TỔNG QUAN
Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào mỏu nhỏ nhất, khụng cú nhõn, đường kớnh 3-4àm, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tuỷ xương Số lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng 150 - 450 × 10 9 /L Nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tủy, do tế bào gốc sinh máu tạo nên Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được 3000 tiểu cầu [23]
Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày Với điều kiện lắc liên tục ngoài cơ thể ở nhiệt độ phòng có thể lưu giữ tiểu cầu khoảng 5 ngày [23]
Tiểu cầu có kích thước 2-4mm, thể tích 7-8mm 3 Bình thường có 150-450×
10 9 tiểu cầu trong 1 lít máu ngoại vi [23]
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy tiểu cầu có một siêu cấu trúc phức tạp gồm lớp màng, các hạt, hệ thống vi ống, hệ thống các kênh mở [23]
Gồm 2 lớp lipid kép bao quanh tiểu cầu, là các glycoprotein quan trọng, đóng vai trò như các receptor bề mặt, là nơi diễn ra một số hoạt động đông máu của tiểu cầu [23] Các receptor chính của tiểu cầu được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Các receptor chính của bề mặt tiểu cầu [42]
Các loại receptor Glycoprotein (GP) bề mặt tiểu cầu
Cấu trúc Chức năng/ phối tử
GP IIb/ IIIa Integrin αIIbβ3
Receptor của fibrinogen, v-WF, fibronectin, vitronectin, thrombospondin
GP Ia/IIa Integrin α2β1 Receptor của collagen
GP Ib/IX/V Leucin Receptor của v-WF
GP VI Họ Receptor globulin miễn dịch Receptor của collagen
Các thành phần quan trọng của màng tiểu cầu: Glycoprotein Ib (GPIb): là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố vWF giúp cho tiểu cầu dính bám vào collagen Glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa): là protein màng, hoạt động phụ thuộc vào ion Ca, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đinh cầm máu Chức năng của chúng được thể hiện trong hình 1.1 [23]
Hình 1.1 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [23]
Ngoài ra, các phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserin (PS) có vai trò quan trọng trong quá trình đông máu, là chất nền ban đầu cho các phản ứng enzym tiểu cầu để tạo ra thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trong quá trình hoạt hóa tiểu cầu và là chất chủ vận mạnh gây nên quá trình ngưng tập tiểu cầu Màng tiểu cầu cũng có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong [42]
Hệ thống vi ống và vi sợi
Vi ống: nằm ngay cạnh màng tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị kích thích [23]
Vi sợi: gốm các sợi actin, liên hệ chặt chẽ với các vi ống và tham gia vào hoạt động tạo giả túc của tiểu cầu [23]
Hệ thống ống dày đặc
Hệ thống ống dày đặc gắn với calci lưỡng cực một cách chọn lọc và đóng vai trò kho dự trữ calci của tiểu cầu Đây cũng là nơi tổng hợp enzym cyclooxygenase và prostaglandin tiểu cầu [23,42]
Hệ thống các hạt đặc hiệu
Các hạt đặc: là các hạt dày đặc điện tử, chứa nhiều ADP, canxi, serotonin và các nucleotid khác Các chất này được giải phóng khi tiểu cầu bị kích thích và tăng cường độ ngưng tập tiểu cầu [23]
Các hạt α: chứa nhiều loại protein khác nhau là: yếu tố phát triển tiểu cầu (platelet derived growth factor - PDGF), fibrinogen, yếu tố V, vWF và nhiều protein quan trọng giúp cho hiện tượng dính của tiểu cầu như thrombospondin, fibronectin
Hệ thống các kênh mở
Gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu, các hạt tiểu cầu phóng thích các chất qua hệ thống kênh này [23]
Hình 1.2 Cấu trúc của tiểu cầu [23]
Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [23] a Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu
Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn Khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương tiểu cầu nhanh chóng trải qua các quá trình bám dính, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, mà đỉnh điểm là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương Quá trình chuyển đổi tiểu cầu bất hoạt thành tiểu cầu hoạt hóa xảy ra theo một chiều dọc liên tục nhưng có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập, phóng thích các chất [6]
Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động bởi nitric oxid và prostacyclin từ tế bào nội mô các mạch máu Tế bào nội mô còn chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm quá trình kích hoạt ADP Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh bị suy yếu để lộ lớp dưới nội mô lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand, fibronectin, lamilin… [6,30,42] Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dòng máu cao Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GP Ia/IIa Những tương tác này cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [6,31] Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa collagen và GP VI gây ra sự kích hoạt GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với
GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, fibrinogen liên kết với GP IIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [6]
Giai đoạn ngưng tập Đây là hiện tượng tiểu cầu dính với nhau thành từng đám (nút tiểu cầu) Hiện tượng dính hoạt hoá tiểu cầu, tạo điều kiện cho hiện tượng ngưng tập (aggregation) xảy ra [23]
Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GP IIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng 4.000-5.000 phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt của nó Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [6,23,31]
Một số chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin , trong đó ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu
Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu
- Nguyên tắc: Đếm số lượng tiểu cầu trong một thể tích máu nhất định, từ đó tính số lượng tiểu cầu có trong 1 lít máu toàn phần
- Bình thường số lượng tiểu cầu trong máu tuần hoàn là 150-450 × 10 9 / L
- Số lượng tiểu cầu giảm trong: Xuất huyết giảm tiểu cầu, suy tuỷ xương, lơ xê mi cấp, sốt xuất huyết, sau tia xạ hoặc sau hoá trị liệu, do 1 số thuốc có độc tính với tiểu cầu, một số trường hợp trong hội chứng rối loạn sinh tuỷ, đông máu nội mạch lan toả
- Số lượng tiểu cầu tăng chủ yếu gặp trong hội chứng tăng sinh tuỷ
1.2.2 Đo thời gian máu chảy
- Khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ thoát ra ngoài, đồng thời hệ thống cầm máu bắt đầu hoạt động Hoạt động cầm máu gồm vai trò của thành mạch và của tiểu cầu Chất lượng của hoạt động này không tốt sẽ làm cho thời gian để cầm được máu dài hơn Xét nghiệm thời gian máu chảy là tạo ra tổn thương mạch máu và đo thời gian từ lúc máu chảy đến khi máu ngừng chảy [7]
- Nguyên lý: Dùng kim chủng tạo một vết thương nằm ngang ở vùng giữa dái tai và đo thời gian máu chảy [9]
- Trị số bình thường: 2 - 4 phút và được coi là máu chảy kéo dài khi thời gian này trên 6 phút [9]
- Nguyên lý: Đo thời gian máu chảy của các vết thương ở mặt duỗi cẳng tay, dưới 1 áp suất đã định [9]
- Trị số bình thường: 3-8 phút [9]
- Thời gian máu chảy kéo dài trong trường hợp số lượng tiểu cầu giảm, thường thấy khi tiểu cầu giảm dưới 75 × 10 9 /L hoặc bất thường chức năng tiểu cầu, giảm yếu tố vWF, giảm fibrinogen hoặc bệnh lý thành mạch [9]
1.2.3 Nghiệm pháp co cục máu đông
- Nguyên lý: Máu ra khỏi thành mạch sẽ bị đông, máu đông là máu chuyển thành dạng rắn nhờ hình thành các sợi fibrin Mạng lưới sợi fibrin ôm lấy các thành phần hữu hình rồi co rút lại tạo nên cục máu đông tách rời khỏi phần huyết thanh
Cục máu đông co được là nhờ vai trò của tiểu cầu và của fibrin [7]
- Nguyên tắc: Định tính hay định lượng mức độ co của cục đông fibrin sau khi máu đã đông trong ống nghiệm được để ở bình điều nhiệt nước 37 0 C [9]
- Bình thường cục máu sẽ co hoàn toàn, tách khỏi thành ống nghiệm sau 3 giờ [2]
- Co cục máu không bình thường (không co hoặc co không hoàn toàn) gặp trong những trường hợp giảm số lượng hoặc bất thường về chức năng của tiểu cầu, tăng fibrinogen máu, đa hồng cầu [2]
- Nguyên lý: Để kiểm tra sức bền của mạch máu, đặc biệt các mạch máu nhỏ, dưới da, người ta tạo ra một áp lực của máu tác động lên mạch bằng cách ngăn cản máu trở về để tăng khối lượng máu cục bộ trong lòng mạch [7]
- Nguyên tắc: dùng huyết áp kế duy trì một áp lực 90-100 mmHg ở cánh tay trong 5 phút, sau đó đếm số nốt xuất huyết ở phía dưới phần garo [2]
- Dấu hiệu dây thắt dương tính khi xuất hiện trên 5 nốt xuất huyết [2]
- Nghiệm pháp dương tính trong những trường hợp giảm số lượng tiểu cầu, bất thường về chức năng tiểu cầu, bất thường cấu trúc mạch máu [2]
1.2.5 Phân tích chức năng tiểu cầu – PFA (platelet function analysis)
- Nguyên lí: PFA-100 là hệ thống xét nghiệm được kiểm soát bằng vi xử lý, dùng để đánh giá chức năng tiểu cầu trong máu toàn phần chống đông với citrate
Hệ thống này mô phỏng quá trình cầm máu ban đầu xảy ra sau một tổn thương mạch máu Về cơ bản, hệ thống PFA-100 bao gồm hộp chứa mẫu máu, ống mao dẫn (đường kớnh trong: 200àm), và một màng chắn (cellulose ester) với lỗ trung tõm cú đường kớnh 150àm Màng chắn cú chứa cỏc chất kớch thớch kết tụ tiểu cầu gồm 2 àg collagen + 10àg epinephrine (gọi tắt là CEPI), hoặc 2 àg collagen + 50 àg adenosine diphosphate (gọi tắt là CADP) Ống mao dẫn tạo thuận lợi cho sự dịch chuyển của dòng máu đi từ ngăn chứa mẫu đến màng chắn với một tốc độ có kiểm soát Mẫu máu được chống đông với citrate 3,8%, cho vào ngăn chứa mẫu và ủ trong thiết bị ở 37 o C Dưới lực hút chân không cố định, dòng máu dịch chuyển với lực xé cao đi qua lỗ trung tâm Với sự hiện diện của các chất kích thích kết tụ tiểu cầu trên màng chắn và lực xé cao của dòng máu tại lỗ trung tâm, tiểu cầu sẽ hoạt hóa và kết tụ ở vùng xung quanh lỗ, tạo thành nút chặn tiểu cầu và cuối cùng lấp kín lỗ trung tâm Thiết bị sẽ theo dõi dòng máu đi qua lỗ trung tâm và ghi nhận thời gian cần thiết để hình thành nút tiểu cầu lấp kín hoàn toàn lỗ trung tâm Chức năng tiểu cầu thể hiện qua thời gian lấp kín (closure time = CT), là thời gian hình thành nút tiểu cầu để lấp kín hoàn toàn lỗ trung tâm Thời gian lấp kín khi dùng CEPI được gọi tắt là CEPI CT, thời gian khi sử dụng CADP gọi là CADP CT [33]
Hình 1.7 Nguyên lí hệ thống PFA-100 [33]
1.2.6 Đánh giá độ ngƣng tập tiểu cầu
- Nguyên lí:Khả năng ngưng tập của tiểu cầu xảy ra khi cho thêm chất kích tập từ ngoài vào như ADP, collagen phản ánh một trong những chức năng quan trọng của tế bào này Kỹ thuật đo độ ngưng tập tiểu cầu qua sự thay đổi mật độ quang học (phương pháp đo quang) hoặc độ trở kháng được sử dụng rộng rãi để đánh giá chức năng tiểu cầu [3]
- Nguyên lý của phương pháp đo quang: thiết bị đo độ ngưng tập tiểu cầu bằng phương pháp quang học là một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định
Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giầu tiểu cầu và một chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu Khi đo, sử dụng một mẫu huyết tương giầu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 0% Đồng thời sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu của cùng mẫu máu để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100% Khi cho chất kích tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrine, arachidonic acid, ristocetin vào huyết tương giầu tiểu cầu sẽ xẩy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đám vì vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độ ngưng tập tiểu cầu Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giầu tiểu cầu trong đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [20]
Hình 1.8 Nguyên lí của xét nghiệm ngƣng tập tiểu cầu [40]
- Ngưng tập tiểu cầu bị thay đổi trong nhiều bệnh rối loạn chức năng tiểu cầu bẩm sinh và mắc phải Ví dụ như ngưng tập tiểu cầu bị giảm với chất kích tập là ristocetin ở những bệnh nhân có hội chứng Bernard Soulier (thiếu GP Ib) hoặc vWF; giảm ngưng tập với ADP ở những bệnh nhân dùng aspirin [2]
Các thuốc kháng tiểu cầu
Thuốc kháng tiểu cầu là thuốc ức chế các quá trình kết dính, hoạt hóa, ngưng tập và liên kết với viêm của tiểu cầu [19] Điều trị chống ngưng tập tiểu cầu có thể tấn công lên các mục tiêu trên con đường của quá trình ngưng tập tiểu cầu và đó là các đích tác dụng của các thuốc kháng tiểu cầu như: Cyclooxygenase (COX): COX-1 tiểu cầu; thụ thể ADP; glycoprotein kết dính tiểu cầu như: GP Ib, GP Ia/IIa, GP VI, ; thrombin; sản phẩm AMP vòng; thụ thể Gp IIb/IIIa trên bề mặt tiểu cầu, (hình 1.9) [21]
Hình 1.9 Các đích tác dụng của các thuốc ức chế ngƣng tập tiểu cầu [21]
Một số thuốc kháng tiểu cầu a Aspirin
Aspirin là thuốc chống ngưng tập tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng hiện nay Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: Aspirin ở liều thấp có tác dụng ức chế chọn lọc enzym cyclooxygenase 1 (COX-1) là enzym xúc tác bước đầu trong quá trình biến đổi acid arachidonic thành PGH2 PGH2 là chất trung gian không bền và là cơ chất của nhiều isomerase tạo ra ít nhất 5 prostanoid có hoạt tính sinh học khác nhau trong đó có Thromboxan A2 (TXA2) TXA2 được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu để đáp ứng lại một số tác nhân kích thích (collagen, thrombin, ADP) và nó gây ra NTTC bất hồi phục thông qua thụ thể TXA2 Aspirin ức chế COX-1 dẫn đến ức chế sự sinh tổng hợp TXA2, do đó có tác dụng ức chế NTTC gây ra bởi một số tác nhân kích thích (ADP, collagen, thrombin) Sự ức chế này rất mạnh, diễn ra trong suốt đời sống của tiểu cầu vì tiểu cầu không thể tổng hợp thêm COX-1 mới [19] Cơ chế tác dụng ức chế NTTC của aspirin được tóm tắt ở hình 1.10
Bên cạnh tác dụng ức chế NTTC, aspirin còn ức chế sự tổng hợp chất prostaglandin kháng đông là PGI2 của tế bào nội mạc thông qua việc ức chế men prostacyclin synthetase, do đó gián tiếp kích thích NTTC Tuy nhiên tác dụng này không mạnh bằng tác dụng ức chế men cyclooxygenase và tác dụng này cũng không kéo dài vì tế bào nội mạc có thể tổng hợp ra men mới [19]
Hình 1.10 Cơ chế ức chế ngƣng tập tiểu cầu của aspirin [32] b Dipyridamol
Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: Làm tăng nồng độ AMP vòng của tiểu cầu dẫn đến ức chế thromboxan A2, đồng thời gián tiếp tăng nồng độ adenosin Thuốc có tác dụng chống NTTC nhưng không làm kéo dài thời gian chảy máu [19] c Ticlodipin
Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: Do ticlopidin tưong tác với glycoprtein IIb/IIIa receptor của fibrinogen làm ức chế sự gắn fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa, ngăn cản sự kết dính tiểu cầu Ngoài ra, thuốc còn làm tăng prostaglandin D 2 và E2 góp phần chống đông vón tiểu cầu và tăng thời gian chảy máu [18] d Clopidogrel
Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: ức chế chọn lọc thụ thể ADP của tiểu cầu, ngăn cản sự hoạt hóa glycoprotein IIb/IIIa của fibrinogen trên tiểu cầu, làm giảm gắn fibrinogen vào tiểu cầu [18] e Các chất ức chế glycoprotein IIb/IIIa receptor: Abcimab, Eptifibatid, Tirofiban, … [18].
Vài nét sơ lƣợc về hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Sâm vũ diệp, còn gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem.[15]
Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng, họ ngũ gia bì (Araliaceae) [15] Đặc điểm hình thái: cả hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình thái tương đối giống nhau: Cây thân thảo, sống nhiều năm; cao 0,25 – 0,7 m; đường kính thân từ 0,3 – 0,6 cm Thân rễ mập, phân nhánh, nằm ngang và thường nổi trên mặt đất; đường kính 1,5 – 3,5 cm Phần thân mang 3 – 5 lá, mọc vòng ở đỉnh thân;
Lá kép chân vịt, thường gồm 3 – 5 lá chét, mép khía răng cưa Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm Hoa mẫu 5, bầu 2 ô Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ Hạt 2, hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [15,50,52] Đặc biệt, khác biệt rõ nhất của hai loài là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, còn Tam thất hoang thì không
Hình 1.11 Sâm vũ diệp [15] Hình 1.12 Tam thất hoang [15]
1.4.2 Thực trạng và phân bố
Loài Panax bipinnatifidus Seem được Seemann phát hiện đầu tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ, và được công bố trên tạp chí J Botany năm 1868 Đến nay được ghi nhận phân bố tự nhiên ở Trung Quốc, Bhutan, Ấn Độ, Nepal, Myanmar và Việt Nam [50,52]
Loài Panax stipuleanatus được hai nhà khoa học người Trung Quốc (Tao
Hse Tsai và Kuo Mei Feng) công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica Sinica Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Maguan, Trung Quốc (gần Việt Nam) ở độ cao 1100-1700m so với mặt nước biển Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở Đông-Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc Gia Hoàng Liên thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [15,50]
Việt Nam: Các kết quả điều tra đến nay cho thấy hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang mới chỉ thấy có phân bố tự nhiên ở sườn đông bắc dãy Hoàng Liên Sơn và một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và
Sa Pa của tỉnh Lào Cai [15,16] Đến nay phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, các quẩn thể của chúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ
1.4.3 Thành phần hóa học a Sâm vũ diệp
Thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp được phát hiện có nhiều saponin khung dammaran và oleanan Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponins khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [49] Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C (1-3) và các chất narcissiflorine methyl ester (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl ester (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl ester (8), momordinIIe (9), and stipuleanoside R2 methyl ester (10) (1-10, Hình 1.13) là thành phần chính của thân rễ cây Sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam [46]
Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp kết quả đã phân lập được một hỗn hợp saponin (11) bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11A) và β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid (11B), glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N-(1,3,4- trihydroxytridec-8-en-2-yl)heptacosanamid (12), dichaccarid: saccharose (13), saponin: 28-desglucosylchikusetsusaponin IV (14) từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trên được công bố phân lập từ cây này [8]
Hình 1.13 Hợp chất saponin khung oleanane từ thân rễ Sâm vũ diệp [46] b Tam thất hoang
Các kết quả nghiên cứu phân tích và tách chiết thành phần hóa học trước đây của Tam thất hoang chỉ ra rằng phần thân rễ của cây chứa nhiều saponin khung olean với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp
Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin dẫn chất acid oleanolic là stipuleanosid R1 và R2 (16-17), từ dịch chiết methanol của thân rễ Tam thất hoang [45]
Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của cây Tam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [34]
Gần đây, năm 2010, đặc biệt từ rễ của cây Tam thất hoang ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc công bố xác định 15 hợp chất saponin (1-15, Hình 1.14) khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester
(1), 3 hợp chất polyyn (16-18), một sesquitecpen (19) và một acid béo (20) [28, 29].
Trong đó, hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyn 16 và polyyen 17 thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) với giá trị IC50 từ 0.13 đến 41.45 μM theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) qua phân tích hình thái tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trình apoptosis Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, một số hợp chất saponin 6-11 biểu hiện ức chế nhân tố sao chép NF-κB với giá trị IC50 từ 3.1 đến 18.9 μM trên dòng tế bào HepG2 liên quan đến khả năng chống ung thư và kháng viêm [27,36]
Hình 1.14 Thành phần hoá học của cây Tam thất hoang
Bảng 1.2 Các hợp chất saponin đã phân lập đƣợc từ Tam thất hoang
9 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D- glucuronopyranoside-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid methyl ester (9)
10 3-O-β-D-xylopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl-28-O- β-D-glucopyranosyl oleanolic acid (10)
Theo y học cổ truyền (Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam), Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng được dùng làm thuốc bổ giống như các loài Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, kích thích tạo máu, giảm cholesterol huyết, phòng chống xơ vữa động mạch, chống lão hoá, kích thích điều hoà miễn dịch, ngăn ngừa ung thư [5,22,24,43] Một số ít thí nghiệm trên động vật cho thấy, Sâm vũ diệp có tác dụng gây động dục, tăng sức dẻo dai, sức đề kháng của cơ thể, có tác dụng tán huyết [14]
Sách đỏ Việt Nam, 2007 ghi “tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”
1.4.5 Các nghiên cứu trong nước về hoá học và dược lý
Sâm vũ diệp và Tam thất hoang đã được ghi nhận trong các tài liệu cây thuốc và được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian, đặc biệt là các dân tộc miền núi Tây Bắc Tuy nhiên, ở nước ta nghiên cứu về thành phần hoá học, tác dụng sinh học và dược lý của hai loại sâm này là rất ít và tản mạn
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, đối tƣợng nghiên cứu
Thân rễ Tam thất hoang được thu hái tại Hoàng Su Phì, Hà Giang vào ngày 2/08/2016 Mẫu được giám định tên khoa học là Tam thất hoang - Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên
Dược liệu, Viện Dược liệu
Dược liệu Tam thất hoang sau khi sơ chế, làm khô, ngâm cồn 70% trong 2 tuần ở nhiệt độ phòng sau đó chiết với cồn 70%, 3h/lần, tỷ lệ 1:8 (dược liệu : dung môi) ở nhiệt độ 70 o C Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến kiệt thu được cao tổng (ký hiệu PST) Cho cao tổng hòa tan vào nước cất Chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclomethan, n-butanol Các dịch chiết mỗi phân đoạn được gom lại, cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được 3 phân đoạn tương ứng là phân đoạn n-hexan (ký hiệu:
PSnH), phân đoạn diclomethan (ký hiệu PS DCM) phân đoạn n-butanol (ký hiệu:
PSBt) Các phân đoạn dịch chiết dược liệu được tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dược liệu, do PGS.TS Đỗ Thị Hà cung cấp (Hình 2.1)
Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang
1.Ngâm cồn 70%, 2 tuần , nhiệt độ phòng 2.Chiết cồn 70%, 3h/lần; DL/DM: 1/8, T O C
(70 O C) 3.Thu hồi dung môi dưới áp suât giảm
2 Chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan; diclomethan, n-butanol
3 Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Rễ Sâm vũ diệp được thu hái ở Sapa, Lào Cai vào ngày 15/07/2016 Mẫu được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu
Dược liệu Sâm vũ diệp sau khi sơ chế được cho vào bình chiết bằng thủy tinh có gắn hệ thống sinh hàn, chiết hồi lưu bằng cồn 70% , 3 lần, mỗi lần 3h [lần 1 tỷ lệ 1:3, lần 2-3 tỷ lệ 1:2 (dược liệu : dung môi)] Dịch chiết được gom lại và lọc qua giấy lọc Cô quay dưới áp suất giảm đến kiệt thu được cao tổng Sâm vũ diệp (ký hiệu: PBT) Cho cao tổng Sâm vũ diệp hòa tan vào nước cất Chiết phân bố lần lượt với từng loại dung môi là ete, ethylacetat và n-butanol Các dịch chiết mỗi phân đoạn được gom lại, cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được 3 phân đoạn tương ứng là phân đoạn ete (ký hiệu: PBEt), phân đoạn ethylacetat (ký hiệu: PBEA) và phân đoạn n-butanol (ký hiệu: PBBt) Các phân đoạn dịch chiết dược liệu được tiến hành tại bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, do TS Nguyễn Hữu Tùng cung cấp (Hình 2.2)
Chiết với EtOH 70%, 3 lần, 3h/lần
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp
Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức chúng tôi đã tiến hành thu thập máu từ những người tình nguyện đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ sau:
Tiêu chuẩn lựa chọn: người tình nguyện khoẻ mạnh, 20-25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin
Tiêu chuẩn loại trừ: có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lượng 450mL trong vòng 28 ngày trước
Tất cả các nghiên cứu được thực hiện vào buổi sáng với các tình nguyện viên nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20 gauge.
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp đo quang của Born (1962) để đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 của Mỹ [25]
Chuẩn bị mẫu: Máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh chống đông bằng natri citrate 3.8% (tỉ lệ 1:9) Ly tâm máu toàn phần (500 vòng ×
10 phút), lấy phần nổi là huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho vào ống falcon vô khuẩn có nút và giữ ở nhiệt độ phòng Ly tâm phần còn lại (3000 vòng × 10 phút), lấy phần nổi là huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) Cao chiết TTH và SVD ở các phân đoạn được hoà tan trong dung môi DMSO, sử dụng nồng độ nghiên cứu: 0.5;
1; 2; 5mg/mL Dùng DMSO 0.1% làm mẫu trắng, aspirin (1mg/mL) làm chứng dương
Tiến hành: Chia 450 àl PRP vào cuvet thuỷ tinh chứa khuấy từ Thờm lần lượt vào mỗi cuvet 50àl húa chất gồm DMSO 0,1%, aspirin (1mg/mL), cỏc nồng độ dịch chiết của các phân đoạn Sâm vũ diệp hoặc Tam thất hoang với các nồng độ (0.5, 1, 2, 5mg/mL) vào mỗi cuvet và ủ trong 3 phỳt ở 37 o C, sau đú cho thờm 5àl chất kích thích ngưng tập tiểu cầu (ADP) vào Tính phần trăm ngưng tập tiểu cầu (%NTTC) ở các ống PRP bằng cách so sánh lượng ánh sáng truyền qua các ống này so với ống chứng PPP (lượng ánh sáng truyền qua ống chứng PPP được coi là 100%) Lặp lại thí nghiệm 5 lần ở mỗi nồng độ
Quy trình thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.3
+50 àl DMSO 0.1% +50àl Asp 1 + 50 àl thuốc thử cỏc nồng độ 0.5; 1; 2; 5 mg/mL
Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm
Phương pháp phân tích số liệu: Độ ngưng tập tiểu của các mẫu thử và mẫu chứng dương được chuẩn hóa theo độ ngưng tập tiểu cầu của DMSO: coi độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (maximum platelet aggregation: MPA) của DMSO là 100%, MPA (%) của aspirin và các phân đoạn dịch chiết ở các nồng độ được tính theo công thức:
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0 Kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnet T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lô Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0.05
Máu toàn phần chống đông bằng citrate
450 àl ủ 3 phút ở 37 o C Đo độ ngƣng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 với chất kớch tập ADP (5àl)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả
Đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp trên độ ngưng tập tiểu cầu ở 4 mức liều 0,5 - 1 - 2 - 5 mg/mL, kết quả thu được như sau: a Tác dụng chống ngƣng tập tiểu cầu của phân đoạn tổng
Hình 3.1 Ảnh hưởng của phân đoạn tổng Sâm vũ diệp đến độ NTTC
(*: p