3/6/2011 CH NG V CÔNG NGH NUÔI CẤY T BÀO TR N Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (Protoplast) = tế bào đơn – vách ng dụng tế bào trần • Có khả tiếp nhận vật liệu “ngoại lai”: nhân, ti thể, lục lạp, plasmids, vi khuẩn virus • Có khả tái sinh vách tế bào Đ i tượng lai tạo gi ng: lai loài, lai khác loài, lai khác giới sinh vật ng dụng tế bào trần • Nghiên c u tổng hợp phân h y vách tế bào • Nghiên c u hệ th ng tế bào đơn Nuôi cấy tế bào trần 1) 2) 3) 4) 5) 6) Chọn lựa khử trùng mẫu cấy; Xử lý enzyme tạo tế bào trần; Tách tế bào trần; Xác định mật độ tế bào trần; (Dung hợp tế bào trần) Nuôi cấy tái sinh tế bào trần 3/6/2011 2) Xử lý enzyme 1) Chọn khử trùng mẫu cấy Khử trùng • Xử lý học Xử lý thẩm thấu manitol hay sorbitol 2) Xử lý enzyme • Xử lý enzyme cellulase, hemi-cellulase, pectinase, lignase 3) Tách tế bào trần 4) Xác định mật độ • Nhuộm phẩm nhuộm fluorescein diacetate để đánh giá khả s ng sót c a protoplast 3) Tách tế bào trần 3/6/2011 4) Xác định mật độ • Đếm buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ 5) Dung hợp tế bào trần 6) Nuôi cấy tái sinh tế bào trần • Mơi trường ni cấy thường ch a 13% manitol, auxin, cytokinin,… • Tái tạo vách tế bào • Phân chia tạo cụm tế bào Dung hợp t bào tr n lai vô tính Các tế bào trần dung hợp cách tự nhiên q trình lập Dung hợp t bào tr n lai vơ tính Nếu tế bào trần cô lập từ nguồn tế bào khác mà xử lý để dung hợp gọi lai vơ tính 3/6/2011 Ph ng pháp dung hợp t bào tr n 1) Phương pháp xử lý học 2) Phương pháp xử lý nitrate sodium 3) Phương pháp xử lý ion Ca2+ (pH cao) 4) Phương pháp xử lý Polyethylene Glycol (PEG) 5) Phương pháp dung hợp xung điện 2) Ph ng pháp xử lý nitrate sodium • Tế bào trần cô lập đặt hỗn hợp NaNO3 5,5% dung dịch sucrose 10% Giữ ổn định nước 35ºC sau đem ly tâm 200 vịng phút • Loại b phần cho cụm tế bào vào nước 30 phút Trong su t trình này, hầu hết tế bào trần tiến hành dung hợp Các cụm tế bào gạn đưa vào mơi trường ni cấy có bổ sung 0,1% NaNO3 4) Ph ng pháp xử lý Polyethylene Glycol (PEG) 1) Ph ng pháp xử lý c học • Tế bào trần cô lập gom lại cho nằm gần với nhờ dụng cụ cầm tay cực nh micropipette • Một phần c a đầu micropipette chận lại tế bào trần giữ lại đẩy theo dòng chất l ng • S lượng tế bào dung hợp nhờ phương pháp thấp phương pháp không thông dụng 3) Ph ng pháp xử lý ion Ca2+ (pH cao) • Tế bào trần ly tâm phút t c độ 50 vịng/phút mơi trường cảm ng dung hợp gồm có 0,5M manitol, 0,05M CaCl2.2H2O pH 10,5 • Các ng ly tâm có ch a tế bào trần ngâm nước 37ºC 40-50 phút Sau xử lý xong có khoảng 2050% tế bào trần dung hợp 4) Ph ng pháp dung hợp xung n • Dung dịch PEG làm tăng kết dính c a tế bào trần cảm ng dung hợp tế bào trần c a s loài thực vật • Hút ml dung dịch mơi trường có ch a tế bào trần với mật độ thích hợp cho vào ng nghiệm ch a môi trường nuôi cấy có ml dung dịch PEG 56% ng nghiệm lắc giây sau để yên 10 phút Tế bào trần sau rửa vài lần để loại b PEG chuyển lại vào môi trường nuôi cấy Electrofusion chambers Fusion electrodes Electrofusion apparatus 3/6/2011 ... hemi-cellulase, pectinase, lignase 3) Tách tế bào trần 4) Xác định mật độ • Nhuộm phẩm nhuộm fluorescein diacetate để đánh giá khả s ng sót c a protoplast 3) Tách tế bào trần 3/6/2011 4) Xác định... micropipette • Một phần c a đầu micropipette chận lại tế bào trần giữ lại đẩy theo dòng chất l ng • S lượng tế bào dung hợp nhờ phương pháp thấp phương pháp không thông dụng 3) Ph ng pháp xử... bào trần • Mơi trường ni cấy thường ch a 13% manitol, auxin, cytokinin,… • Tái tạo vách tế bào • Phân chia tạo cụm tế bào Dung hợp t bào tr n lai vơ tính Các tế bào trần dung hợp cách tự nhiên