(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu IN VITRO của cao giàu saponin sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y, VN U KHOA Y – DƯỢC dP rm LÊ THỊ THANH HOA dic ine an NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG Sc ho ol of Me (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) Co p yri gh t© KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ VN U môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học sở, thầy cô giáo khoa tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em thời gian qua, giúp em hồn thành chương trình học ac y, Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Thị Thơm, PGS.TS Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ ngày rm đề tài, truyền cho em nhiều động lực kiến thức quý báu giúp em hoàn thành khoa luận cách tốt dP Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai ine an loài thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsaiet K.M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 tài trợ kinh phí giúp em hồn thành nội dung nghiên cứu Cảm ơn Khoa xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực thí nghiệm dic Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè, đặc biệt Me mẹ em quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hồn thành khóa luận of Lần đầu viết khóa luận, cố gắng khó tránh sai sót Em mong nhận góp ý thầy để khóa luận hồn thiện Co p yri gh t© Sc ho ol Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Thanh Hoa DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa Acid arachidonic Adenosin diphosphat Adenosin monophosphat Adenosin triphotphat CADP CEPI Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP) Collagen Epinephrin COX-1 CT Cyclooxygenase Thời gian lấp kín (Closure time) EtOH GP IC 50 Alcol etylic Glycoprotein Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration LC 50 MDA 50%) Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) Malondialdehyde MPA Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet Co p yri gh ac y, rm dP an ine dic Me ol ho Sc t© TXA2 vWF AUC HMWK PDGF CTAP aggregation) Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet aggregation) Ngưng tập tiểu cầu Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) Sâm vũ diệp Tam thất hoang of FPA NTTC PPP PRP SVD TTH VN U Kí hiệu AA ADP AMP ATP Thromboxan A2 Von-Willerbrand Diện tích đường cong Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen) Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor) Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue activating peptid) DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng Trang Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Bảng 3.2 Sâm vũ diệp Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Sâm vũ diệp ac y, VN U STT 26 27 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) cao giàu saponin Sâm vũ diệp 27 Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Tam thất hoang 29 Bảng 3.5 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Bảng 3.6 Tam thất hoang Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) cao giàu saponin an dP rm Bảng 3.3 Co p yri gh t© Sc ho ol of Me dic ine Tam thất hoang 30 30 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Sâm vũ diệp Tam thất hoang Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Các glycoprotein màng tiểu cầu chức chúng Cấu trúc tiểu cầu Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu ADP 11 Hình 1.6 Quá trình ngưng tập tiểu cầu 12 Hình 1.7 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Nguyên lí xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 19 20 22 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu in vitro với chất kết tập ADP Chỉ số Slope Chỉ số diện tích đường cong – AUC 23 24 25 Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp 28 Hình 3.2 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Tam thất hoang rm dP an ine dic Me of ol ho Sc t© gh yri Co p ac y, VN U Hình 1.1 Hình 1.2 3 31 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ VN U CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan Tam thất hoang Sâm vũ diệp .3 ac y, 1.1.1 Đặc điểm thực vật .3 1.1.2 Thực trạng phân bố rm 1.1.3 Công dụng tác dụng dược lý Sâm vũ diệp Tam thất hoang .4 1.1.4 Thành phần hóa học dP 1.2 Sinh lý học tiểu cầu 1.2.1 Cấu trúc tiểu cầu an 1.2.2 Chức tiểu cầu ine 1.3 Các xét nghiệm đánh giá chức tiểu cầu 13 1.3.1 Thời gian máu chảy 13 dic 1.3.2 Đo sức bền mao mạch .13 Me 1.3.3 Đếm số lượng tiểu cầu 14 of 1.3.4 Quan sát hình thái độ tập trung tiểu cầu tiêu nhuộm Giêmsa 14 ol 1.3.5 Co cục máu đông .14 ho 1.3.6 Đo độ dính tiểu cầu 15 Sc 1.3.7 Đo độ ngưng tập tiểu cầu 15 1.4 Các thuốc kháng tiểu cầu 16 t© CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 gh 2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu .18 yri 2.2 Phương pháp nghiên cứu .21 Co p CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết 26 3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Sâm vũ diệp 26 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Tam thất hoang .29 3.2 Bàn luận 32 3.2.1 Mơ hình nghiên cứu 32 VN U 3.2.2 Kết nghiên cứu 33 3.2.4 Hạn chế nghiên cứu 35 Kết luận 36 ac y, Đề xuất 37 Co p yri gh t© Sc ho ol of Me dic ine an dP rm TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, huyết khối ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao giới, nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu tim, đột quỵ thiếu máu VN U cục bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp…[41] Những nghiên cứu gần cho thấy yếu tố có vai trị quan trọng bậc đối q trình hình thành huyết ac y, khối tiểu cầu Sau kích hoạt, tiểu cầu thực trình bám dính, thay đổi hình dạng, ngưng tập, phóng thích chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục máu đơng, dẫn đến hình thành huyết khối [23] Trên lâm sàng, thuốc kháng tiểu rm cầu liệu pháp lý tưởng Một số thuốc kháng tiểu cầu có như: aspirin, clopidogrel, prasugrel, dipyridamol sử dụng rộng rãi dự phòng dP điều trị huyết khối, bên cạnh lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu số tác dụng phụ như: gây chảy máu, loét dày, giảm tiểu cầu Những hạn chế thúc đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu cầu mạnh tác dụng ine an phụ Bên cạnh thuốc tổng hợp, thuốc có nguồn gốc tự nhiên đối tượng quan tâm nghiên cứu [41] Việt Nam vùng đất nhiều lồi thảo dược q, có dic thuốc dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm loại nhân sâm, tam t© Sc ho ol of Me thất Tuy nhiên, thảo dược từ bao đời sử dụng trực tiếp chế biến thành nguyên liệu thô, chưa phát huy hết công dụng Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) xác định loài quý có nguy tuyệt chủng cao Việt Nam Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp Tam thất hoang dùng làm thuốc bổ loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi, giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15] Một số loài thuộc chi Panax nghiên cứu đầy đủ dược lý, hóa học độc tính Tuy nhiên Việt Nam giới, số lượng nghiên cứu tác dụng sinh học thành Co p yri gh phần hóa học hai lồi cịn hạn chế Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy rễ, Sâm vũ diệp Tam thất hoang có chứa saponin (chất có khả chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36] Giai đoạn trước đề tài, chứng minh Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) in vitro phân đoạn mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ete mức liều 1-2-5 mg/mL Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro phân đoạn mức liều: phân đoạn tổng mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol mức liều mg/mL, phân đoạn n-hexan mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL [19] Saponin thành phần phân đoạn n-butanol, nhiên butanol dung môi hữu cơ, có nhiều độc tính nên sản xuất VN U công nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất Để khắc phục hạn chế này, nhóm nghiên cứu PGS Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) Nguyễn Hữu Tùng ac y, (Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đưa quy trình chiết cao giàu saponin mà không dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang 20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp 14,44±0,14 % [8, 27] Liệu cao có cịn hoạt tính rm chống ngưng tập tiểu cầu khơng? Và tác dụng so với phân đoạn n-butanol nào? Để trả lời câu hỏi này, thực đề tài “Nghiên cứu dP tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro cao giàu saponin Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)”, với mục tiêu: Co p yri gh t© Sc ho ol of Me dic ine an Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp Tam thất hoang in vitro CHƯƠNG TỔNG QUAN VN U 1.1 Tổng quan Tam thất hoang Sâm vũ diệp 1.1.1 Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp, gọi Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc ac y, họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20] rm Sâm vũ diệp thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng năm để lại Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi vào mùa khô Lá kép chân vịt, mọc vòng ba một, mang 3-7 chét mỏng, khơng lơng, mép có đơi cạn hay sâu dạng thùy Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 dP thành tán đơn trục dài 15-20 cm thân, cuống hoa cỡ cm Qủa mọng, chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4] an Tam thất hoang gọi với tên khác Tam thất rừng, Dã tam thất, dic ine Bình biên tam thất, Thổ tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm vết thân để lại, phân nhánh Mỗi khóm ol of Me thường có thân mang Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với năm đài nhỏ, cánh hoa, nhị bầu Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, chín màu đỏ Hạt 2, màu xám trắng [4, 25] Co p yri gh t© Sc ho Hai lồi Sâm vũ diệp Tam thất hoang có hình thái tương đối giống Điểm khác biệt Sâm vũ diệp có xẻ thùy, cịn Tam thất hoang khơng [20] Hình 1.1 Sâm vũ diệp Hình 1.2 Tam thất hoang 3.1.1.2 Ảnh hưởng cao giàu saponin Sâm vũ diệp đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa cao giàu saponin Sâm vũ diệp N MPA (%) P so với lô dùng DMSO P so với lô dùng Aspirin VN U Thuốc dùng Lô DMSO 0,1 % 100 0,05 SVD 0,8 mg/mL 79,41±3,37 SVD 1,6 mg/mL 55,56±4,22 rm dP 0,05 an pANOVA 0,05) ho ol of Me dic ine an dP rm ac y, VN U 3.1.1.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu Sâm vũ diệp t© Sc Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation MPA) Co p yri gh Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation FPA) Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu cao giàu saponin Sâm vũ diệp (A: DMSO; B: Aspirin mg/mL; C: Sâm vũ diệp 0,1 mg/mL; D: Sâm vũ diệp 0,2 mg/mL; E: Sâm vũ diệp 0,4 mg/mL; F: Sâm vũ diệp 0,8 mg/mL; G: Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL) 28 Nhận xét: Từ hình 3.1 cho thấy, cao giàu saponin Sâm vũ diệp mức liều 0,8 mg/mL có tác dụng làm giảm tỷ lệ ngưng tập điểm cuối tương đương với Aspirin mg/mL, mức liều 1,6 mg/mL có tác dụng giảm tỷ lệ ngưng tập điểm cuối VN U mạnh chứng dương Aspirin mg/mL, lơ chứng âm DMSO khơng có tác dụng Tiểu cầu sau ngưng tập tối đa, có xu hướng phục hồi Có nghĩa sau kết tập thời gian (5 phút) Aspirin, phân đoạn cao giàu saponin Sâm vũ diệp ac y, có xu hướng phân rã ngưng tập, độ ngưng tập tiểu cầu tiếp tục giảm, thể xu hướng lên phía cuối đồ thị ngưng tập rm 3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu Tam thất hoang 3.1.2.1 Ảnh hưởng cao giàu saponin Tam thất hoang lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC) N AUC P so với lô P so với lô dùng DMSO dùng Aspirin an Thuốc dùng Lô dP Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) cao giàu saponin Tam thất hoang DMSO 0,1 % 255,05±20,90 Aspirin mg/mL 222,78±14,39 >0,05 TTH 0,1 mg/mL 270,83±30,82 >0,05 >0,05 TTH 0,2 mg/mL 232,71±30,07 >0,05 >0,05 TTH 0,4 mg/mL 204,70±19,81 >0,05 >0,05 TTH 0,8 mg/mL 149,89±15,46 0,05 TTH 1,6 mg/mL 67,84±15,38