Phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp đo độ đục của Born: đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 của Mỹ [34].

Chuẩn bị mẫu

Lấy 10-15 ml máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh chống đông bằng natri citrate 3,8 % (1:10); người tình nguyện phải nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu, có số lượng tiểu cầu từ 200-400 G/L, hematocrit bình thường.

Lắc đều để đảm bảo máu được chống đông hoàn toàn. Ly tâm ở tốc độ 500 vòng trong 10 phút, lấy phần nổi là huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho vào ống falcon vô khuẩn có nút và giữ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, ly tâm số huyết tương còn lại ở tốc độ cao 3000 vòng trong 10 phút, được huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP).

Pha Stock cao chiết giàu saponin của Tam thất hoang và Sâm vũ diệp nồng độ 200 mg/mL trong DMSO 10 %, Cao chiết phân đoạn giàu saponin của Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ở các phân đoạn được hoà tan trong dung môi DMSO, sau đó được pha loãng trong nước muối sinh lý để đạt nồng độ cuối cùng trong dung dịch nghiên cứu là 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 và 1,6 mg/mL. Dùng DMSO 0,1

% làm chứng âm. Nghiên cứu thăm dò từ giai đoạn trước của Lê Thị Tâm năm

2017 đã lần lượt thử Aspirin với các liều 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,75 mg/mL, 1 mg/mL thì nhận thấy với liều 1 mg/mL cho tác dụng tối ưu và đạt được mức ức chế kết tập tiểu cầu như mong muốn. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn liều này làm liều chứng dương.

Tiến hành đo mẫu trên máy Chrono - Log CA – 560

Cho 450 àl huyết tương nghốo tiểu cầu (PPP) + 50 àl DMSO 0,1 % vào cuvet thuỷ tinh khụng chứa bi khuấy từ. Chia lần lượt 450 àl huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) vào cuvet thuỷ tinh chứa bi khuấy từ. Thờm lần lượt vào mỗi cuvet 50 àl hóa chất gồm DMSO 0,1 %, Aspirin (1 mg/mL), các phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp hoặc Tam thất hoang với các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 mg/mL. Ủ trong 5 phút ở 37 °C. Nhấc ống vào vị trí đo (01 ống nghèo tiểu cầu, 01 ống giàu tiểu cầu vào các vị trí tương ứng trên máy). Cho 5 l chất kết tập ADP vào ống giàu tiểu cầu. Chờ máy chạy và đo mẫu tự động, đọc và ghi lại kết quả gồm: phần trăm NTTC tối đa (MPA), tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút được biểu diễn thông qua chỉ số Slope, diện tích dưới đường cong được biểu diễn dưới dạng AUC (Area under the aggregation curve). Lặp lại thí nghiệm 7 lần ở mỗi nồng độ. Quy trình thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.3.

Hình 2.3. Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu

Ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP

Hình 2.4. Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP Sử dụng chất kết tập ADP 5 àL: ADP bỏm vào receptor ADP trờn bề mặt tiểu cầu, làm giải phóng Canxi nội bào, kích thích giải phóng acid arachidonic từ màng phospholipid; dẫn tới thay đổi hình dạng tiểu cầu từ hình đĩa sang dạng hình cầu gai, tạo đáp ứng nguyên phát, sau đó có đáp ứng thứ phát bởi việc giải phóng hạt đặc thông qua hệ thống kênh mở (chất adenine nucleotide, serotonin, thromboxan được chứa trong hạt đặc của tiểu cầu). Đáp ứng này được gọi là sóng ngưng tập nguyên phát và thứ phát [5, 6, 37, 50]. Qúa trình này được chia thành 5 giai đoạn:

1- Trước khi đưa chất kết tập ADP vào cuvet.

2- Chất kết tập được thêm vào, đồ thì dạng đỉnh nhọn.

3- Ánh sáng truyền qua cuvet giảm, tiểu cầu thay đổi hình dạng (kết quả của việc ADP bám vào tiểu cầu).

4- Tăng ánh sáng truyền qua cuvet, tạo sóng ngưng tập nguyên phát.

5- Nếu kích thích không đủ mạnh, tiểu cầu sẽ không ngưng tập được (dữ liệu không hiển thị được). Nếu đủ mạnh, sẽ taọ sóng ngưng tập thứ phát của ADP – ngưng tập tăng lên. Sự uốn cong nhẹ ở cuối giai đoạn 4 (mũi tên) cho

thấy sự khởi đầu của sóng ngưng tập thứ phát; giải phóng 1 số thành phần trong tiểu cầu như: fibrinogen, serotonin, thromboxan và ADP, làm tăng đáp ứng ngưng tập [37, 50].

Các thông số nghiên cứu

Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation – MPA) được biểu diễn qua chỉ số Amplitude. Độ ngưng tập tiểu của các mẫu thử và mẫu chứng dương được chuẩn hóa theo độ ngưng tập tiểu cầu của DMSO: coi độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) của DMSO là 100 %, MPA (%) của Aspirin và cao giàu Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ở các nồng độ được tính theo công thức:

MPA (%) = % 𝑁𝑇𝑇𝐶 𝑐ủ𝑎 𝑎𝑠𝑝𝑖𝑟𝑖𝑛 ℎ𝑜ặ𝑐 𝑐á𝑐 𝑛ồ𝑛𝑔 độ

%𝑁𝑇𝑇𝐶 𝑐ủ𝑎 𝐷𝑀𝑆𝑂 0,1 % 𝑥 100 % [31]

Bên cạnh độ ngưng tập tiểu cầu tối đa MPA, thì tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) cũng là một chỉ số được quan tâm nhằm đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập, giai đoạn tiểu cầu được hoạt hóa. Slope được xác định bằng cách vẽ một đường tiếp tuyến với đường ngưng tập sau giai đoạn tiểu cầu biến dạng (giai đoạn 4) [37, 50].

Hình 2.5. Chỉ số slope

Mức độ NTTC được thể hiện thông qua chỉ số diện tích dưới đường cong (Area under the aggregation curve – AUC) tính từ thời điểm sau khi tiểu cầu biến dạng đến khi tiểu cầu ngưng tập tối đa. Đây là chỉ số quan trọng nhất vì nó phụ

thuộc vào cả tốc độ thay đổi ngưng tập (slope) và phần trăm ngưng tập tối đa (giai đoạn 4, 5) [30, 39]. Hiện nay, ba chỉ số này luôn được các nhà lâm sàng quan tâm trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu của người bệnh, và rất có giá trị trong phân loại các dạng bệnh lý tiểu cầu.

Hình 2.6. Chỉ số diện tích dưới đường cong - AUC Phương pháp phân tích số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Kết quả được biểu diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng Test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnett’T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lô. Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu