Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu - ĐỐI TƯỢNG VÀ- 123docz.net

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

Đối tượng

Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm 2016 được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem. bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Phần dưới mặt đất được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ và bảo quản trong túi nilon. Mẫu được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp sau khi được sơ chế, làm khô, xay nhỏ được chiết bằng EtOH 50 % với tỷ lệ dung môi : dược liệu là 7:1, ở nhiệt độ 90 °C. Chiết 2h/lần, 3 lần/mẻ. Dịch chiết cồn 50 % thu được cô dưới áp suất giảm đến khi tạo thành cao lỏng (1:1).

Cao chiết toàn phần của Sâm vũ diệp còn nhiều tạp chất bao gồm các hợp chất ít phân cực, dầu béo và các thành phần saccarid tan trong nước. Loại bỏ các tạp chất ít phân cực, thân dầu: dùng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan theo tỷ lệ 1:1 qua 3 lần. Cất loại thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng. Lớp nước sau chiết lỏng-lỏng chứa toàn lượng saponin đã được loại dầu béo và tạp chất thân dầu. Loại bỏ các thành phần saccarid tan trong nước: sử dụng sắc ký hấp phụ bằng resin diaion HP-20, rửa giải bằng EtOH 96 %.

Dịch sau loại tạp được cất thu hồi dung môi dưới áp xuất giảm đến cao đặc, đem sấy chân không tại 55-60 °C trong 24 giờ, sử dụng máy xay dược liệu, nghiền cao thành dạng bột, rây qua rây 355, thu được cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp, bảo quản trong túi nilon kín tại nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Các phân đoạn chiết cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp được tiến hành tại bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, do TS. Nguyễn Hữu Tùng cung cấp (Hình 2.1) [27].

Hình 2.1. Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp [27]

Mẫu toàn cây tươi Tam thất hoang thu hái ở Sa Pa - Lào Cai ngày 26 tháng 10 năm 2015 được giám định tên khoa học là Tam thất hoang- Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng. Thân rễ Tam thất hoang rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ, thu được bột thô.

Bột thô Tam thất hoang chiết với EtOH 50 %, tỷ lệ dung môi : dược liệu là 10:1, ở nhiệt độ 90 °C, Chiết 1h/lần, 3 lần/mẻ. Dịch chiết cồn 50 % thu được, được cô dưới áp suất giảm, tạo cao lỏng (1:20).

Quá trình loại tạp được áp dụng phương pháp chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101, rửa giải bằng EtOH 80 %. Thu dịch rửa giải EtOH 80 %, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc, đem sấy chân không tại 55-60°C trong 24 giờ, sử dụng máy xay dược liệu, nghiền cao thành dạng bột, rây qua rây 355, thu được cao tam thất hoang, bảo quản trong túi nilon kín tại nhiệt độ phòng. Các quy

trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang được tiến hành tại khoa Hóa thực vật, viện Dược liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp (Hình 2.2) [8].

Hình 2.2. Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang [8]

Vật liệu nghiên cứu: xylanh 10 mL, 20 mL, kim lấy máu 20 G, ống nghiệm chống đông citrate, ống nghiệm sạch, ống đo mẫu, viên khuấy từ, đầu côn, micropipet, găng tay, máy ly tâm, máy đo độ ngưng tập tiểu cầu chronolog, ADP, dung môi (DMSO - Dimethyl sulfoxide), thuốc thử (cao dược liệu), thuốc chứng dương (aspirin – Aspegic 100mg).

Dịch chiết cồn 50%

Kiểm nghiệm dược liệu

Bột thô tam thất hoang

Cao lỏng 1:20

- Chiết EtOH 50%

- Dung môi/dược liệu (10/1) - To = 90oC

- Chiết 1h/lần 3 lần / mẻ.

Cô dưới áp suất giảm

Cột resin D101, EtOH 80%

Dịch rửa giải

Cao giàu hoạt chất

- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm - Sấy chân không tại 55-60oC, 24 h Kiểm tra TLC

Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở

Thu thập mẫu máu

Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức chúng tôi đã tiến hành thu thập máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh. Tuân thủ theo tuyên bố Helsinki về đạo đức nghiên cứu với đối tượng nghiên cứu là con người. Người tham gia nghiên cứu cần được biết về lý do, mục đích của nghiên cứu, các lợi ích, cũng như rủi ro của nghiên cứu, và ký đồng thuận tham gia nghiên cứu. Người tình nguyện đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ sau:

Tiêu chuẩn lựa chọn: người tình nguyện khoẻ mạnh, 20-25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin.

Tiêu chuẩn loại trừ: có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, ngườ i mới cho máu với lượng > 450 mL trong vòng 28 ngày trước.

Tất cả các nghiên cứu được thực hiện vào buổi sáng với các tình nguyện viên nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu. Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20 gauge.