NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG ppt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG HẢI TOÀN NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA Pangasius hypophthalmu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

DƯƠNG HẢI TOÀN

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ

VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus)

GIAI ĐOẠN GIỐNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

2006

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ

tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn

giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite Green và một số biến đổi sinh hóa trên cá tra Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l trong 12 giờ và 1mg/l trong 60 phút Kết quả cho thấy hoạt tính của các men trong não, gan của cá Tra đều bị biến đổi và khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG Sau 60 ngày thí nghiệm MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ABSTRACT

“Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in

the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented

from March to July 2006 The aim of the study was to determine the changes

of some biomarkers and the residues of MG on catfish The experiment included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours, each applied in 3 replicates The results showed that the biomarkers activity in brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the treatment After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish (2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb)

Keywords: Malachite Green, biomarker, residue

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CÁC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về Malachite Green 3

2.1.1 Sơ lược về Malachite Green 3

2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite Green 3

2.1.3 Độc tính của Malachite Green 4

2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green 5

2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green trên thế giới 5

2.2.2 Tính hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam 6

2.3 Ảnh hưởng của Malachite Green 6

2.4 Một số nghiên cứu về chỉ tiêu sinh hóa LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD 7

CHƯƠNG 3: 9

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 9

3.1.1 Địa điểm 9

3.1.2 Thời gian thực hiện 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 9

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 9

3.2.2 Cá thí nghiệm 9

3.2.3 Bố trí thí nghiện 10

3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu 10

3.2.5 Chuẩn bị mẫu 11

3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu 11

3.3 Xử lí số liệu 16 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 4 17

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm Malachite Green 17

4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 19

4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green 20

4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green 21

4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green 22

4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 23

4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 23

4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 25

4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 26

4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 27

4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 28

CHƯƠNG 5 30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề xuất 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

PHỤ LỤC 34 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green

trên cá da trơn 4

Bảng 2: Quá trình phân tích AchE 12

Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA 13

Bảng 4: Quá trình phân tích GST 14

Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH 14

Bảng 6: Quá trình phân tích CAT 15

Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin 16

Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG 17

Bảng 9: pH trong quá trình gây nhiễm MG 18

Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhi ễm MG 18

Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm 19

Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm 21

Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm 22

Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AchE trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu 23

Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu 25

Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu 26

Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu 27

Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu 28

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 20

Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm 22

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

TCA Trichloroacetic acid

DMSO Dimethyl sulfoxide

TBA Thiobarbituric acid minimum

DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước ngọt, là nơi có tiềm năng rất lớn cho việc nuôi các loài cá nước ngọt như: Cá tra,

basa, vồ đém, hú, tra bần…trong đó cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng

được nuôi chính và truyền thống Đối tượng này được người nuôi ưa chuộng vì có những ưu điểm như: dễ nuôi, tăng trọng nhanh, kích cở lớn dễ thích nghi với môi trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao

Trong những năm gần đây, do việc quảng bá, thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng cá tra của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam được nâng cao rất nhiều Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, Cần Thơ năm

2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài

cá này trong khu vực An Giang và Cần Thơ năm 2004 là trên 160.000 tấn (Cục thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005) Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ thả nuôi tăng (120-130 con/m3 trong nuôi bè và 25-35con /m2 trong nuôi ao đất (Nguyễn Chính, 2005)

Tuy nhiên vì muốn gia tăng năng suất, sản lượng mà người nuôi đã thả mật độ dày đặc, cho thức ăn thừa dẫn đến môi trường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra dẫn đến việc sử dụng các loại thuốc, hoá chất trong phòng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi là vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị Phương Nga, 2004) Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng như là Malachite Green

Chất Malachite Green được dùng rất phổ biến trên thế giới trị các bệnh nấm bên ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể) Đó là một loại thuốc trị nấm rất công hiệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các bể ương cá giống Chất Leucomalachite green (LMG) là chất được tạo thành trong quá trình chuyển hóa của Malachite Green và thường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay Malachite Green không còn tồn lưu nữa (CFIA, 2005) Chính vì sự tồn lưu này ảnh hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada, Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu của các doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả về do phát hiện nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005) Ngoài ra việc sử dụng hoá chất còn ảnh hưởng đến một số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống của cá

Do đó đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số

chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn

giống” được thực hiên là rất cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu và Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

đào thải của Malachite Green trên cá tra và một số biến đổi sinh hóa Từ đó đề xuất giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn

Nội dung nghiên cứu:

• Ảnh hưởng của sử dụng Malachite Green lên sự biến đổi Acetylcholine, lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate

dehydrogenase, Catalase trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn

giống

• Phân tích sự tồn lưu Malachite Green trong cá tra (Pangasius

hypophthalmus) ở giai đoạn giống

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN

2.1.1 Sơ lược về Malachite green

Malachite Green ( MG) có tên hóa học là Triphenylmethane MG là một loại bột

rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó Từ lâu MG được

xem là chất diệt nấm ( loại saprolegnia ssp ) và diệt ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa) MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS04) mà còn gọi

là phèn xanh dùng để diệt ốc, diệt nấm và rong rêu trong nông nghiệp MG đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng một cách rộng rãi từ lâu để phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến Tại Canada trước 1992 các trại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm Ngày nay Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc

và Việt Nam đều nghiêm cấm việc sử dụng chất MG trong việc nuôi trồng thủy

sản Chloramphenicol, Nitrofurans , xanh Malachite được liệt kê trong danh mục

các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam Tại VN, MG vẫn còn được các

hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để vệ sinh ao hồ, tắm cá trước khi thả chúng vào lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng Khi vào cơ

thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leucomalachite

Green (LMG) Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn

tại trong 1 thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm

MG.( www.khoahoc.net,22/12/2005 )

2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite green

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Công thức cấu tạo

Một số tên thường gọi:

• Malachite green chloride

• C.i Basic green 4

• Benzaldehyde green

• n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) 1- ylidene) -n-methyl-chloride

phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene-• Acryl brilliant green

Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn (Ictarulus

punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn

LC50 (mg/l) pH Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ)

Một nghiên cứu về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm của Trung tâm Nghiên cứu Độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi

gene (mutagenic) và gây ung thư (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm Qua

việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là

2 chất nguy hại có tiềm năng gây ung thư cho người (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005)

Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất Malachite

Green có thể là một mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương

trình kiểm nghiệm MG ở một số loại cá tôm bán ở thị trường Các quốc gia trong khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb) Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng

nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư

lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG ( www.khoahoc.net,22/12/2005 )

Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo

chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG

trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản

2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN

2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới

Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có những bước tiến bộ vượt bậc Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp khắc phục, trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu hiệu

Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được

sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như một chất diệt nấm Nguyên nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua ( www.vietnam.net)

Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các trại nuôi cá hồi và cá chép ở tám vùng của Hàn Quốc Trong các ngày từ 15/9/2005 đến 3/10/2005, Cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc (NEPQIS) đã tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá ở nước này Lượng hóa chất tìm thấy dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com, 6/10/2005)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam

Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy sản Việt Nam Nhà nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa

ra và thường xuyên có rà soát, bổ sung các quy định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu, đảm bảo nuôi trồng thủy sản phát triển bền vững Tuy nhiên việc chấp hành các quy định của nhà nước là chưa triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam nhập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản, mẫu nước môi trường nuôi nhiễm thuốc, hóa chất bị cấm sử dụng như Choramphenicol, các dẫn xuất Nitrofuran, gần đây và theo diện rộng là tồn lưu Green Malachite (NAFIQAVED, 2004)

Về tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp (Phạm Thanh Tuấn, 2004) ghi nhận được có 90 loại thuốc, hóa chất được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: diệt tạp, xử lý nước, trộn vào thức ăn để phòng và trị bệnh Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ ràng, riêng chất MG là chất nằm trong danh mục cấm nhưng vẫn được người nuôi

sử dụng ở đây

Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì cho biết không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện hiện đến 10/64 mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb Đối với cá đang nuôi thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - 4,18 ppb (Nguyễn Chính, 2005)

2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN

Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản Hàn Quốc –NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau 30 ngày, đối với lươn sự đào thải của Ciprofloxacin và Ofloxacin là sau 35 ngày Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới

100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002)

Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh trùng cho thấy (vietlinh.com.vn):

Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35ppb Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10ppb Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Sau 3 tháng : MG = 0 Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn còn

Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng Việc tích lủy

MG mang tính cộng dồn Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lủy dần trong thịt và tế bào

mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lủy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong thịt Như vậy nếu tích lủy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng sau khi ăn cá bị nhiễm

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ CHỈ TIÊU SINH HÓA Lipid peroxidase (LPO), Acetylcholinestrease (AChE), Catalase (CAT), Glutathione S- transferease (GST), Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

Acelthylcholine là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn

truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961)

Lipid peroxidation chất có liên quan đến các tác nhân oxy hóa trong cơ thể thường góp phân vào các tiến trình phát sinh bệnh Khi oxy hóa lipid nó liên quan đến sự hấp thụ allylic hydrogen bằng việc tạo ra gốc hydroperoxyl để hình thành nên lipid hydroperoxides (LOOPs) LOOPs tạo ra malondialdehyde (MDA) và 4-

hydroxyalkenals (HAE) khi phân hủy (Amad và ctv, 2000)

Từ nghiên cứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ thấp 10.6 - 32.0 ng/l Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của

Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm sụt giảm hoạt tính của enzyme

Acetylcholinesterase (AChE), hàm lượng protein trong máu

Theo Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia tăng LPO Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23 – 50g/con),

khi cho tiếp xúc với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa

so với đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang Sự gia tăng của LPO kéo theo các nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo Theo tác giả, sự thay đổi hoạt tính của các nhân tố chống oxy hóa và chỉ số của LPO có thể là chỉ thị sinh học Như vậy, có thể dựa và sự thay đổi của LPO để đánh giá sự tác động của endosulfan lên các đối tượng khác

Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4D và azinphosmethyl

lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis

niloticus) Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03ppm

azinphosmethyl trong các khoảng thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ Kết quả cho thấy

cá rô phi có khả năng chống lại stress oxy hoá bằng các cơ chế kháng oxy hoá và chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydase Hoạt tính G6PD tăng so với đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến

hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Theo Horsberg và ctv.(1989) thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ (Dichlorvos) gây ức chế men AchE trong não cá hồi (Salmon) mạnh nhất ở nồng độ tồn lưu trong cơ thể

cao nhất Ông cũng cho biết việc xác định hoạt tính của men AchE có thể tin cậy hơn việc phân tích lượng thuốc tồn lưu khi chẩn đoán việc cá hồi có bị nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hay không

Theo Zinkl và ctv (1980) và Fleing à Grue (1981) thì nếu như hoạt tính của men

AchE trong não giảm 20% so với đối chứng thì cơ thể xem như là cá có tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ Chính do sự rất nhạy cảm về hoạt tính của men AchE đối với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ mà có thể dùng đo hoạt tính của men như là một công cụ trong việc đánh giá môi trường có bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu

cơ (FanCey và ctv 1987, Morgan và ctv 1990) Alexander và ctv 19 ) dã nghiên

cứu và đề nghị một phương phát đơn giản và cho kết quả nhanh qua việc do tỉ lệ hoạt tính của men AchE để biết cá nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ như parathion, malathin,

Weiss ( 1958) nghiên cứu sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá và thấy rằng mức

độ hoạt hóa của AchE trong não bị ức chế tùy thuộc vào nồng độ thuốc Ở nồng độ 500mg/kg của Folidol 600 (Methyl parathino làm AchE trong huyết tương của cá bị

ức chế 90% sau 4h thí nghiệm duy trì mức ức chế này trong 4 ngày vài hồi phục 90% múc bình thường sau 8-10 ngày và đạt được mức bình thường sau 35 ngày

80-(Silva và ctv 1993)

Hiran M Dutta và Dane A Arends (2003) Thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan

lên hoạt động AchE trên não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius) Thí

nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96 giờ và 1 tuần ở nồng độ 1.0 µg/l (dựa vào LC50 của endosulfan đối với cá bluegill sunfish là 1,2 µg/l ) Kết quả cho thấy hoạt động của AchE trong não giảm tương ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%

J Zhang và ctv (2004) nghiên cứu sự ảnh hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol (DCP) trên gan của cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40

ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng

Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus

(MC-Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL-1 sau 24 giờ Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL-1 thì LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường Đối với hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µgL-1 và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu :

3.1.1 Địa điểm:

Khoa Thủy Sản -Trường Đại Học Cần Thơ

3.1.2 Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2006 đến 06/2006 3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm

Bể thí nghiệm có thể tích 0,5 m3

Xô nhựa, cân tiểu ly

Bộ đồ giải phẩu (kéo, nhíp, dao)

Pipet, ống đong

Máy ly tâm, máy so màu quang phổ (Thermo, Anh sản xuất)

Dụng cụ, thiết bị, phương tiện dùng trong thí nghiệm được sử dụng từ phòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ

Hóa chất thí nghiệm:

Malachite Green 80% hoạt chất (Merck)

Từ kết quả khảo sát thực tế tại Thốt Nốt, Cần thơ, người nuôi cá thường sử dụng

MG nồng độ 0,05-0,1ppm tắm cá trong thời gian 12 giờ hoặc tắm ở nồng độ cao 2ppm trong thời gian 30-60 phút mục đích trị bệnh nấm thủy mi cho cá Tra Ngoài

1-ra, một số hộ dân tắm cá bằng MG nồng độ 0,1-0,2ppm trong thời gian 30-60 phút hoặc kết hợp với CuSO4 0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong thời gian 15-30 phút Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1 ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm

Phương pháp pha Malachite Green thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít nước cất, khuấy đều bằng khuấy từ Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể Mỗi bể chứa 410 lít nước

- Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): lấy 41 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít nước

- Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): lấy 410 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít nước

3.2.3 Bố trí thí nghiện

Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức Hai nghiệm thức

có nồng độ gây nhiễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghiệm thức đối chứng Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) chứa 410 lít nước, mỗi bể bố trí 50 con

Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian

12 giờ

Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1 giờ

Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green

3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu

Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục

Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là 28%, mỗi ngày cá được cho ăn 2 lần (8h, 16h)

Các yếu tố nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được theo dõi 2 giờ 1 lần trong 2 ngày đầu thí nghiệm để xem ảnh hưởng của các yếu tố này đến độc tính của MG

ü Thu mẫu phân tích sự tồn lưu của MG trong cá tra theo thời gian

Ngày 0 Ngày7 Ngày 30 Ngày 60

Tiến trình thí nghiệm và thu mẫu

Ngày 0: mẫu cá thu ngay sau khi kết thúc gây nghiễm Ngày 7: mẫu cá thu 7 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước Ngày 30: mẫu cá thu 30 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước Ngày 60: mẫu cá thu 60 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước

ü Thu mẫu phân tích sự biến đổi thành phần sinh hoá trên não, gan cá tra dưới tác động của MG theo thời gian

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4

Lần 1: mẫu cá trước khi gây nhiễm MG Lần 2: mẫu cá sau khi kết thúc gây nhiễm MG

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Lần 3: mẫu cá 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm MG Lần 4: mẫu cá 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm MG

Mẫu nước sau khi thu được trữ đông -20 độ cho đến khi phân tích Mẫu cá được giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi phân tích, phần còn lại được xây nhuyễn và giữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng

và Thú Y Thuỷ Sản – Vùng 6 Phương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg 88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) d ựa trên hệ thống sắc kí HPLC với đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb

3.2.5 Chuẩn bị mẫu

Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá

Cân trọng lượng mẫu (A)

Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH2PO4/K2HPO4 50mM (pH=7.5)

Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4oC) Trữ -80oC đến khi phân tích

Lấy phần nổi (trữ -80oC đến khi phân tích )

3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu:

Phân tích Acetylcholinestrease (AchE)

Nguyên tắc:

Hoạt tính của AchE được xác định theo phương pháp của Ellman và ctv (1961)

Phương pháp này sử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất của AchE ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi AchE và thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng Cường

độ màu dần đậm theo thời gian và hoạt tính của AchE được đo bằng máy so màu quang phổ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Phương trình phản ứng minh họa

Acetylthiocholine iodide AchE thiocholine + acetae

Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate sản phẩm có màu vàng

Bảng 2: Quá trình phân tích AchE

R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein

0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuyển thành thiocholine và acetate

Lipid peroxidation

Nguyên tắc

LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance

(TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ

sung Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5%

và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma) Sau khi ủ hỗn hợp trong 15

phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi Sau đó cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang phổ

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu