Định type vi khuẩn Mycoppasma pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh phẩm viêm họng cấp tính.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYENTATTHANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CỒNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐỊNH TYPE VI KHUÁN Mycoplasma pneumoniae PHÂN LẬP TỪ MẲU BỆNH PHẨM VIÊM HỌNG CẤP TÍNH Sinh viên thực : Nguyễn Thị Quỳnh Huơng Mã số sinh viên :1511537447 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Thân Văn Thái TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH CỘNG HỊA XÀ HỊI CHÙ NGH/ÌA VIỆT NAM KHOA CÒNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Nguyễn Thị Quỳnh Hương MSSV: 1511537447 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 15DSH1B Đầu đề luận văn: Định type vi khuẩn Mycoplasma pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh phẩm viêm họng cấp Mục tiêu: - Phân lập vi khuẩn Mycoplasma pneumoniae (M pneumoniae) từ mầu bệnh phàm viêm họng cấp tính - Định type vi khuan M pneumoniae cặp mồi đặc hiệu - Giải trình tự phân tích gen 16S rRNA vi khuẩn M pneumoniae phân lập Nội dung: - Phân lập vi khuẩn M pneumoniae từ mầu bệnh phẩm viêm họng cấp tính - Chấn đốn vi khuân M pneumoniae phản ứng PCRvới cặp mồi đặc hiệu - Định type vi khuân M pneumoniae phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Giải trình tự phân tích gen 16S rRNA vi khuẩn M pneumoniae phân lập Thời gian thực hiện: tháng 02-8/2019 Người hướng dẫn chính: TS Thân Văn Thái Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày thảng năm 2019 Bộ MÔN (Ký ghi rõ họ tên) CÁN Bộ HƯỚNG DẢN (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Đe hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin cảm ơn ba mẹ người thân gia đình hồ trợ động viên suốt q trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Thân Văn Thái tận tình hướng dần, sửa chữa sai sót, tạo điều kiện giúp đờ em hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu toàn thể thầy cô Khoa Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành truyền đạt kiến thức chuyên môn năm qua Em xin gửi lời cám ơn đến anh, chị, bạn bè Trung tâm Công nghệ sinh học giúp đỡ động viên q trình làm thí nghiệm hồn thành khóa luận Mặc dù cố gắng hồn thành tốt khóa luận bước đầu tìm hiểu lĩnh vực nghiên cứu, kiến thức em hạn chế cịn nhiều bỡ ngờ Do thiếu sót điều khó tránh khỏi, em mong muốn đóng góp ý kiến từ Q thầy để hồn thành khóa luận cách tốt Chúc thầy cô khoa Công nghệ Sinh học luôn thành công nghiệp giảng dạy gặp nhiều may mắn sống Em chân thành cảm ơn! Nguyễn Thị Quỳnh Hương Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT V SUMMARY vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG BIẾU viii DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT ix ĐẶT VẤN ĐỀ X CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm họng cấp tính 1.1.1 Khái niệm bệnh viêm họng cấp tính 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh viêm họng cấp tính 1.1.3 Triệu chứng bệnh viêm họng cấp tính 1.1.4 Chấn đoán phân loại bệnh viêm họng cấp tính 1.1.5 Điều trị phòng bệnh .3 1.2 Giới thiệu Mycoplasma 1.2.1 Lịch sử hình thành 1.2.2 Đặc điêm chung 1.2.3 Khả đề kháng 1.3 M pneumoniae 1.3.1 Lịch sử hình thành 1.3.2 Phân loại .5 1.3.3 Đặc điêm chung M pneumoniae ii 1.3.4 Cấu trúc gen 1.3.5 Hình thức phân chia 1.3.6 Phương thức lây nhiễm .7 1.3.7 Đặc điểm dịch tề học 1.4 Tình hình nghiên cứu 1.4.1 Nghiên cứu nước 1.4.2 Nghiên cứu nước 10 1.5 Phương pháp Polymerase chain reaction (PCR) 10 1.5.1 Lịch sử hình thành 10 1.5.2 Chu trình nhiệt 11 1.6 Điện di 12 1.6.1 Nguyên lý chung 12 1.6.2 Điện di Agarose gel 12 1.7 Kỳ thuật giải trình tự gen 12 1.7.1 Phương pháp hóa học giải trình tự DNA 13 1.7.2 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA 13 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 14 2.1 Nơi thực 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Đối tượng nghiên cứu 14 2.4 Vật liệu nghiên cứu 14 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 14 2.4.2 Hóa chất 15 2.5 Các môi trường sử dụng 15 2.5.1 Môi trường thạch NA (Nutrient Agar) .15 2.5.2 Môi trường BHI lỏng (Brain Heart Infusion Broth) 16 iii 2.6 Phương pháp nghiên cứu 16 2.6.1 Phương pháp phân lập M pneumoniae 16 2.6.2 Phương pháp tách chiết DNA 18 2.6.3 Phương pháp PCR 18 2.6.4 Phương pháp điện di 20 2.3.5 Phương pháp giữ chủng 21 2.3.6 Giải trình tự gen 16S rRNA 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Ket thu mẫu vi khuan M pneumoniae 22 3.2 Ket PCR đặc hiệu nhận dạng 25 3.3 Định type vi khuẩn M pneumoniae phản ứng PCR đặc hiệu 27 3.4 Xây dựng phả hệ gen 16S rRNA 27 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 32 IV TÓM TẤT Mycoplasma pneumoniae (M pneumoniae) nguyên nhân phơ biên gây bệnh viêm họng cấp tính người Vi khuẩn M pneumoniae dễ xâm nhập vào the người thơng qua đường hơ hấp trên, khó chấn đoán điều trị đặc biệt bệnh nhân có biến chứng nghiêm trọng viêm phổi, viêm màng não Đe tài: “Định type vi khuẩn M pneumoniae phân lập từ mầu bệnh phẩm viêm họng cấp tính” thực từ 02 - 8/2019 Phịng thí nghiệm Vi sinh, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Với mục tiêu dùng kĩ thuật nuôi cấy phân lập, phản ứng PCR, giải trình tự để nhận biết vi khuẩn M pneumoniae gây bệnh viêm họng cấp người Đe tài có bốn nội dung: Phân lập vi khuan M pneumoniae từ mầu bệnh phẩm viêm họng cấp tính Xác định vi khuẩn M pneumoniae phản ứng PCR đặc hiệu Định type vi khuan M pneumoniae phản ứng PCR đặc hiệu Giải trình tự phân tích gen 16S rRNA vi khuẩn M pneumoniae phân lập Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: - Đe tài thu nhận 50 mầu bệnh phẩm gây bệnh viêm họng cấp tính bệnh viện Thống Nhất, Tp Hồ Chí Minh Dựa vào đặc diem hình thái khuấn lạc, chúng tơi lựa chọn 50 chủng có kiêu hình thái vi khn M pneumoniae - Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với vi khuẩn M pneumoniae xác định 14 mẫu (28,0 %) phản ứng đặc hiệu primers - Phản ứng PCR định type vi khuẩn đặc hiệu 05 mẫu (35,7 %) Trong 03 mẫu thuộc type I 02 mầu thuộc type II - Phân tích phát sinh loài gen 16S cho thấy chủng vi khuẩn nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn M pneumoniae V SUMMARY Mycoplasma pneumoniae (M pneumoniae) is a bacteria causes the acute pharyngitis in human M pneumoniae can attach easily onto the upper respiratory tract, difficult to diagnosis and treatment, and causing acute pneumoniae and other unexpected signs in patient Thesis title: “Genotyping of M pneumoniae isolated from acute pharyngitis samples” was performed between 02 - 8/2019 at Microbiology labolatory, Nguyen Tat Thanh University The M pneumoniae was identified and genotyped by using culture, PCR, and genome sequence analysis Results after months: - We collected 50 acute pharyngitis samples from Thong Nhat hospital, Ho Chi Minh City - Isolation of the 50 bacteria strains that provide morphology as description for M pneumoniae - Results of PCR showed 14/50 (28,0 %) samples were M pneumoniae - PCR typing for 05 samples (35,7 %) with 03 samples belonged to type I, 02 samples belonged to type II - Phylogenetic analysis indicated that the study strains belonged to the M pneumoniae group vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH • Hình Hình 1.1 Quét vi điện tứ tế bào M pneumoniae 6 Hình 1.2 Khuẩn lạc M pneumoniae Hình 3.1 Mầu bệnh phấm viêm họng cấp tính 22 Hình 3.2 Lựa chọn khuẩn lạc có mơ tả tương tự khuẩn lạc cùa vi khuẩn M pneumoniae 23 Hình 3.3 Làm khuẩn lạc lựa chọn 24 Hình 3.4 Tăng sinh vi khuẩn từ khuẩn lạc 25 Hình 3.5 Sản phẩm PCR đặc hiệu vi khuẩn M pneumoniae 25 Hình 3.6 Định type vi khuẩn M pneumoniae (M) thang DNA chuẩn (10 Kb) Type I (làn 1-3), Type II (làn 4-5) 27 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR với gen 16S (M) thang DNA chuẩn (10 Kb) Mầu M pneumoniae sử dụng (làn - 5) 28 Hình 3.8 Cây phát sinh lồi phân tích mối tương quan gen 16S rRNA chủng M pneumoniae nghiên cứu với chủng tham chiếu 28 vii DANH MỤC BANG BIÊU Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.3 Danh mục hóa chất thuốc thử sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.4 Thành phần khối lượng NA 15 Bảng 2.5 Thành phần khối lượng BHI 16 Bảng 2.6 Trình tự cặp mồi 19 Bảng 2.7 Các thành phần phản ứng PCR 19 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cùa phản ứng PCR 20 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chọn lọc 24 Bảng 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn phản ứng PCR đặc hiệu 26 Bảng 3.3 Tỷ lệ mầu đặc hiệu vi khuẩn M pneumoniae theo tiêu chí mầu đặc trưng 26 viii ... 1.1 Bệnh vi? ?m họng cấp tính 1.1.1 Khái niệm bệnh vi? ?m họng cấp tính Vi? ?m họng vi? ?m niêm mạc tố chức niêm mạc họng, nói đến vi? ?m họng chủ yếu nói đến vi? ?m họng Vi? ?m họng cấp tính tức vi? ?m cấp. .. văn: Định type vi khuẩn Mycoplasma pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh phẩm vi? ?m họng cấp Mục tiêu: - Phân lập vi khuẩn Mycoplasma pneumoniae (M pneumoniae) từ mầu bệnh phàm vi? ?m họng cấp tính - Định. .. lan, vi? ?m họng tỏa lan, hoại thư họng Vi? ?m họng không đặc hiệu gồm vi? ?m họng bạch cầu, vi? ?m họng Vincent, vi? ?m họng Herpès, vi? ?m họng Zona, lao họng, giang mai họng, nấm họng Vi? ?m họng bệnh máu