3/6/2011 CH ƠNG IV CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN • “Mọi thể sinh vật phức tạp gồm nhiều đơn vị nhỏ tế bào hợp thành“ hay “Tế bào đơn vị sống cấu trúc thực vật” (Schleiden Schwann, 1838) • Đến năm 1960, Melcher Bergman tác giả tách nuôi cấy thành công tế bào đơn thực vật bình lên men với mơi tr ờng nhân tạo Ví dụ hợp chất thứ cấp Sản phẩm biến d ỡng thực vật • Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid béo, acid amine,… • Sản phẩm thứ cấp: alkaloid, nicotine, berberin, ginsenosid, palitaxel,… Sản phẩm thứ cấp giúp đáp ứng stress, phòng vệ chống vi sinh vật, trùng,… Ví dụ hợp chất thứ cấp Hợp chất ginsenosid từ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grutzv.) • • • • Hợp chất ginsenosid từ Nhân sâm (Panax ginseng): Tác dụng đến hệ thần kinh trung ơng; Gia tăng sức đề kháng; Tăng c ờng co bóp tim Hạ đ ờng huyết Ví dụ hợp chất thứ cấp • Đan sâm, Đảng sâm, Giác sâm, Hải quy sâm, Hồng sâm, Khổ sâm, Sa sâm, Sâm bòng bong, Sâm bố chính, Sâm chèo mèo, Sâm chiếu, Sâm đại hành, Sâm đất, Sâm lông, Sâm nam, Sâm ớt,… • Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam (Ngũ gia bì), Sâm Vũ Diệp (Trúc tiết Nhân sâm) 3/6/2011 Ví dụ hợp chất thứ cấp • • • • • • Giới Ngành Lớp Bộ Họ Chi : : : : : : Ví dụ hợp chất thứ cấp Saponin: • Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều lắc với n ớc, có tác dụng nhũ hóa tẩy • Làm vỡ hồng cầu nồng độ lỗng • Độc với cá động vật máu lạnh; có tác dụng diệt loài thân mềm nh giun, sán, ốc sên • Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt • Có thể tạo phức với cholesterol với chất 3-ß-hydroxysteroid khác Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Apiales Araliaceae Panax Ví dụ hợp chất thứ cấp Ví dụ hợp chất thứ cấp • Saponin steroid phân bố hẹp, đ ợc tìm thấy lồi mầm hai mầm: Araliaceae, Agavaceae, Smilacaceae, • Trong cây, saponin th ờng tích lũy phận khác nhau: tích lũy nh bồ kết, bồ hịn; tích lũy rễ nh cam thảo, viễn chí, cát cánh; tích lũy nh dứa Mỹ,… Hàm l ợng th ờng cao có số tr ờng hợp lên đến 10 % Ṿt lịu tḥc ṿt H̀m l ̣ng T́c đ̣ sinh t̉ng paclitaxel TB ḥp đ̣c bịt (% tṛng l ̣ng khô) V̉ tr ̉ng th̀nh (100 năm tủi) 4.70 x 10-6 mg/g/day 0.017 Cây (4 năm tủi) 0.34 x 10-6 mg/g/day 0.005 Nuôi ćy mô 0.64 mg/l/day 0.200 Taxomyces andreanae 10-6 400 x mg/l/day Hợp chất taxol từ Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.): Tế bào thực vật đ ợc ni cấy hệ thống thích hợp để sản xuất hợp chất thứ cấp với sản l ợng cao ngun vẹn - 3/6/2011 Q trình ni cấy Những hợp chât đ ợc tạo công nghệ nuôi mô va tê bao thực vật để s̉ dụng lam thuôc bao gôm: diosgenin, codeine, morphine, atropine, hyoscyamine, scopolamine, digoxin, digitoxin, quinine, reserpine, artemisinin Điểm khác biệt nuôi cấy tế bào đơn thực vật VSV • • • • • Mức độ vô trùng Tồn d ới dạng huyền phù Tốc độ phân chia sinh khối Ph ơng thức sinh d ỡng Các chất đ ợc tạo trình trao đổi chất u điểm • Điều kiện ni cấy đ ợc kiểm sốt đ ợc tối u cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp • Tế bào đ ợc chọn lọc cải thiện cách nhân dòng, gây đột biến biệt hóa dùng ph ơng pháp hóa học ph ơng pháp sinh học • Có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa chất tế bào chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Đặc điểm sinh lý tế bào đơn nuôi cấy • Ngun liệu để ni cấy tế bào đơn môi tr ờng lỏng tế bào mô sẹo • Trong q trình phát triển mơi tr ờng lỏng, tế bào đơn thực vật th ờng phát triển qua bốn giai đoạn: thích nghi, tăng tr ởng, cân suy tàn Đặc điểm sinh lý tế bào đơn ni cấy • • • • • • • Tế bào đơn phát triển thành dịng tế bào có đặc tính sau: Tách riêng tế bào dễ dàng; Các tế bào có độ đồng cao; Tế bào có nhân to, nguyên sinh chất đậm đặc Có chứa nhiều hạt tinh bột; Có khả phân chia khoảng 24-72h; Bị tính tồn thế; Bị tăng mức bội thể 3/6/2011 Những yếu tố ảnh h ởng đến nuôi cấy tế bào đơn Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn thu nhận sản phẩm thứ cấp • Các chất điều hịa sinh tr ởng: làm tăng q trình phân bào, kích thích q trình biệt hóa, tạo sản phẩm thứ cấp,… • Các nguồn dinh d ỡng: đạm, nguồn carbon, vi l ợng, ánh sáng,… Điểm cần l u ý • Không nên nuôi cấy tế bào đơn cách đại trà mà khơng tính tốn đến khả tạo sản phẩm đặc biệt loài thực vật • Khơng phải tất quan có khả tạo chất mà ta quan tâm • Trong q trình ni cấy, ln ln phải tiến hành tuyển chọn để nâng cao suất tạo sản phẩm bậc • Bổ sung chất t ơng ứng • Tìm mơi tr ờng đặc hiệu cho loại tế bào Ph ơng pháp làm tăng sản l ợng • • • • • • • • Điều kiện mơi tr ờng thích hợp Chọn lựa chủng có suất cao Biến đổi tiền chất X̉ lý với chất cảm ứng Cố định tế bào Tiết sản phẩm môi tr ờng Gây đột biến tế bào Phát sinh hình thái Điều kiện mơi tr ờng thích hợp • Thành phần chất mơi tr ờng ni cấy, chất điều hịa sinh tr ởng thực vật, pH, nhiệt độ, độ thơng khí, độ lay chuyển, ánh sáng,… • Auxin th ờng đ ợc bổ sung vào môi tr ờng để cảm ứng tạo mơ sẹo, đ ợc giữ lại với hàm l ợng thấp loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất chất biến d ỡng Mô sẹo của Oxalis reclinata d ới anh sang co mau vang, nh ng đ ợc chuyển sang điêu kiện thi co mau đỏ vi chung băt đâu sản xuât săc tô anthocyanin co mau đỏ 3/6/2011 Lựa chọn chủng có khả sản xuất cao • Các đặc tính sinh lý tế bào riêng lẻ khơng ln thống với • Việc chọn dòng tế bào kỹ thuật hữu hiệu để tăng l ợng sản phẩm thứ cấp nên áp dụng ph ơng pháp rộng rãi Biến đổi tiền chất biến đổi sinh học • Việc bổ sung vào môi tr ờng nuôi cấy tiền chất thích hợp hợp chất có liên quan đơi kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp • Thay bổ sung hợp chất đặc biệt nh tiền chất vào môi tr ờng nuôi cấy tế bào thực vật, ng ời ta cịn s̉ dụng tế bào thực vật nuôi cấy để biến đổi chất thích hợp thành sản phẩm mong muốn X̉ lý với chất cảm ứng (elicitor) Vi dụ vê biên đổi sinh học nuôi tê bao: Coniferin đ ợc bổ sung vao huyên phu tê bao Podophyllum hexandrum va podophyllotoxin đ ợc tạo Podophyllotoxin đ ợc s̉ dụng để sản xuât thuôc trị ung th • Khi vi sinh vật xâm nhiễm vào thực vật nguyên vẹn th ờng cảm ứng tạo hợp chất thứ cấp • Tác động kích thích chúng đáng kể nh chất cảm ứng thích hợp đ ợc chọn lựa để kích thích tổng hợp hợp chất thứ cấp Elicitor -> Elicitor recognition -> Enzyme synthesis -> Phytoalexin synthesis 3/6/2011 Elicitor Lòi TV S̉n ph̉m Phytophthora megasperma Glycine max Soybean Glycollin Fungal homogenate Ruta gravolens Acridone exposides Phytium aphanidermatum Catharanthus roseus Periwinkle Strictosidine lactam Ajmaciline Tabersonine Lochnericine Catharanthine Botrytis Colletotrichum Verticillium Altenaria Arachidonic acid Chitosan Nigram Papaver somniferum Opium poppy Sanguinarine Tiết sản phẩm mơi tr ờng • Có thể làm tăng khả sản xuất hợp chất thứ cấp cách kích thích cho chúng đ ợc tiết ngồi mơi tr ờng • Để làm tăng tiết sản phẩm môi tr ờng, ng ời ta cố gắng làm tăng tính thấm màng tế bào kết đạt đ ợc hạn chế Cố định tế bào • • • • • Một hệ thống cố định trì sống tế bào qua khoảng thời gian dài phóng thích phần lớn sản phẩm môi tr ờng ngoại bào dạng ổn định: Sự cố định th ờng bị hạn chế Sinh khối ban đầu phải đ ợc nuôi cấy dạng huyền phù tế bào Sản phẩm bắt buộc tiết mơi tr ờng Sản phẩm bị thối biến Ngăn cản khuếch tán tế bào Gây đột biến tế bào • Các dạng đột biến điều hịa đột biến khuyết d ỡng đ ợc s̉ dụng rộng rãi để sản xuất nhiều loại sản phẩm nh amino acid, nucleotide, kháng sinh,… • Sự gia tăng hoạt động biến d ỡng cách s̉ dụng đột biến điều hịa thực đ ợc mặt lý thuyết việc chọn lọc kiểu tế bào đồng dạng cho mục đích yếu tố quan trọng để sản xuất loại sản phẩm khác Phát sinh hình thái • Có mối quan hệ phản phân hóa tế bào với khả sản xuất hợp chất thứ cấp nh ng ch a rõ sản xuất hợp chất thứ cấp có phụ thuộc vào phát triển cấu trúc chuyên biệt hay khơng hay q trình có liên quan với đặc tính di truyền đặc tính sinh lý? • Ni cấy lơng rễ (chuyển plasmid Ri vào vết th ơng mô) ... hợp chất thứ cấp • Thay bổ sung hợp chất đặc biệt nh tiền chất vào môi tr ờng nuôi cấy tế bào thực vật, ng ời ta cịn s̉ dụng tế bào thực vật nuôi cấy để biến đổi chất thích hợp thành sản phẩm. .. đổi tiền chất X̉ lý với chất cảm ứng Cố định tế bào Tiết sản phẩm môi tr ờng Gây đột biến tế bào Phát sinh hình thái Điều kiện mơi tr ờng thích hợp • Thành phần chất mơi tr ờng ni cấy, chất điều... tạo sản phẩm đặc biệt loài thực vật • Khơng phải tất quan có khả tạo chất mà ta quan tâm • Trong q trình ni cấy, ln ln phải tiến hành tuyển chọn để nâng cao suất tạo sản phẩm bậc • Bổ sung chất