LUẬN văn THẠC sĩ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus)

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm

SVD còn có tên gọi khác là Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm, Ngật đáp thất [1,3]

Là cây thảo sống nhiều năm, cao 0,3 – 0,5 m Thân rễ mập, phân nhánh, nằm ngang và thường nổi trên mặt đất; rễ củ dài, nhiều đốt và mang nhiều vết sẹo do thân tàn lụi để lại, đầu rễ có hình con quay [1,15] Thân mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc [1], đường kính thân từ 0,3 - 0,6 cm [3] Lá kép chân vịt, mọc vòng ở ngọn, thường gồm 2 - 3 cái [3] Lá kép có 3 - 7 lá chét, thuôn dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông [1]

Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp [15]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 - 10 cm, mang từ 20 -

90 hoa; cuống hoa mảnh, dài 1 - 1,5 cm Hoa màu trắng lục, 5 lá dài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 - 3 ô, đầu vỏ nhụy chẻ đôi Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu Chứa 2 - 3 hạt, hình cầu, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt [1,3]

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

SVD đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh núi cao, ở độ cao từ 1600 – 2300 m [3] SVD sinh trưởng và phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh) Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của SVD Sau khi quả chín, từ tháng 9 đến tháng 10, toàn bộ phần thân trên mặt đất tàn lụi qua mùa đông để lộ ra những vết sẹo trên thân rễ khá rõ – dấu hiệu giúp cho xác định tuổi của cây Cũng vào lúc này chồi mới bắt đầu hình thành ở phía đầu thân rễ Phương thức sinh trưởng này làm cho phần thân rễ ngày một phát triển thêm về chiều dài [1]

Trong tự nhiên, SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan ( vùng cận Himalaya) và điểm phân bố cuối cùng của sâm vũ diệp về phía nam là Sa

Pa của Việt Nam, ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn ( Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên,…) Do hậu quả của nạn phá rừng và khai thác bừa bãi, vùng phân bố SVD ở nước ta đã bị thu hẹp dần, SVD đang phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng và việc bảo vệ đang được ưu tiên ở Việt Nam [1,16]

Hiện nay, SVD đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang và cho những kết quả khả quan [15,16]

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [7,12] Saponin là thành phần hoạt chất chính trong lá và thân SVD Trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [21,25,26]

Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid, majorosid F1 và bipinnatifidusosid

Rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid R0, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2

[1] Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm

10 saponin khung oleanan (hình 1.2) từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C và bảy hợp chất được biết bao gồm narcissiflorin methyl este, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl este, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid

RT1 methyl este, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl este [22]

Năm 2018, nhóm nghiên cứu Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 saponin từ thân rễ SVD là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester [16]

Me : methyl Ara(f) : -L-arabinofuranosyl Ara(p) : -L-arabinopuranosyl Glc : -D-glucopyranosyl Xyl : -D-xylopyranosyl

Hình 1.2 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp [22]

Bảng 1.1 Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp

Hiện nay, đã có 25 hợp chất saponin được xác định từ thành phần cây SVD

Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]

SVD thường được dùng trong một số bài thuốc truyền thống ở nước ta và Trung Quốc, nhưng chưa có nhiều tài liệu và công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý được công bố Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD trên động vật thí nghiệm cho thấy SVD có tác dụng tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [1], chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan, tăng cường hệ miễn dịch, có hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư…[9-11,13,18-20]

Theo đông y, SVD có công dụng hoạt huyết khứ ứ, tiêu đờm, giảm đau, thũng trướng tích tụ, đau gân cốt, rắn độc cắn, tâm vị khí thống, thổ huyết, chảy máu mũi, xuất huyết dạ dày,[1,3]…, một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [15], tốt cho phụ nữ sau đẻ và người cao tuổi SVD còn được dùng để ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm hoặc nấu cao rồi pha với nước hoặc rượu để uống có tác dụng kích thích sinh dục [1].

TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU

Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả nghên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinh nghiệm, nhu cầu và khả năng thực tiễn

Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu bao gồm việc mô tả, định tính, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết được và định lượng hoạt chất trong dược liệu [4]:

• Mô tả: Bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điểm thể chất của dược liệu

• Định tính: Là những phương pháp dùng đề nhận biết dược liệu, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

- Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn giản và truyền thống như sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu v.v

- Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học là việc quan sát đặc điểm của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay của bề mặt dược liệu dưới kính hiển vi

- Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực, v.v… của các dược liệu

- Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể

- Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao,,,, để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn

- Định tính huỳnh quang là quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hay của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thường hay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử Trừ khi có quy định riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm

- Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU mỏng có kích thước hơi lớn hơn Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín bằng một phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém Nhấc phiến kính ra và để nguội Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa

• Thử tinh khiết: Là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, tùy từng dược liệu mà có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:

- Mất khối lượng do làm khô

- Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric

- Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối

- Tỉ lệ vụn nát của dược liệu

- Hàm lượng kim loại nặng

- Dư lượng các chất bảo vệ thực vật

- Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác)

• Định lượng: Là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Định lượng bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Sâm vũ diệp trồng ở huyện Sa Pa, Lào Cai 6 năm tuổi được thu vào ngày 15/07/2016 Mẫu được giám định tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm (Araliaceae) bởi ThS Nguyễn Quỳnh

Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (DL -

150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu

Mô tả đối tượng nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt

Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 50 0 C đến hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu

Hình 2.1 Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại

Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng

- Dung môi hóa chất: Methanol (CH3OH), ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), acetonitrile (CH3CN), acid acetic (CH3COOH), nước cất hai lần,… dùng cho phân tích

- Thuốc thử: Acid sulfuric (Meck), acid acetic (CH3COOH) (Meck)

- Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254s (Meck)

- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ)

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic-Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUchi, Thụy Sĩ)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa – Thụy Sĩ)

- Cân xác định độ ẩm Precisa HA 60

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000ml

- Bình chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Kính hiển vi điện tử

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong…

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu SVD dựa trên các tiêu chí chung được quy định trong DĐVN V tại phụ lục 12.2 gồm: Mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, tạp chất, định tính, định lượng,…

Kiểm tra về hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan và kiểm tra kích thước bằng cách đo

Mẫu dược liệu SVD được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung dịch Cloramin 5 – 10%, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylene Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để soi các đặc điểm vi phẫu của dược liệu [4]

Dược liệu được làm khô rồi nghiển thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch soi, quan sát các được điểm của bột bằng kính hiển vi [4]

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6: cân chính xác khoảng 3g dược liệu đã cắt nhỏ, sấy trong tủ sấy ở 105°C, áp suất thường trong 5 giờ

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8

Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó: m: Khối lượng tro (g) M: Khối lượng mẫu thử (g) B: Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.6 Tro không tan trong acid

Xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.7:

Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi (nung trong

Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như tro toàn phần

Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.11: Cân khoảng 50g dược liệu dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp

Cân phần tạp chất và tính phần trăm:

Trong đó: a: Khối lượng tạp chất tính bằng gam p: Khối lượng mẫu thử tính bằng gam

Phương pháp sắc ký bản mỏng với điều kiện:

Pha động: Chọn một hệ dung môi đặc trưng cho nhóm saponin sau:

CH3OH-CH3CN-H2O (2:1:1, v/v/v) (Hệ III)

Pha tĩnh: Bản mỏng đế nhôm Silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 10% trong ethanol

+ Dung dịch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10ml methanol : nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký

+ Dung dịch đối chiếu 1: Lấy 1g mẫu bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10ml methanol : nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử

+ Dung dịch đối chiếu 2: Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml

Cách tiến hành: Trên bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254S, đã hoạt hóa ở 105°C trong 60 phỳt, chấm riờng biệt mỗi 5 àl mỗi dung dịch thử và cỏc dung dịch đối chiếu, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4 Sau khi triển khai hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi, phun thuốc thử Sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút Quan sát bản mỏng dưới ánh sang tử ngoại UV 365 nm và ánh sáng thường

Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được chụp ảnh lưu giữ Các giá trị hệ số di chuyển (Rf) của stipuleanosid R2 và các

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU vết chính được tính bằng tỷ số giữa đường đi của các vết đó trên đường đi của pha động

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo DĐVN V, phụ lục 5.3 a) Xây dựng phương pháp

Chuẩn bị dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình tam giác dung tích 100 ml, thêm chính xác 50 ml hỗn hợp methanol : nước tỷ lệ 70 : 30, cân, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung bằng hỗn hợp dung môi trờn lượng đó mất, lọc qua màng lọc kớch cỡ 0,45 àm được dung dịch để tiờm sắc ký

Dung dịch mẫu chuẩn: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol có các điểm nồng độ chính xác gồm: 18,75 àg/ml, 37,5 àg/ml, 75 àg/ml, 150 àg/ml, 200 àg/ml, 300 àg/ml và 400 àg/ml

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:

Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD như sau:

Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo

Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau

Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector

UV, FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU b)Thẩm định và đánh giá phương pháp

Thẩm định các điều kiện định lượng một saponin chính trong thân rễ SVD với chất đối chiếu của chất đó đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích Quy trình được đánh giá theo hướng dẫn của các tài liệu [5-7,25] bằng việc khảo sát các chỉ tiêu sau đây: Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Yêu cầu:

- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Độ tương thích hệ thống

Tính thích hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 % Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) Độ tuyến tính được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R 2

Cách xác định: Chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp Xác định sự tuyến tính giữa đáp ứng của pic và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử bằng phương trình hồi quy tuyến tính

Mô tả

Dược liệu là thân rễ SVD Thân rễ SVD nhiều đố t, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 0,5-1,5 cm Mă ̣t ngoài màu nâu, có những vết nhăn dọc, mảnh; những vết vân ngang nổi rõ chia thân rễ thành nhiều đốt, có nhiều sẹo do thân khí sinh hàng năm tàn lu ̣i để la ̣i Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nha ̣t Mùi thơm nhe ̣ đă ̣c trưng, vi ̣ đắng, hơi ngọt.

Vi phẫu

Lớ p bần gồ m 5 - 6 hàng tế bào hình chữ nhâ ̣t, thành hơi cong, màu lu ̣c, lớ p ngoài bi ̣ bong rách ra Mô mềm vỏ gồm những tế bào hình nhiều ca ̣nh dày lên ở góc, chứa nhiều ống tiết và tinh thể calci oxalat hình cầu gai

Các bó libe-gỗ xếp thành bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm, phân cách nhau bởi tia ruột rô ̣ng Gỗ gồ m những tế bào thành dày, đă ̣t trong mô mềm gỗ ít hóa gỗ

Tầng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe cấp hai và gỗ cấp hai, gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật có màng mỏng, xếp thành dãy đều đặn

Tia ruột rộng gồ m nhiều tế bào xếp theo hướng xuyên tâm

Ruột cấu ta ̣o bởi các tế bào để hở những khoảng gian bào, ống tiết ở vi ̣ trí ứng với các bó libe-gỗ ở cả phía trong lẫn phía ngoài

Soi bột

Màu vàng nâu Soi kính hiển vi thấy: những ha ̣t tinh bô ̣t hình bầu dục, kích thước không đều, rốn ha ̣t là mô ̣t va ̣ch Mảnh bần với những tế bào hình nhiều cạnh, thành dày màu vàng nâu Mảnh mô mềm gồm những tế bào màng mỏ ng, màu trắng Mảnh ma ̣ch va ̣ch, ma ̣ch ma ̣ng Rải rác có chất tiết màu nâu đen Tinh thể calci oxalat hình cầu gai

Bần Mô mềm Mô mềm chứa tinh bột

Mảnh mạch Đám tinh bột Chất tiết Tinh thể calci oxalate

Độ ẩm

Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu dược liệu SVD theo phương

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm ẩm (% )

Nhận xét: Độ ẩm các mẫu dược liệu SVD trung bình khoảng 8,17%, nằm trong ngưỡng an toàn theo qui định của DĐVN Để tránh cho dược liệu nhanh bị mốc do ẩm, qui định hàm ẩm dược liệu SVD không quá 10%.

Tro toàn phần

Tiến hành xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu kết quả được trình bày tại bảng 3:

Bảng 3.2 Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro toàn phần (% )

Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu SVD trung bình là 7,53%, mẫu cao nhất là trên 7,8% Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu không quá 8%.

Tro không tan trong acid

Sau khi tiến hành như mô tả ở mục 2.2.6, kết quả xác định được độ tro không tan trong acid của các mẫu dược liệu SVD như trình bày ở bảng 4 như sau:

Bảng 3.3 Kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro không tan trong acid (%)

Nhận xét: Kết quả cho thấy độ tro không tan trong acid trung bình của ba mẫu dược liệu SVD là 1,57% Dự kiến quy định độ tro không tan trong acid của dược liệu SVD không được quá 2,0%.

Định tính

Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.8

Kết quả: Quan sát dưới ánh sáng thường, sắc ký đồ bản mỏng của dung dịch thử (I) phải có các vết cùng màu, cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (II) và có một vết ở khoảng Rf 0,3 đến 0,5 có cùng màu và cùng Rf với sắc ký đồ của dung dịch chất chuẩn stipuleanosid R2 (III) (Hình 6)

Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp (Ký hiệu:

I: mẫu thử; II: mẫu dược liệu SVD đối chiếu; III: stipuleanosid R2)

Định lượng

Chương trình tiến hành dưới đây tiến hành theo phương pháp đã được nhóm nghiên cứu của thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy xây dựng như sau [17]: a) Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:

- Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector UV: bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết

- Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B)

Pha động được rửa giải theo chương trình như sau:

Bảng 3.4 Chương trình dung môi Thời gian

25-30 20 80 Đẳng dòng b) Thẩm định phương pháp phân tích

Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH

Pha dung dịch mẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 0,1 g cao ethanol thân rễ sâm vũ diệp (độ ẩm 4,7%) cho vào bình định mức 10 ml, thêm 7 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút để hòa tan, thêm methanol vừa đủ tới vạch Lắc đều, ly tõm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 àm

Pha dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 rồi pha thành dung dịch gốc tương ứng với nồng độ 1000 μg/mL trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 àm Pha loóng dung dịch chuẩn gốc với MeOH để thu được các dung dịch có nồng độ thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn

Tính thích hợp hệ thống

Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,15%; 2,75% và 1,21% đều thấp hơn 3% (Bảng 6) Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp

Bảng 3.5 Tính thích hợp của hệ thống

STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối

Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích ở trên Ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả thu được được trình bày trong các hình 7 sau:

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Kết quả cho thấy: trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Sắc ký đồ của dung dịch thử cho 1 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn Độ tuyến tính

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ một dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần) ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu Kết quả cho thấy tương

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU quan tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch theo phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R 2 = 0,9988 (Bảng 7 và hình 8) Trong khoảng nồng độ khảo sát 15,625 – 400 àg/ml cú sự tương quan tuyến tớnh chặt chẽ giữa diện tớch pic và nồng độ stipuleanosid R2 với hệ số tương quan rất cao

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2

(àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 Độ đúng

Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp đều cho độ thu hồi nằm trong khoảng và độ lệch chuẩn tương đối RSD Kết quả này chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp với định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu Sâm vũ diệp Kết quả được trình bày ở bảng 8 y = 2.6081x + 49.1185 R² = 0.9988

Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2

Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi

STT Lượng có sẵn (àg)

Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích HPLC đến khi tín hiệu của chất định phân tích trên sắc ký đồ có tỉ lệ S/N (tín hiệu/ nhiễu) đạt khoảng từ 2-3, trong đó S là chiều cao pic chất phân tích, N là chiều cao tín hiệu nhiễu trên nền lớn nhất Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với chất định phân tích

Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD

= 1,953 àg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 àg/ml

Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp c) Kết quả định lượng

Ta có sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 và của dược liệu SVD (Hình 9)

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu

Kết quả định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các mẫu SVD được trình bày tại bảng 9:

Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối

Nhận xét: Ta thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử nằm trong khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % trung bình 0,335 % ± 0,003 Giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD qui định trong tiêu chuẩn không được thấp hơn 0,3 %

Bàn luận

Nghiên cứu thực hiện trên mẫu dược liệu đã được giám định tên khoa học thu hái tại Sa Pa – Lào Cai năm 2016 Kết quả sẽ tốt hơn nếu thực hiện quan sát trên nhiều mẫu thu hái ở các vùng khác nhau

3.9.2 Về khảo sát các chỉ tiêu theo quy định trong Dược điển Việt Nam

Khi xây dựng tiêu chuẩn cho một dược liệu nghiên cứu đã đánh giá các chỉ tiêu về độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần, tỷ lệ tro không tan trong acid là những chỉ số đặc trưng giúp đánh giá chất lượng của dược liệu SVD trước khi đưa vào sử dụng Do thời gian và kinh phí không cho phép nên một số chỉ tiêu chưa thực hiện được như các tạp chất lẫn trong dược liệu, tỷ lệ vụn nát dược liệu, hàm lượng kim loại nặng, hàm lượng các chất có thể chiết đượctrong dược liệu bằng dung môi (nước, ethanol,…)

3.9.3 Về định tính Định tính chúng tôi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong ethanol rồi hơ nóng bản mỏng thấy có xuất hiện các vết chất ở cùng khoảng Rf và cùng màu với nhau cho thấy sự có mặt của chất stipuleanosid R2 Nghiên cứu đã đề xuất được hệ dung môi phù hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD bằng phương pháp SKLM

Chúng tôi đã xác định được hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu SVD thu hái ở Sa Pa bằng phương pháp HPLC

Kết quả thu được như sau: Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử nằm trong khoảng từ 0,332 % đến 0,338 % Do đó, giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD qui định trong tiêu chuẩn không được thấp hơn 0,3 %

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau:

- Đã khảo sát các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định trong DĐVN V, gồm: mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, định tính, định lượng

- Khảo sát, xây dựng được quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2

- Đây là nghiên cứu bước đầu góp phần từng bước hoàn thiện chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD của DĐVN trong tương lai Trên cơ sở kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu đề xuất dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD (phụ lục II).Trong đó, độ ẩm: không quá 10,0%; tro toàn phần: không quá 8,0%; tro không tan trong acid: không quá 2,0%; định lượng: hàm lượng stipuleanosid R2 không được thấp hơn 0,3 %

1 Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD

2 Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu SVD trong Dược điển Việt Nam

3 Đề xuất thầm định tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD.

[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr 711 – 714

[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 285-

[3] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản

Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr 85 – 87

[4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học

[5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc

[6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113,

[7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương

(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 326 – 338

[8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr 19-58

[9] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 464 - 466

[10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh

(2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200

[11] Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis

Ha et Grushv Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr 25-27

[12] Trần Công Luận (2002), Phân tích thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr 1-

[13] Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr 17-23

[14] Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2013), "Họ nhân sâm(Araliaceae Juss.)- nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam", Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, tr

[15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76

[16] Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr 177-180

[17] Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Huệ, Đặng Thị Thùy, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dương Thị Phượng, Phạm Thị Tuyết Nhung, Hà Vân Oanh, Dương Thị Ly Hương, Nguyễn Hữu Tùng (2018), “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai”, Tạp chí Dược liệu, 2(23), tr 82-88

[18] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 202-206

[19] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005), "Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của lá sâm Việt Nam - Tác dụng chống stress và tác dụng chống oxy hóa", Tạp chí Dược liệu, 10(1), tr 27-32

[20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp

[21] Gurung B, Bhardwaj PK et al (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp 234-238

[22] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L

Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420

[23] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al

(1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599

[24] Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636

[25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva

[26] Zhang Y, Shi C et al (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus

Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp 79-87

PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA

PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP

Sâm vũ diệp (thân rễ)

Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất

Thân rễ đã phơi và sấy khô của cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), họ Nhân sâm (Araliaceae)

Tiêu đề	Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus)
Tác giả	Nông Mỹ Hoa
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc Gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,38 MB