị vật liệu chuyển gene: hạt lúa khử trùng đ ợc nuôi cấy môi tr ờng MS có bổ sung mg/l 2,4-D  mơ sẹo có khả phát sinh phơi • Gây nhiễm: mơ sẹo có khả phát sinh phơi đ ợc gây nhiễm với dịch vi khuẩn (OD=2) có ch a Acetosyringone • Chọn lọc: cụm mơ đ ợc rửa lại n ớc cất vơ trùng có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime  Nuôi cấy môi tr ờng chọn lọc có Phosphinothricin (3 mg/l)  Cấy chuyền mơ kháng PPT sang môi tr ờng chọn lọc từ 3-4 lần • Tái sinh cây: mơi tr ờng MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có khơng có PPT • Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau chạy điện di gel agarose • Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA • Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát protein cryIAb/cryIAc • Tái sinh cây: mơi tr ờng MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có khơng có PPT • Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau chạy điện di gel agarose • Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA • Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát protein cryIAb/cryIAc • Thí nghiệm Southern blot: sử dụng enzyme giới hạn Hind III gen cryIA(b)-cryIB, enzyme Sma I gen bar • Thử tính kháng thuốc diệt cỏ th ơng mại Basta: theo dõi t ợng cháy • Thử tính kháng sâu: Cắt đốt thân (8 cm) cho vào đĩa petri, đặt sâu đục thân lên đoạn thân  tính tỉ lệ số sâu chết + số sâu thất lạc / tổng số sâu cho vào đĩa 13 ... không cho phân tử phân cực nh DNA tự qua Chuyển gene xung điện • B1: Các tế bào ch DNA ngoại lai đ ợc tạo thành dịch huyền phù cho vào cuvette nhựa có điện cực • CT1 đóng: tụ điện nạp điện tích điện... mang nhiều đặc tính chữa bệnh có tác dụng làm d ợc phẩm: gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp vitamin A,…  Tăng suất trồng, tăng chất l ợng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi tr ờng Chuyển gene kháng... Sự di chuyển c a T-DNA vào tế bào thực vật chịu quy định c a gene vir Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Khi DNA vi khuẩn đ ợc hợp với nhiễm sắc thể thực vật, cơng vào hệ thống tổ ch c