TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Panax
1.1.1 Đặc điểm thực vật a) Phân loại và phân bố:
Vị trí phân loại của chi PanaxL theo Takhtajan[72]:
Họ: Ngũ gia bì(nhân sâm) Araliaceae
Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về các loài thuộc chi Panax Theo Flora of China (2007)[81], ở Trung Quốc chi Panax có 7 loài
Theo trang The plant list, chi Panax bao gồm 47 tên khoa học của thực vật, trong đó có 12 loài và 1 thứ được chấp nhận với mức độ tin cậy cao Phân bố của 12 loài như trong bảng sau:
Bảng 1 Phân bố của các loài thuộc chi Panax L
Từ dãy Himalaya đến miền trung Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt Nam
2 Panax ginseng C.A.Mey Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc, Đông bắc Trung Quốc
3 Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey Nhật Bản, Hàn Quốc
Miền nam Trung Quốc và một số nơi ở Việt Nam
5 Panax pseudoginseng Wall Nê-pan
& Pandit Vùng Sikkim - Ấn Độ
8 Panax stipuleanatus Tsai & Feng Trung Quốc, Việt Nam
10 Panax vietnamensis Ha & Grushv Trung Quốc, Việt Nam
11 Panax wangianus S.C.Sun Miền trung, nam Trung Quốc
Feng Vân Nam - Trung Quốc Ở Việt Nam, chi PanaxL có 5 loài gồm cây mọc tự nhiên cũng như được nuôi trồng, với phân bố như sau[3]:
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): ở Quảng Nam, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng
Sâm vũ diệp (Panax bipinatifidus Seem.): ở Lào Cai trên dãy Hoàng Liên Sơn, Sa Pa
Tam thất (Panax pseudoginseng Wall.): ở Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Phó Bảng, Hà Giang, Lai Châu
Nhân sâm (Panax ginseng Meyer.): phân bố rải rác ở các khu vực rừng núi trong cả nước, mọc tập trung nhiều tại các khu vực vùng núi cao, có khí hậu mát lạnh
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng): có ở Lai Châu, Lào Cai b) Đặc điểm thực vật
Theo Seemann (1868), chi Panaxlà nhóm thảo mộc có lá kép hình chân vịt có răng cưa, mọc ở đỉnh thân, cụm hoa mang một tán đơn ở tận cùng, hoa nhỏ có 5 cánh, bầu nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2 – 5 hạt Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng[68] Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn[81]
Thành phần hóa học trong các loài thuộc chi Panax rất phong phú[13]: saponin, polyacetylen, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử và một số hợp chất mới được phát hiện như glycosphingolipid, saccharose [6] …Trong đó saponin và polyacetylen là hai thành phần chính a) Hợp chất saponin
Saponin được xem là thành phần chính quyết định hoạt tính của các loài thuộc chi Panax Đến cuối năm 2012, ít nhất 289 saponin đã được báo cáo từ mười một loài Panax khác nhau[79] Các saponin thuộc 4 phân nhóm phổ biến nhất là protopanaxadiol, protopanaxatriol, acid oleanolic, octrilol Các loại saponin được trình bày trong các bảng dưới đây:
Bảng 2 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và
2 Ginsenosid Rb 2 (A) G1C 2 -G1C Glc 6 -Ara(p) P ginseng [84];
5 Ginsenosid Rgl (B) Glc Glc P ginseng[79]
Bảng 3 Saponin khung dammaran khác
5 Chikusetsusaponin L 9bc (C) H OH Glc H P vietnamensis [56]
6 Ginsenosid M 7cd (C) H OH H Glc P vietnamensis [56]
7 Chikusetsusaponin LT 8 (D) Glc - - Glc P japonicus [48]
Bảng 4 Saponin dẫn chất ocotillol
Bảng 5 Saponin dẫn chất acid oleanolic
Glc P stipuleanatus [83] b) Hợp chất polyacetylen
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với những nhóm chất liên kết Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là chuỗi C 7 H 15 [25,52,66]
Bảng 6 Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L
STT Loài Hợp chất TLTK
- Heptadeca-l-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol
- 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1 -en-4,6-diyn
- 10-hydroxydeca- 4,6-diynoic acid 10-O-β-D- glucopyranosyl (1 -> 2)-β-Dglucopyranoside
- 10-acetoxy-hetadeca-8 (E) -en-4,6-diyn-3-ol
Trong chi PanaxL., có một số loài đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng dược lý như: nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) a) Nhân sâm
Nhân sâm đã được nghiên cứu và chứng minh có các tác dụng: tăng lực, hồi phục sức khỏe [76]; cải thiện trí nhớ [59,85]; chống stress, giải lo âu và chống trầm cảm [46,65,76,80]; chống oxy hoá và chống lão hoá [39,54]; bảo vệ gan [35,36,47]; điều hòa miễn dịch[40,41]; chống ung thư [57,69]; hạ cholesterol và lipid máu [23,61]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [29-31]; hạ glucose huyết [44] b) Tam thất
Tam thất cũng thể hiện các tác dụng dược lý tương tự nhân sâm, như: tác dụng chống oxy hóa [75]; tác dụng điều hòa miễn dịch [51]; tác dụng bảo vệ tế bào não trong trường hợp thiểu năng tuần hoàn não [43]; hạ lipid máu và phòng chống huyết khối [32]; tác dụng bảo vệ gan [24,53]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [63] c) Sâm Mỹ
Sâm Mỹ có tác dụng chống oxy hoá, chống stress[50]; tăng cường miễn dịch [28]; gây độc tế bào ung thư [22,64]; chống đái tháo đường [21] d) Sâm Việt Nam
Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy sâm Việt Nam có những tác dụng tương tự nhân sâm Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâm Việt Nam có tác dụng cải thiện trí nhớ [8,18]; chống stress và trầm cảm [9,19,58]; chống oxy hóa [19]; tác dụng bảo vệ gan [7,73,74]; kháng khuẩn trên các chủng Streptococcus, Staphylococcus[4,52]; kích thích miễn dịch [10]; gây độc tế bào ung thư [71]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục, chống đái tháo đường, giảm đau chống viêm [4].
Tổng quan về dược liệu tam thất hoang
Tam thất hoang còn gọi là dã tam thất, Tam thất rừng, Sâm tam thất, Bình biên tam thất
Tên khoa học: Panax stipuleanatusH.T Tsai et K.M Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) Araliaceae Đặc điểm thực vật [3]:
Tam thất hoang thuộc cây thảo, sống lâu năm, cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có
1 thân mang lá, ít khi 2-3 Lá kép chân vịt, gồm 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ Quả gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng
Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9 (10) Nhân giống tự nhiên chủ yếu bằng hạt Quả chín thường bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại sóc nhỏ ăn nhân hạt Cá biệt trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng
10 Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau [16] Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu mùa xuân năm sau Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao từ 1600- 2300m[3]
Phân bố:Cho đến nay, loài này mới chỉ tìm thấy ở Đông-Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc Gia Hoàng Liên thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam(Sa Pa và Bát Xát: núi Hoàng Liên Sơn)[16]
Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH
Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ ra rằng phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ TTH [83]
Hình 2 Saponin dẫn chất acid oleanolic
Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của TTH được thu hái ở Trung Quốc [86]
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun L đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu TTH thu hái ở Việt Nam [26] Năm 2013, nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin khác nữa [27] Các saponin mà nhóm tác giả trên phân lập được từ TTH đều là các saponin dẫn chất của acid oleanolic
Bảng 7 Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang
Acid oleanolic-3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→3)β-D- glucuronopyranosyl-6'-methyl ester] -28-O-β-D- glucopyranosyl ester (8)
9 Acid oleanolic-3-O-β-D-xylopyranosyl(1→2)-β-D- glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranosid (9) [26]
Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất khác từ TTH gồm 3 polyacetylen (trong đó stipudiol và stipuol là 2 chất mới, (3R,9R,10R)- panaxytriol là chất đã biết), và các hợp chất khác: spathulenol (serquiterpen) và 9- docosenoic acid methyl ester (acid béo) [25] Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH vẫn còn mới mẻ
Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng[11] Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic[13]
1.2.3 Tác dụng dược lý và công dụng a) Tác dụng dược lý
Năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD 50 = 8,8 g/kg Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg Cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd ở nồng độ 25, 50, 100 μg/ml [11]
Nhóm nghiên cứu của Chun L (2010) [26] đã thử tác dụng gây độc tế bào trên các dòng tế bào HL-60 (bệnh bạch cầu) và HCT-116 (ung thư ruột kết) của các hợp chất saponin từ 2 đến 12 (theo bảng 7), thấy rằng các chất đều có tác dụng gây độc tế bào ở mức độ khác nhau Chất 11biểu hiện rõ ràng tác dụng gây độc tế bào HL-60 và HCT-116 với giỏ trị IC 50 là 4,44 và 0,63 àM tương ứng; chất 5 cú tỏc dụng gõy độc tế bàotrung bỡnh với giỏ trị IC 50 là 41,45 và 6,50 àM Sau khi cỏc dòng tế bào HL-60 và HCT-116 được xử lý với các chất 11 và 5, thấy có sự chết tế bào theo chu trình Chất 4, 8 có tác dụng gây độc tế bào với giá trị IC 50 là 75,94 và 78,11 àM lờn tế bào HCT-116 Cỏc chất 3, 6, 9, 10, 12 đều cú tỏc dụng gõy độc tế bào với cỏc giỏ trị IC 50 lần lượt là 63,44; 67,08; 72,99; 76,23; 83,90; 91,16 àM lờn dòng tế bào HL-60 và có tác dụng lên dòng HCT-116 với các giá trị IC 50 lớn hơn
Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục thử tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất polyacetylen là stipudiol và stipuol Kết quả cho thấy cả 2 chất đều ức chế sự tăng sinh tế bào HL-60 và HCT-
116 với giá trị IC 50 tương ứng là 0,13 và 0,28 μM ;0,5 và 0,8 μM [25]
Trong một công bố khác năm 2013, nhóm nghiên cứu của Chun L chỉ ra rằng các saponin 2, 3, 4, 8, 9, 12 (theo bảng 7) có tác dụng ức chế NF-κB với giá trị
IC 50 từ 3,1 đến 18,9 μM Ba hợp chất 3,4,9 ức chế hoạt động của NF-κBbằng cách giảm nồng độ của tác nhân gây viêm trên tế bào HepG2 [27] b) Công dụng
Tam thất hoang có tác dụng tán ứ, định thống
Sách đỏ Việt Nam (2007) ghi: “tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”[3]
Theo Đông y: tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm Có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu
Theo sách "Trung Quốc dược thực chí": tam thất hoang có tác dụng chữa thương tổn, cầm máu, có thể sử dụng để thay thế tam thất.Trên lâm sàng rễ củ tam thất hoang dược dùng để cầm máu các loại vết thương và xuất huyết Cũng được dùng như tam thất làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh đẻ, còn có tác dụng kích thích sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh Liều dùng 4-8g thuốc bột hoặc rượu thuốc
Một số bài thuốc có tam thất hoang:
- Chữa thống kinh (đau bụng trước kỳ kinh): Ngày uống 5 g bột TTH, uống 1 lần, chiêu với cháo loãng hoặc nước ấm
- Phòng và chữa đau thắt ngực: Ngày uống 3-6 g bột TTH (1 lần), chiêu với nước ấm
- Chữa thấp tim: Ngày uống 3 g bột TTH, chia 3 lần (cách nhau 6-8 giờ), chiêu với nước ấm Dùng trong 30 ngày
- Chữa các vết bầm tím do ứ máu (kể cả ứ máu trong mắt): Ngày uống 3 lần bột TTH, mỗi lần từ 2-3 g, cách nhau 6-8 giờ, chiêu với nước ấm
Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu
Hiện tại, các nghiên cứu về tiêu chuẩn chất lượng của tam thất hoang còn rất hạn chế, chưa có tiêu chuẩn chất lượng cụ thể
Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu[5]:
Mô tả: bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị,cácđặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệuhoặc đặc điểm thể chất của dược liệu
Định tính: là những phương pháp dùng để nhận biết dược liệu bao gồmcáckinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa
Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và truyền thốngnhư sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu…
Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học, bao gồm:
- Vi phẫu: Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu Trong phần lớn các trường hợp, hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học Vì vậy, khi quan sát các mẫu người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát dễ dàng hơn
- Soi bột: mỗi một dược liệu đều có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua bột dược liệu Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi để tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, có vai trò trong việc địnhdanh, xác định độ tinh khiết, phân biệt dược liệu này với dược liệu dễ nhầm lẫn, phát hiện giả mạo nếu có và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu
Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của các dược liệu
Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể
Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao… để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn
Định tính hu nh quang là quan sát sự phát hu nh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hoặc của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thườnghay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử Trừ khi có quyđịnh riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm
Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại mỏng có kích thước hơi lớn hơn Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín bằngmột phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém Nhấc phiến kính ra và để nguội Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa
Thử tinh khiết: là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:
Mất khối lượng do làm khô
Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric
Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối
Tỉ lệ vụn nát của dược liệu
Hàm lượng kim loại nặng
Dư lượng các chất bảo vệ thực vật
Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác)
Định lượng: là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trongdược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Định lượngbao gồm cả việc xác định hàmlượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị
Mẫu tam thất hoang được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai cóđộ tuổi 4-6 năm đã được xác định tên khoa học, được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DL-020816 (Phụ lục 1)
Xử lý nguyên liệu: sau khi thu hái, nguyên liệu được rửa sạch, sấy khô ở 50ºC đến khi đạt độ ẩm dưới 10% Sau đó được cắt miếng mỏng, xay nhỏ làm mẫu nghiên cứuvà được bảo quản trong túi kín
Hình 3 Nguyên liệu tam thất hoang ( Panax stipuleanatus
Chất đối chiếu: stipuleanosid R1, stipuleanosid R2, acid oleanolic được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Viện dược liệu
Dung môi hoá chất:methanol, ethanol, n-hexan,n-butanol, acid acetic băng, acid perchloric, vanillin,nước cất hai lần…dùng cho phân tích
Máy móc, thiết bị: máy siêu âm Power sonic 405; máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI); tủ sấy Memmert, Binder-FD115; bếp điện, bếp đun cách thủy; tủ sấy chân không Heraeus VT6025, Châu Âu; cân kĩ thuật Precisa
BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60; máy đo quang Shimadzu UV-1800 UV-Vis Spectrophotometer.
Phương pháp nghiên cứu
Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Tam thất hoang dựa trên các chỉ tiêu chung được qui định tại phụ lục 12.2 DĐVN IV[5]gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, định tính, định lượng,…
Tiến hành trên mẫu dược liệu là thân rễ đã sấy khô Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan, kiểm tra kích thước bằng cách đo
Mẫu dược liệu TTH tươi cả 3 phần lá, thân, thân rễ được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung dịch javel, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh metylen Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để soi các đặc điểm vi phẫu của dược liệu[17]
Phần thân rễ TTH được làm khô rồi nghiền thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch glycerin, quan sát các đặc điểm của bột bằng kính hiển vi[17]
Sử dụng cân xác định độ ẩm Precisa HA 60 (cân chính xác khoảng 1 g phần thân rễ đã cắt nhỏ, khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng)
Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.8 Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã được sấy khô
Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:
Trong đó:m: khối lượng tro (g);
A: độ ẩm của mẫu thử (%)
2.2.6 Tro không tan trong acid
Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.7.Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã được sấy khô
Tỷ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính theo công thức:
Trong đó:m: khối lượng tro (g);
A: Độ ẩm của mẫu thử (%)
2.2.7 Định tính a) Dựa trên tính chất tạo bọt
Lấy 1 g bột thân rễ, thêm 15 ml ethanol 70% (TT) đun trên cách thủy 10 phút, lọc Lấykhoảng 1 ml dịchlọc pha loãng với nước cất thành 10 ml Lắc mạnh
15 giây, có bọt bền[17] b) Phương pháp sắc kí lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4)
Dung dịch thử: Lấy 1g bột phần thân rễ, thêm 10 ml methanol, siêu âm 15 phút,lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký
Dung dịch đối chiếu: hòa tan 1 mg mỗi loại chất đối chiếu stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 trong 1 ml methanol
Pha động: hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước (4:5:1, lớp trên) với
SKLM pha thường, aceton : nước (2:1) với SKLM pha đảo
Pha tĩnh: Silica gel 60F 254 (Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phúttrước khi dùng
- Phương pháp phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, ánh sáng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm
- Cách tiến hành: Trên bản mỏng silica gel 60F 254 tráng sẵn (Merck), đã hoạt húa ở 105°C trong 1 giờ, chấm riờng biệt 10 àl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, tiến hành sắcký theo DĐVN IV, phụ lục 5.4 Sau khi triển khai hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi, phun thuốc thử Sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm, UV 366nm và ánh sáng thường
2.2.8 Định lượng a) Định lượng theo phương pháp cân
Cân chính xác 10 g bột dược liệu phần thân rễđã rây qua rây số 335 (đã được đo độ ẩm) chiết Soxhlet với khoảng 100 ml n-hexan (TT) để loại chất béo (khoảng 8 giờ), lấy bã bay hết hơi n-hexan.Sau đó chiết bằng 100 ml methanol (TT) Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn Hòa tan cắn trong 20 ml nước rồi lắc với n-butanol bão hòa nước (TT) đến khi lớp n-butanol nhạt màu Gộp dịchn- butanol, rửa 3 lần bằng nước cất Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml ethanol 80% rồi chuyển vào một cốc đã được xác định khối lượng trước Bốc hơi trên cách thủy được cắn Sấy khô cắn ở 105ºC trong 3 giờ
Tính hàm lượng saponin tổng theo dược liệu khô kiệt theo công thức:
Trong đó: X: hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu (%);
Mc: là khối lượng cao thu được (g);
Mt: là khối lượng mẫu thử (g);
A: là hàm ẩm dược liệu (%) b) Định lượng theo phương pháp đo quang
Xây dựng phương pháp đo quang
Căn cứ vào các tài liệu tham khảo [2,20,87,88]và quy trình thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng như sau:
Chuẩn bị thuốc thử, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và môi trường
- Chuẩn bịthuốc thử vanillin trong acid acetic băng 50mg/ml: Cân 0,5g vanillin tinh thể pha trong acid acetic băng vừa đủ 10ml thu được thuốc thử có nồng độ 50mg/ml
- Môi trường: acid acetic băng
- Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn acid oleanolic pha trong ethanol tuyệt đối vừa đủ 50,0ml thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5,0 g bột phần thân rễ, chiết hồi lưu với ethanol 50% (tỉ lệ dung môi : dược liệu = 10 : 1) ở 70ºC trong 3 lần, mỗi lần 0,5 giờ Lọc, gộp dịch chiết và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn toàn phần
Cân chính xác khoảng 5,0 mg cắn pha trong ethanol tuyệt đối vừa đủ 10ml thu được dung dịch thử có nồng độ 0,5 mg/ml (nếu cắn không tan hết thì bổ sung thêm vài giọt nước và siêu âm)
Khảo sát và tìm điều kiện đo quang
- Khảo sát cực đại hấp thụ quang
Tiến hành quét phổ với 3 dung dịch: dung dịch chuẩn, dung dịch thử sau khi tiến hành phản ứng với thuốc thử acid perchloric và vanillin trong acid acetic băng và dung dịch thử không tiến hành phản ứng với các thuốc thử Sau đó quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 –800nm Cuvet thạch anh có bề dày 1cm.Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Nhiệt độcủa phản ứng được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng ởcác nhiệt độ khác nhau (điều chỉnh nhiệt độ bằng bể điều nhiệt)
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thời gian của phản ứng được được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng trong các khoảng thời gian khác nhau tại nhiệt độ đã xác định Phản ứng tạo màu được cho là ổn định khi giá trị độ hấp thụ của nó ít dao động
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Nồng độ thuốc thử vanillin được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử vanillin khác nhau trong cùng điều kiện phản ứng đã chọn
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
Nồng độthuốc thử acid perchloric được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử acid perchloric khác nhau trong cùng điều kiện phản ứng đã chọn
Thẩm định và đánh giá phương pháp
Xác định khoảng nồng độ tuyến tính Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đặc điểm vi phẫu và bột
3.1.1 Đặc điểm vi phẫu a) Đặc điểm vi phẫu lá
Quan sát trên tiêu bản vi phẫu lá (Hình 4)nhận thấy:
Phần gân lá:Mặt trên và mặt dưới đều lồi Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình đa giác hoặc chữ nhật tương đối đều, mặt trên tế bào biểu bì hơi to hơn ở mặt dưới Lớp cutin dày có răng cưa nhỏ Mô dày phiến (2) gồm nhiều tế bào hình đa giác đều nhau, xếp thành 1-2 lớp tế bào ở cả hai mặt, mô dày góc (3) ở đỉnh lồi lên của mặt trên dưới mô dày phiến, tế bào hình đa giác không đều, xếp lộn xộn Mô mềm(4) gồm các tế bào thành mỏng, hình đa giác, kích thước không đều, chiếm khoảngphần lớn vi phẫu Trong mô mềm rải rác tế bàochứa tinh thể calci oxalate
(7) Bó libe gỗ (5) nằm trong khối mô mềm, xếp thành từng vùng làm thành hình vòngcung, mặt lõm hướng lên trên Trong bó libe gỗ, vòng gỗ (5)nằm trong, vòng libe (6) nằm ở ngoài Phía trong và ngoài bó libe gỗ đều có ống tiết ly bào (8) tạo bởi 5-7 tế bào
Phần phiến lá:Tế bào biểu bì hình chữ nhật, biểu bì trên (9) to hơn biểu bì dưới (11) Mô mềm (10) gồm các tế bào nằm kích thước không đều, thành mỏng, uốn lượn, hình chữ nhật hoặc hình đa giác bên trong chứa nhiều lục lạp Rải rác trong mô mềm có các bó gân phụ
A Gân lá: 1 Biểu bì, 2 Mô dày phiến, 3 Mô dày góc, 4 Mô mềm, 5 Libe, 6 Gỗ, 7 Mô mềm chứa tinh thể calci oxalat, 8 Ống tiết ly bào
B Phiến lá: 9 Biểu bì trên,
10 Mô mềm, 11 Biểu bì dưới
Hình 4 Vi phẫu lá b) Đặc điểm vi phẫu thân
Quan sát trên tiêu bản vi phẫu thân (Hình 5), nhận thấy:
Phần thân trên cao có tiết diện đa giác nhiều cạnh, phần thân sát thân rễ tiết diện hình bầu dục Thân từ ngoài vào trong thấy gồm các phần: ngoài cùng là biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác xếp đều đặn, bên ngoài có phủ lớp cutin dày có răng cưa Mô dày phiến (2) gồm nhiều tế bào hình đa giác không đều nhau, xếp thành 2-4 lớp Mô mềm (3) gồm các tế bào hình trứng kích thước không đều nhau, tăng dần từ ngoài vào trong Ở phần thân trên cao (A), mô mềm hóa gỗ (4) tạo thành một vòng nối các bó libe gỗ Trên các bó libe gỗ, mô mềm hóa mô cứng (5) tạo thành dải phủ bên trên libe Ở phần thân sát thân rễ (B) không có hiện tượng này, mô mềm có chứa rải rác tinh thể calci oxalat (10) Mô mềm chiếm hầu hết vi phẫu Tiếp theo là bó libe gỗ tập trung thành từng vùng hình bầu dục xếp cách đều dưới mô dày, mạch gỗ (6) tạo thành tia hướng tâm nằm trong mô mềm gỗ không hóa gỗ, libe (7) tạo thành vòng bao quanh các mạch gỗ Trong cùng là mô mềm ruột (8) Ngoài ra còn có các ống tiết ly bào (9) trong mô mềm , thường ở
A Phần thân trên cao; B Phần thân sát thân rễ
1 Biểu bì, 2 Mô dày, 3 Mô mềm vỏ, 4 Mô mềm hóa gỗ, 5 Mô mềm hóa mô cứng, 6 Libe, 7 Gỗ, 8 Mô mềm ruột, 9 Ống tiết ly bào,
10 Tinh thể calci oxalat trong mô mềm c) Đặc điểmvi phẫu thân rễ
Mặt cắt ngang thân rễ tam thất hoang có dạng hình bầu dục, cắt tiêu bản vi phẫu hình tam giác (Hình 6), từ ngoài vào trong gồm các phần: Bần (1) gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách mỏng uốn lượn xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều
Mô mềm vỏ (2) nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước khác nhau, vách uốn lượn
Libe-gỗ hình thoi xếp đều đặn: Libe (4) là những tế bào hình tròn hoặc bầu dục vách dày mỏng xen kẽ nhau, xếp thẳng hàng Mạch gỗ (6) tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ là các tế bào đa giác, vách cellulose Tầng phát sinh libe gỗ (5) nằm giữa libe và gỗ ở các bó và kéo dài nối liền giữa các bó Tia ruột (7) rất rộng, nằm giữa các bó libe gỗ, gồm các tế bào hình chữ nhật Tinh thể calci oxalatehình cầu gai rất nhiều đặc biệt ở tia ruột và mô mềm vỏ, mô mềm tủy Mô mềm ruột (8) gồm rất nhiều tế bào hình đa giác nhiều cạnh, kích thước hơi to hơn các tế bào mô mềm vỏ Rải rác ở mô mềm vỏ, nhất là ở libe và cả mô mềm ruột đều có các ống tiết ly bào (3) kích thước to nhỏ khác nhau
Hình 6 Vi phẫu thân rễ
1 Bần, 2 Mô mềm vỏ, 3 Ống tiết ly bào, 4 Libe, 5 Tầng phát sinh libe gỗ, 6 Gỗ,
7 Tia ruột và các tinh thể calci oxalat, 8 Mô mềm ruột
3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu a) Đặc điểm bột lá
Bột lá có màu xanh lục đậm, mùi thơm, vị đắng Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 7) nhận thấy các đặc điểm: biểu bì mang lỗ khí (1), mạch xoắn (2), mảnh mô mềm (3), mảnh mang màu (4), biểu bì cuống lá (5)
Hình 7 Bột lá b) Đặc điểm bột thân
Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm hắc Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 8), nhận thấy: các mảnh mạch (1): gồm mạch vạch (2), mạch mạng (3), mạch xoắn (4), mạch điểm (5); mảnh mô mềm (6) rải rác có tinh thể calci oaxalat hình cầu gai trong tế bào; bó sợi (7) và mảnh biểu bì (8); ngoài ra còn có mảnh mang màu (9)
9 c) Đặc điểm bột thân rễ
Bột có màu vàng nhạt, mùi thơm hắc, vị ngọt hơi đắng
Quan sát dưới kính hiển vi (Hình 9), nhận thấy: Mảnh bần (1) Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat (2) Các mảnh mạch: mạch mạng (3), mạch vạch
(4) Hạt tinh bột đứng đơn lẻ (5) và tập trung thành đám (6), hình tròn có rốn rõ, kớch thước 3-5 àm Tinh thể calci oxalat hỡnh cầu gai (7), kớch thước 20-25 μm Cỏc mảnh mang màu (8) cú kớch thước khỏc nhau,khoảng 15-25 àm
Độ ẩm
Dùng phương pháp xác định hàm ẩm bằng sử dụng cân hồng ngoại, kết quả thu được như bảng 8
Bảng 8 Độ ẩm của dược liệu tam thất hoang
STT Hàm ẩm (%) Giá trị trung bình (%)
Nhận xét: độ ẩm các mẫu dược liệu TTH trung bình khoảng 6,7% Tuy nhiên, trong quá trình thực nghiệm khi độ ẩm dược liệu khoảng 10% dược liệu vẫn được bảo quản tốt, không bị hỏng hay ẩm mốc, mối mọt Do vậy qui định hàm ẩm dược liệu không quá 10%
So với tiêu chuẩn về độ ẩm của các dược liệu khác trong DĐVN IV [5]:
Nhân sâm (không quá 12,0%), đẳng sâm Việt Nam (không quá 15%), sâm Việt Nam (không quá 13%), tam thất (không quá 13%) thì độ ẩm của TTH là khá thấp
Do đó việc bảo quản dược liệu TTH sẽ khó khăn hơn so với các loài Sâm khác.
Tro toàn phần
Tiến hành theo phương pháp 2 (Phụ lục 9.8 DĐVN IV) Kết quả thu được như sau:
Bảng 9 Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu tam thất hoang
Tỷ lệ tro toàn phần
Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu TTH trung bình là 8,42%, mẫu cao nhất là trên 8,5% Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu không quá 9%
Kết quả này tương đương với tỷ lệ tro toàn phần của một số dược liệu như: sâm Việt Nam (không quá 10%), đan sâm (không quá 10%)[5].
Tro không tan trong acid
Tiến hành theo phương pháp 1 (Phụ lục 9.7 DĐVN IV), kết quả thu được như bảng sau:
Bảng 10 Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu tam thất hoang
Tỷ lệ tro không tan trong acid (%)
Nhận xét: tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu TTH cao nhất là trên
1,6% Vậy tiêu chuẩn cơ sở quy định tỷ lệ tro không tan trong acid không quá 2%
So với các dược liệu thuộc nhóm “Sâm” trong chuyên luận DĐVN IV[5] như: đẳng sâm Việt Nam (không quá 2,0%), đẳng sâm Việt Nam chế (không quá 2,0%), nhân sâm (không quá 1,0%), tỷ lệ tro không tan trong acid của TTH không có sự khác biệt nhiều.
Định tính
Sau khi tiến hành phản ứng tạo bọt như mục 2.2.7, sau 15 phút trong ống nghiệm có cột bọt bền, sơ bộ kết luận dược liệu tam thất hoang có saponin b) Sắc ký lớp mỏng
Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha thường và pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.7
Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử có chứa các vết có Rf và màu sắc tương tự như dung dịch chuẩn
Sắc ký đồ pha thường
A Phun thuốc thử, ánh sáng thường;
Sắc ký đồ pha đảo
A Phun thuốc thử, ánh sáng thường;
Hình 10 Sắc ký đồ của dịch chiết tam thất hoang (B) và chất chuẩn
Định lượng
3.6.1 Định lượng theo phương pháp cân
Kết quả thu được trình bày trong bảng sau:
Bảng 11 Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu tam thất hoang
Từ bảng kết quả trên đưa ra tiêu chuẩn cơ sở quy định hàm lượng saponin tổng trong dược liệu tam thất hoang theo phương pháp cân không dưới 3%
Nhận xét: Kết quả định lượng saponin tổng trong THH bằng phương pháp cân tương đương với hàm lượng saponin tổng trong đảng sâm Việt Nam (không dưới 3,0%) khi sử dụng cùng phương pháp định lượng [5]
3.6.2 Định lượng theo phương pháp đo quang a) Khảo sát cực đại hấp thụ quang
- Hút chính xác 2 ml dung dịch chuẩn (bình 1), 2 ml dung dịch thử (bình 2,3)(được chuẩn bị như trên) vào bình định mức 10 ml, bốc hơi trên bếp cách thủy ở 80ºC đến cắn Thêm 0,3ml vanillin/acid acetic băng (TT) và 1ml acid perchloric (TT) vào bình 1, bình 2, lắc đều và ủ cả 3 bình ở 70ºC trong 10 phút Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch
- Dung dịch so sánh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với dung dịch chuẩn, chỉ không chứa chất chuẩn phân tích
- Quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 – 800nm
Kết quả thu được như hình:
Hình 11 Phổ hấp thụ của các dung dịchtrong khoảng bước sóng từ 300 –
Chú thích: 1 Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn acid oleanolic;
2 Phổ hấp thụ của dung dịch thử sau phản ứng với thuốc thử;
3 Phổ hấp thụ của dung dịch thử không có phản ứng với thuốc thử
Từ kết quả trên cho thấy, độ hấp thụ quang của dung dịch đạt giá trị cực đại tại bước sóng 548nm - 550nm Do đó chúng tôi chọn 550nm là bước sóng khảo sát b) Khảo sát điều kiện phản ứng
Nhằm xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng tạo màu với thuốc thử, chúng tôi khảo sát các yếu tố của phản ứng sau:
Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Chuẩn bị 6 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-6 Hút chính xác vào
5 bình mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn Thêm vào cả 6 bình 0,3ml thuốc thử vanillin và 1ml thuốc thử acid perchloric, đặt bình vào bể điều nhiệt với các nhiệt độ tương ứng (50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC, 90ºC) trong 10 phút, sau đó làm lạnh nhanh, thêm acid acetic băng đến vạch và đo quang tại bước sóng 550nm, bình 6 là mẫu trắng Kết quả được trình bày trong bảng 12
Bảng 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang
Hình 12 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang
Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, ở nhiệt độ 70-90ºC mật độ hấp thụ quang đạt cực đại và không thay đổi nhiều Vì thế ở các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành phản ứng ở nhiệt độ 70ºC
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Chuẩn bị 8 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-8 Hút chính xác vào
7 bình (từ 1-7) mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn Thêm vào cả 7 bình 0,3ml thuốc thử vanillin và 1ml thuốc thửacid perchloric, lắc đều Cho vào bểđiều nhiệt ở70ºC trong những khoảng thời gian nhất định (5 phút, 10 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút), sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá, thêm acid acetic băng đến vạch, lắc đều và đo độ hấp thụ tại 550nm Bình 8 là mẫu trắng
Kết quả khảo sát thu được như bảng 13
Bảng 13 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang
40 50 60 70 80 90 100 nhiệt độ (ºC) mật độ quang (abs)
Hình 13 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy sau 20 phút phản ứng, độ hấp thụ đạt cực đại và gần như không thay đổi khi tăng thời gian Vì thế ở các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành phản ứng trong thời gian 20 phút
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin/acid acetic băng
Tiến hành:Chuẩn bị 6 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-6 Hút chính xác vào 5 bình (từ 1-5), mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn.Thêm vào cả 6 bình lượng thuốc thử vanillin tương ứng như trong bảng và 1ml thuốc thử acid perchloric, lắc đều Cho các bình vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ 70ºC trong 20 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá, thêm acid acetic đến vạch, lắc đều và đem đo độ hấp thụ ở 550 nm Bình 6 là mẫu trắng Kết quả thu được như bảng 14:
Bảng 14 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Thể tíchvanillin (TT) (ml) 0,1 0,3 0,6 0,9 1,2 Nồng độ vanillin (TT) (mg/ml) 0,5 1,5 3 4,5 6 Mật độ quang (abs) 0,366 0,545 0,708 0,692 0,679
Hình 14 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy khi dùng 0,6ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng (tương ứng với nồng độ thuốc thử là 3mg/ml) thì mật độ quang đạt giá trị cực đại Do đó trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi chọn giá trị này để khảo sát
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric
Chuẩn bị7 bình định mức dung tích 10ml, đánh số từ 1-7 Hút chính xác vào
6 bình (từ 1-6), mỗi bình 1,5ml dung dịch chuẩn, làm khô đến cắn.Thêm vào cả 6 bình 0,6ml thuốc thử vanillin và 1 lượng thuốc thử acid perchloric tương ứng như trong bảng, lắc đều Cho các bình vào bể điều nhiệt ởnhiệt độ 70ºC trong 20 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá, thêm acid acetic đến vạch, lắc đều và đem đo độ hấp thụ ở 550nm Bình 7 là mẫu trắng
Bảng 15 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloeric
Thể tích thuốc thử (ml) 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 Nồng độ thuốc thử (g/ml) 0,424 0,848 1,526 1,696 2,12 2,544 Nồng độ thuốc thử (ml/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 Mật độ quang (abs) 0,33 0,522 0,605 0,625 0,634 0,613
Nồng độ thuốc thử vanillin (mg/ml)
Hình 15 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric
Nhận xét: Khi thể tích acid perchloric từ 1,2ml đến 2,4ml thì mật độ quang đạt giá trị cực đại và không có sự thay đổi nhiều Do đó, chúng tôi chọn thể tích acid perchloric là 1,2ml (tương ứng nồng độ1,526g/ml hay 0,12ml/ml) để khảo sát
Kết luận: Từ kết quả quá trình khảo sát chúng tôi đưa ra điều kiện định lượng như sau:
- Nhiệt độ phản ứng: 70ºC
- Thời gian phản ứng: 20 phút
- Bước sóng đo quang: 550 nm
- Nồng độ thuốc thử vanillin/ acid acetic băng : 0,6 ml (3mg/ml)
- Nồng độ thuốc thử acid perchloric: 1,2 ml (1,526 g/ml) c) Thẩm định phương pháp
Xác định khoảng tuyến tính
Chuẩn bị các bình định mức dung tích 10 ml được đánh số thứ tự Hút chính xác vào 6 bình định mức các thể tích dung dịch chuẩn lần lượt là 0,4ml, 0,8ml, 1,2ml, 1,6ml, 2ml, 2,4ml bốc hơi trênbếp cách thủy ở80ºC đến cắn Lần lượt cho vào cả các bình này 0,6 ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng, 1,2 ml thuốc thử acid perchloric rồi ủ ở 70ºC trong 20 phút Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch Lắc đều, đo độ hấp thụ quang tại 550nm
Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa chất chuẩn.Kết quả được trình bày ở bảng 16 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở hình 16
Nồng độ thuốc thử acid perchloric (ml/ml)
Bảng 16 Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn
Khối lượng acid oleanolic (mg) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Thể tích acid oleanolic (ml) 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4
Nồng độ chất chuẩn (àg/ml) 4 8 12 16 20 24
Mật độ quang (abs) 0,201 0,393 0,564 0,81 0,968 1,202 Phương trình hồi qui tuyến tính y = 0,0498x – 0,0079
Hình 16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng 550 nm
Từ kết quả ở bảng 14 và hình 13 cho thấy với nồng độ của acid oleanolictrong dung dịch đo quang từ 4-24 àg/ml cú sự tương quan tuyến tớnh giữa độ hấp thụ quang và nồng độ acid oleanolic theo phương trình y = 0,0498x – 0,0079với hệ số tương quan R 2 = 0,9974
Khảo sát độ lặp lại của phương pháp Để xác định độ lặp lại của phương pháp, tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt, với cùng điều kiện chiết
Tiến hành: chuẩn bị bình định mức dung tích 10 ml Hút chính xác vào bình định mức 1 ml dung dịch thử,bốc hơi trên cách thủy ở 80ºC đến cắn Lần lượt cho vào bình này 0,6 ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng, 1,2 ml thuốc thử acid perchloric rồi ủ ở 70ºC trong 20 phút Sau đó làm lạnh nhanh trong cốc nước đá và thêm dung dịch acid acetic băng đến vạch Lắc đều, đo độ hấp thụ quang tại 550nm y = 0.0498x - 0.0079 R² = 0.9974
Nồng độ acid oleanolic (μg/ml)
Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ không chứa dung dịch thử Kết quả thu được như sau:
Bảng 17 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang
Mật độ quang trung bình (abs)
Hàm lượng saponin trung bình (%) m1
Kết quả ở bảng cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 1,094 %
