NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN ENZYME COLLAGENASE TỪ VI KHUẨN #84CILLUS SUBTILIS TRÊN CÁC CƠ CHẮT KHÁC NHAU VÀ TINH SẠCH ENZYME BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN ENZYME COLLAGENASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRÊN CÁC CƠ CHẤT KHÁC NHAU VÀ TINH SẠCH ENZYME BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Trần Khương Vy CN Đỗ Thị Tuyến Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2011 Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận mang ơn nhiều người: người thân gia đình, thầy cơ, anh chị bạn bè… Trước hết, xin gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến người trực tiếp hướng dẫn tận tình suốt thời gian làm luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Tiến Thắng, thầy cô anh chị Viện Sinh học Nhiệt đới tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho trình hồn thành đề tài tốt nghiệp Viện Xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô khoa Khoa học ứng dụng trường Đại học Tôn Đức Thắng tận tình giảng dạy truyền đạt cho tơi kiến thức bổ ích suốt bốn năm học qua Cơ Trần Thị Thu Sang, cô giáo chủ nhiệm theo bước lo lắng cho suốt chặng đường đại học Thầy cô anh chị phịng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học giúp đỡ, hướng dẫn tơi nhiều điều q trình hồn thành đề tài tốt nghiệp phịng Cuối cùng, tơi xin cảm ơn người thân gia đình giúp đỡ, tin tưởng ủng hộ đường mà chọn Một lần xin chân thành cảm ơn tất Chúc quý thầy cô dồi sức khỏe thành đạt sống TP.Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 01 năm 2011 SVTH: Trần Khương Vy Trang i Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC ĐỒ THỊ xi LỜI MỞ ĐẦU xiii Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 1.1.1 Lịch sử phát enzyme 1.1.2 Định nghĩa enzyme 1.1.3 Cấu tạo enzyme 1.1.4 Danh pháp phân loại 1.1.4.1 Danh pháp 1.1.4.2 Phân loại 1.1.5 Tính chất enzyme 1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 1.1.6.1 Nhiệt độ 1.1.6.2 pH 1.1.63 Ion kim loại 1.1.64 Chất hoạt hóa 1.1.6 Chất ức chế 1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME COLLAGENASE 1.2.1 Khái niệm enzyme collagenase 1.2.2 Tình hình nghiên cứu collagenase giới 1.2.2.1 Lịch sử tìm kiếm nguồn Collagenase 1.2.2.2 Khả tổng hợp Collagenase 10 1.2.2.3 Một số tính chất enzyme Collagenase phát 10 1.2.3 Nghiên cứu collagenase Việt Nam 11 1.2.4 Ứng dụng 12 SVTH: Trần Khương Vy Trang ii Luận văn tốt nghiệp 1.2.4.1 Sử dụng nghiên cứu Collagenase 12 1.2.4.2 Sử dụng công nghệ thực phẩm 12 1.2.4.3 Sử dụng y tế  dược – mỹ phẩm 14 1.3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 14 1.3.1 Lịch sử 14 1.3.2 Phân loại 15 1.3.3 Đặc điểm 15 1.3.4 Độc tính 16 1.3.5 Môi trường 16 1.4 KHÁI QUÁT VỀ SẮC KÝ LỌC GEL 16 1.4.1 Khái niệm sắc ký 16 1.4.2 Các thuật ngữ dùng sắc ký 17 1.4.3 Sắc ký lọc gel 18 1.4.3.1 Tóm lược sắc ký lọc gel 18 1.4.3.2 Phân loại 18 1.4.3.3 Ưu điểm 18 1.4.3.4 Nhược điểm 19 1.5 PHÂN TÍCH HỖN HỢP ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE 19 Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM PHỊNG THÍ NGHIỆM 21 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 21 2.2.1 Nguyên liệu 21 2.2.2 Hóa chất 21 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 22 2.3 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME 22 2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis 22 2.3.1.1 Nguyên liệu 22 2.3.1.2 Hóa chất 22 2.3.1.3 Thiết bị 23 2.3.1.4 Chuẩn bị môi trường 23 SVTH: Trần Khương Vy Trang iii Luận văn tốt nghiệp 2.3.1.5 Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis 23 2.3.2 Thu nhận chế phẩm enzyme Collagenase thô 24 2.3.2.1 Tủa cồn lạnh (40C) 24 2.3.2.2 Tủa acetone 25 2.3.2.3 Tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 25 2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 26 2.4.1 Nguyên tắc 26 2.4.2 Hóa chất 27 2.4.3 Dựng đường chuẩn Albumine 27 2.4.4 Kết tính tốn 28 2.5 Xác định hoạt tính enzyme Collagenase – Phương pháp Ninhydrin Rosen 28 2.5.1 Nguyên tắc 28 2.5.2 Tiến hành thí nghiệm 29 2.5.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 29 2.5.2.2 Pha hóa chất 29 2.5.2.3 Dựng đường chuẩn Leucine 29 2.5.2.4 Tính kết 30 2.5.3 Tiến hành phản ứng 30 2.5.3.1 Cơ chất gelatin 30 2.5.3.2 Cơ chất casein 30 2.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme hàm lượng protein 31 2.6.1 Khảo sát ảnh hưởng pH 31 2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 31 2.6.3 Khảo sát độ bền nhiệt enzyme 31 2.7 Phương pháp tinh enzyme sắc ký lọc gel 31 2.7.1 Bản chất phương pháp 31 2.7.2 Nguyên tắc 31 2.7.3 Dụng cụ hóa chất 32 2.7.3.1 Dụng cụ thiết bị 32 2.7.3.2 Hóa chất 33 SVTH: Trần Khương Vy Trang iv Luận văn tốt nghiệp 2.7.4 Tiến hành chạy sắc ký 33 2.7.4.1 Chọn lựa gel 33 2.7.4.2 Chuẩn bị gel dựng cột 33 2.7.4.3 Chuẩn bị mẫu 34 2.7.4.4 Thu xác định mẫu tách 35 2.8 Phương pháp phân tích enzyme điện di gel polyacrylamide 35 2.8.1 Thiết bị dụng cụ 35 2.8.2 Cấu tạo khung gel 36 2.8.3 Hóa chất 36 2.8.4 Tiến hành chạy điện di 37 2.8.4.1 Chuẩn bị hộp điện di 37 2.8.4.2 Chuẩn bị mẫu 37 2.8.4.3 Tiến hành chạy điện di 38 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát hàm lượng hoạt tính chiết xuất thơ enzyme collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis 40 3.2 Kết tủa dịch chiết enzyme thô cồn lạnh khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 40 3.2.1 Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme tủa dịch chiết thơ enzyme cồn lạnh tỉ lệ khác 40 3.2.2 Xác định hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa dịch chiết thô enzyme cồn lạnh theo thời gian khác 43 3.2.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính CPT enzyme sau tủa cồn lạnh tỉ lệ 4:1 44 3.2.3.1 Xác định pH tối ưu 44 3.2.3.2 Xác định nhiệt độ tối ưu 44 3.2.3.3 Khảo sát độ bền nhiệt 45 3.3 Kết tủa dịch chiết enzyme thô acetone khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 47 3.3.1 Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme tủa dịch chiết thô enzyme acetone tỉ lệ khác 47 SVTH: Trần Khương Vy Trang v Luận văn tốt nghiệp 3.3.2 Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme tủa dịch chiết thô enzyme acetone thời gian khác 50 3.3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính CPT enzyme sau tủa acetone tỉ lệ 5:1 50 3.3.3.1 Xác định pH tối ưu 51 3.3.3.2 Xác định nhiệt độ tối ưu 52 3.3.3.3 Khảo sát độ bền nhiệt 53 3.4 Kết tủa dịch chiết enzyme thô muối (NH4)2SO4 bão hòa khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 54 3.4.1 Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme tủa dịch chiết thô enzyme muối (NH4)2SO4 bão hòa tỉ lệ khác 54 3.4.2 Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme tủa dịch chiết thơ enzyme muối (NH4)2SO4 bão hòa thời gian khác 56 3.4.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính CPT enzyme sau tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 65% 57 3.4.3.1 Xác định pH tối ưu 57 3.4.3.2 Xác định nhiệt độ tối ưu 58 3.4.3.3 Khảo sát độ bền nhiệt 59 3.5 So sánh tác nhân tủa cho hàm lượng protein cao 60 3.6 So sánh hoạt tính enzyme với tác nhân tủa khác chất 61 3.7 Tinh enzyme Collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis sắc ký lọc gel 62 3.7.1 Chế phẩm enzyme collagenase với tác nhân tủa cồn lạnh với tỉ lệ cồn : dịch chiết thô 4:1 62 3.7.2 Chế phẩm enzyme collagenase với tác nhân tủa acetone với tỉ lệ acetone : dịch chiết thô 5:1 63 3.7.3 Chế phẩm enzyme collagenase với tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa với nồng độ 65% 65 3.8 Kết phân tích enzyme Collagenase phương pháp điện di gel polyacrylamide 68 SVTH: Trần Khương Vy Trang vi Luận văn tốt nghiệp Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 4.1 Kết luận 71 4.2 Đề nghị 72 Tài liệu tham khảo Phụ lục SVTH: Trần Khương Vy Trang vii Luận văn tốt nghiệp CHỮ VIẾT TẮT A.alginolyticus: Aeromonas alginolyticus A.iophagus: Achromobacter iophagus Aa: acid amin B.alvei DC – : Bacillus alvei DC – B.subtilis: Bacillus subtilis C.histolyticum: Clostridium histolyticum CPT: chế phẩm thô DNC: dịch nuôi cấy ĐVHĐ: đơn vị hoạt độ E: enzyme HT: hoạt tính HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lượng I: inhibitor KLPT: khối lượng phân tử MT: môi trường OD: optical density P: product PAGE: polyacrylamide gel S: substance SDS: sodium dodecyl sulfate SEC: size exclusion chromatography UI: unit internatinal TL: tỉ lệ VSV: vi sinh vật SVTH: Trần Khương Vy Trang viii Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Tỉ lệ cồn dịch chiết thơ enzyme q trình tủa cồn 24 Bảng 2.2: Tỉ lệ Acetone dịch enzyme trình tủa acetone 25 Bảng 2.3: Tỉ lệ dịch enzyme muối (NH4)2SO4 bão trình tủa muối 25 Bảng 2.4: Dựng đường chuẩn albumine 27 Bảng 2.5: Dựng đường chuẩn leucine 29 Bảng 3.1: Hàm lượng protein hoạt tính dịch chiết enzyme thô 40 Bảng 3.2: Hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa cồn 960 tỉ lệ khác chất getatin 41 Bảng 3.3: Hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa cồn 960 tỉ lệ khác chất casein 42 Bảng 3.4: Hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa cồn 960 thời gian khác chất 43 Bảng 3.5: Ảnh hưởng pH chất đến hoạt tính enzyme tủa cồn lạnh tỉ lệ 1:4 chất 44 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme tủa cồn lạnh tỉ lệ 1:4 chất 45 Bảng 3.7: Độ bền nhiệt ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme tủa cồn lạnh tỉ lệ 1:4 chất khác 45 Bảng 3.8: Hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa acetone tỉ lệ khác chất getatin 47 Bảng 3.9: Hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa acetone tỉ lệ khác chất casein 48 Bảng 3.10: Hàm lượng protein hoạt tính CPT enzyme tủa acetone thời gian khác chất 50 Bảng 3.11: Ảnh hưởng pH chất đến hoạt tính enzyme tủa cồn lạnh tỉ lệ 1:5 chất 51 Bảng 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme tủa acetone tỉ lệ 1:5 chất 52 Bảng 3.13: Độ bền nhiệt ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme tủa SVTH: Trần Khương Vy Trang ix Luận văn tốt nghiệp Qua biểu đồ ta thấy acetone 5:1 tác nhân tủa cho hàm lượng protein enzyme cao (51.06 mg) muối (NH4)2SO4 bão hòa 65% (49.26mg) Nhưng chênh lệch hàm lượng protein enzyme tác nhân không đáng kể, mặt khác hoạt tính hoạt tính riêng CPT tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 65% cao tác nhân cịn lại chất khảo sát Ngồi ra, muối (NH4)2SO4 bão hịa muối trung tính, thường sử dụng tính hịa tan tốt gây biến tính protein nhiệt độ thường muối (NH4)2SO4 bão hịa kinh tế, thơng dụng, dễ kiếm so với acetone ta nên chọn tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 3.6 So sánh hoạt tính enzyme với tác nhân tủa khác chất Bảng 3.21: So sánh hoạt tính enzyme với tác nhân tủa khác chất Gelatin Casein Cồn 4:1 190.14 166.99 Acetone 5:1 180.75 156.24 Muối (NH4)2SO4 65% 295.19 214.73 350 ĐVHT enzyme 300 250 200 gelatin 150 casein 100 50 cồn 4:1 acetone 5:1 (NH4)2SO4 65% tác nhân tủa Biểu đồ 3.20: Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme với tác nhân tủa khác chất Nhận xét: SVTH: Trần Khương Vy Trang 61 Luận văn tốt nghiệp Hoạt tính enzyme tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 65% > tủa cồn 4:1> tủa acetone 5:1 chất tương ứng Khả phân giải gelatin cao so với casein Vậy enzyme collagenase thủy phân tốt đạt hoạt tính cực đại chất gelatin 3.7 Tinh enzyme collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis sắc ký lọc gel Sau tiến hành chiết xuất tủa enzyme tác nhân: cồn lạnh, acetone muối (NH4)2SO4 bão hòa 65%, tiến hành chạy sắc ký sản phẩm tủa tỉ lệ nồng độ tối ưu Đối với sản phẩm tủa cồn lạnh acetone, trình tinh thực gel Biogel P – 100 Đối với sản phẩm tủa muối, trình tinh thực qua bước: loại muối gel Sephadex G – 25 (Pharmacia) tinh gel Biogel P – 100 3.7.1 Chế phẩm enzyme collagenase với tác nhân tủa cồn lạnh với tỉ lệ tủa cồn : dịch chiết thô 4:1 Lấy 2ml dịch enzyme collagenase từ 5ml dịch tủa enzyme pha đệm phosphate 50mM, pH 7.5, chạy qua sắc ký cột với thông số sau:  Gel: Biogel P – 100 (giới hạn phân tách 5000 – 100000 Da)  Cột: 50 x 1.5 cm  Flow adaptor: 1.5cm  Tốc độ dòng: 0.14ml/phút  Vmẫu: 2ml  Phân đoạn: 2ml/phân đoạn  A280: độ hấp thụ protein bước sóng 280nm Kết tinh qua lọc gel enzyme collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis sau tủa cồn lạnh SVTH: Trần Khương Vy Trang 62 Luận văn tốt nghiệp Biểu đồ 3.21 Sắc ký đồ lọc Biogel P – 100 (tủa cồn) Qua sắc kí ta thu peak: Peak 1: từ ống 16 đến ống 23: 16ml Peak 2: từ ống 40 đến ống 50: 22ml Đem peak xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme Chúng ta nhận thấy peak thu có hoạt tính Tuy nhiên, hoạt tính enzyme hàm lượng protein peak cao peak nên dự đốn peak có chứa collagenase quan tâm Bảng 3.22: Hoạt tính enzyme (U) hàm lượng protein (mg) trước sau sắc ký tủa cồn lạnh Trước sắc ký Sau sắc ký Hàm lượng protein (mg) 3612,499 462,308 Hoạt tính enzyme (U) 2331,724 1522,202 Hoạt tính riêng (U/mg) 0.64 3,29 Hiệu suất (%) 100 65,28 5,14 Độ tinh (lần) 3.7.2 Chế phẩm enzyme collagenase với tác nhân tủa acetone với tỉ lệ tủa acetone : dịch chiết thô 5:1 SVTH: Trần Khương Vy Trang 63 Luận văn tốt nghiệp Lấy 2ml dịch enzyme collagenase từ 5ml dịch tủa enzyme pha đệm phosphate 50mM, pH 7.5, chạy qua sắc ký cột với thông số sau:  Gel: Biogel P – 100 (giới hạn phân tách 5000 – 100000 Da)  Cột: 50 x 1.5 cm  Flow adaptor: 1.5cm  Tốc độ dòng: 0.14ml/phút  Vmẫu: 2ml  Phân đoạn: 2ml/phân đoạn  A280: độ hấp thụ protein bước sóng 280nm Kết tinh qua lọc gel enzyme collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis sau tủa acetone Biểu đồ 3.22 Sắc ký đồ lọc Biogel P – 100 (tủa acetone) Qua sắc kí ta thu peak: Peak 1: từ ống 19 đến ống 25: 14ml Peak 2: từ ống 40 đến ống 60: 42ml Đem peak xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme Chúng ta nhận thấy peak thu có hoạt tính Tuy nhiên, hoạt tính enzyme hàm lượng protein peak cao peak nên dự đốn peak có chứa collagenase quan tâm SVTH: Trần Khương Vy Trang 64 Luận văn tốt nghiệp Bảng 3.23: Hoạt tính enzyme (U) hàm lượng protein (mg) trước sau sắc ký Trước sắc ký Sau sắc ký Hàm lượng protein (mg) 2574,930 290,379 Hoạt tính enzyme (U) 1654,672 892,631 Hoạt tính riêng (U/mg) 0,63 3,07 Hiệu suất (%) 100 53,94 4,87 Độ tinh (lần) 3.7.3 Chế phẩm enzyme collagenase với tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa nồng độ 65% Lấy 2ml dịch enzyme collagenase từ 5ml dịch tủa enzyme pha đệm phosphate 50mM, pH 7.5, tiến hành chạy sắc ký loại muối gel Sephadex G –25 Sau loại muối, ta tiếp tục chạy sắc ký gel Biogel P – 100 với thông số sau:  Gel: Biogel P – 100 (giới hạn phân tách 5000 – 100000 Da)  Cột: 50 x 1.5 cm  Flow adaptor: 1.5cm  Tốc độ dòng: 0.14ml/phút  Vmẫu: 2ml  Phân đoạn: 2ml/phân đoạn  A280: độ hấp thụ protein bước sóng 280nm Kết tinh qua lọc gel enzyme collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis sau tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa SVTH: Trần Khương Vy Trang 65 Luận văn tốt nghiệp Biểu đồ 3.23 Sắc ký đồ lọc Biogel P – 100 (tủa muối (NH4)2SO4) Qua sắc kí ta thu peak: Peak 1: từ ống 17 đến ống 24: 16ml Peak 2: từ ống 40 đến ống 60: 42ml Đem peak xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme Chúng ta nhận thấy peak thu có hoạt tính Tuy nhiên, hoạt tính enzyme hàm lượng protein peak cao peak nên dự đốn peak có chứa collagenase quan tâm Bảng 3.24: Hoạt tính enzyme (U) hàm lượng protein (mg) trước sau sắc ký Trước sắc ký Sau sắc ký Hàm lượng protein (mg) 13986,188 1156,919 Hoạt tính enzyme (U) 17609,528 12352,671 Hoạt tính riêng (U/mg) 1,25 10,67 Hiệu suất (%) 100 70,14 8,54 Độ tinh (lần) Bảng 3.25: Hiệu suất độ tinh enzyme collagenase sau sắc ký Enzyme tinh từ CPT tủa Cồn 4:1 Acetone 5:1 (NH4)2SO4 65% SVTH: Trần Khương Vy Hiệu suất (%) Độ tinh 65,28 53,94 70,14 5,14 4,37 8,54 Trang 66 Luận văn tốt nghiệp Nhận xét: Dựa vào biểu đồ ta thấy CPT enzyme tủa muối (NH4)2SO4 65% cho hiệu suất (70,14 %)và độ tinh (8,54 lần) cao Kết bảng cho thấy, tủa protein tác nhân acetone, cồn hay muối (NH4)2SO4, HTR enzyme collagenase sau tinh tăng lên đáng kể Sau trình tủa, HTR collagenase CPT tăng lên nhiều so với DNC trình tủa loại bớt số tạp chất enzyme hoạt tính collagenase Các protein lạ bị loại bỏ tiếp tục qua trình sắc ký Dựa nguyên tắc phân đoạn sắc ký lọc gel với Biogel P -100 cho phép thu phân tử protein trọng lượng phân tử nằm khoảng 5.000 – 100.000 Da Protein – enzyme khỏi cột gel đo hấp thụ bước sóng 280nm hệ thống detector hệ thống sắc ký thể dạng sắc ký đồ phần mềm LP – Data View máy vi tính Do đó, enzyme sau sắc ký loại bỏ hầu hết tạp chất, protein có kích thước nằm ngồi giới hạn tách Biogel P – 100 nên HTR enzyme sau tinh tăng Chứng tỏ sau sắc ký chế phẩm có độ tinh Kết tinh sắc ký lọc gel cho thấy, enzyme thu nhờ tác nhân tủa (NH4)2SO4 65% cho HTR cao (10.67 U/mg) sau cồn 1:4 (3.29 U/mg), cuối acetone 1:5 (3.07 U/mg) Điều chứng tỏ dùng muối (NH4)2SO4 65% thích hợp cho việc thu CPT enzyme collagenase từ DNC vi khuẩn B.subtilis SVTH: Trần Khương Vy Trang 67 Luận văn tốt nghiệp 3.8 Kết phân tích enzyme collagenase điện di gel polyacrylamide MW 7100 20600 28900 34800 49100 80000 124000 209000 Hình 3.1 Kết chạy điện di CPT enzyme collagenase Chú thích: Thang chuẩn protein Dịch enzyme tủa cồn peak Dịch enzyme tủa acetone peak Dịch enzyme tủa muối (NH4)2SO4 peak Bảng 3.26: Giá trị Rf LgM thang chuẩn protein D (cm) 0,4 0,8 1,2 1,5 2,4 2,7 2,9 3,5 Rf 0,06 0,12 0,17 0,22 0,35 0,39 0,42 0,51 lgM 2,32 2,09 1,90 1,69 1,54 1,46 1,31 0,85 MW(kDa) 209 124 80 49,1 34,8 28,9 20,6 7,1 Trong đó: Rf tỉ số khoảng cách di chuyển protein khoảng cách di chuyển phẩm màu Bromophenol Blue D khoảng cách di chuyển band protein từ gel phân tích tới band protein SVTH: Trần Khương Vy Trang 68 Luận văn tốt nghiệp y = -2.8277x + 2.4339 R = 0.9514 2.5 LgM 1.5 0.5 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 Rf Biểu đồ 3.24 Biểu diễn tương quan LgM protein thang chuẩn với Rf Chúng ta tiến hành xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính liên quan Rf LgM protein thang chuẩn phần mềm Exel tích hợp Microsoft office 2003 có phương trình hồi quy sau: Y= - 2,8277X+2,4339 Trong đó: Y = LgM: trọng lượng phân tử protein X = Rf Dựa vào kết điện di phương trình hồi quy tuyến tính vừa xây dựng ta có kết sau: Bảng 3.27 Trọng lượng phân tử dịch enzyme tủa cồn qua sắc ký D (cm) 1,4 1,7 2,2 2,5 2,7 2,8 3,2 4,3 Rf 0,16 0,19 0,24 0,28 0,30 0,31 0,36 0,48 lgM 1,99 1,90 1,74 1,65 1,59 1,55 1,43 1,08 MW(kDa) 98,636 79,392 55,295 44,507 38,511 35,824 26,822 12,103 Bảng 3.28 Trọng lượng phân tử dịch enzyme tủa acetone qua sắc ký D (cm) 2,5 3,0 3,7 4,3 Rf 0,28 0,33 0,41 0,48 lgM 1,65 1,49 1,27 1,08 MW (kDa) 44,507 30,998 18,681 12,103 SVTH: Trần Khương Vy Trang 69 Luận văn tốt nghiệp Bảng 3.29: Trọng lượng phân tử dịch enzyme tủa muối (NH4)2SO4 qua sắc ký D (cm) 2,6 2,9 3,8 4,4 Rf 0,29 0,33 0,42 0,49 lgM 1,62 1,52 1,24 1,05 MW (kDa) 44,401 33,324 17,377 11,258 Nhận xét: Qua kết thực nghiệm nhận thấy, hầu hết giếng xuất vạch protein, vạch có vị trí gần giống Số vị trí vạch xuất gel điện di chứng tỏ protein – enzyme thu không loại enzyme thể hoạt tính collagenase Kết phù hợp với sở lý thuyết trình bày phần tổng quan Tuy nhiên vạch protein gel điện di chưa khẳng định chúng protein thuộc enzyme mà đề tài quan tâm Để hiểu biết xác sử dụng kỹ thuật lai phân tử để xác định hoạt tính collagenase vạch Khi tủa muối (NH4)2SO4 chạy điện di xuất vạch protein rõ (khơng có tượng gãy) so với tủa acetone cồn Điều phù hợp với kết xác định hàm lượng protein sau sắc ký lọc gel Kết lần khẳng định khả tủa thu hồi CPT muối (NH4)2SO4 tốt Từ kết ta thấy trọng lượng phân tử enzyme collagenase vi khuẩn Bacillus subtilis nằm khoảng 12,103 – 79,392 kDa SVTH: Trần Khương Vy Trang 70 Luận văn tốt nghiệp Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực đưa số kết luận cho đề tài sau:  Đối với acetone: tỉ lệ DC : acetone 1:5 tỉ lệ nồng độ tốt để tủa enzyme collagenase từ DNC thu CPT  Đối với cồn: tỉ lệ DC: cồn lạnh 1:4 tỉ lệ nồng độ tốt để tủa enzyme collagenase từ DNC thu CPT  Đối với muối (NH4)2SO4 bão hòa : nồng độ 65% nồng độ tốt để tủa enzyme collagenase từ DNC thu CPT  Sau sắc ký chế phẩm enzyme có độ tinh cao CPT tủa muối có độ tinh cao đến cồn acetone Đối với chất gelatin  CPT tủa acetone với tỉ lệ DC : acetone 1:5 cho ĐVHT cao (180,75 U) Dùng CPT khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pH (124,15 U) nhiệt độ 400C (39,50 U) pH nhiệt độ tối ưu  CPT tủa cồn 960C với tỉ lệ DC : cồn 1:4 cho ĐVHT cao (190,14 U) Dùng CPT khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pH (70,17 U) nhiệt độ 500C (49,94 U) pH nhiệt độ tối ưu  CPT tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 65% cho ĐVHT cao (295,19 U) Dùng CPT khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pH (173,09 U) nhiệt độ 400C (53,48 U) pH nhiệt độ tối ưu Đối với chất casein:  CPT tủa acetone với tỉ lệ DC : acetone 1:5 cho ĐVHT cao (156,24 U) Dùng CPT khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pH5 (62,11 U) nhiệt độ 400C (33,83 U) pH nhiệt độ tối ưu  CPT tủa cồn 960C với tỉ lệ DC:cồn 1:4 cho ĐVHT cao (166,99 U) Dùng CPT khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pH (42,40 U) nhiệt độ 500C (29,72 U) pH nhiệt độ tối ưu SVTH: Trần Khương Vy Trang 71 Luận văn tốt nghiệp Kết biện luận  CPT tủa muối (NH4)2SO4 bão hòa 65% cho ĐVHT cao (230,04 U) Dùng CPT khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme pH (85,92 U) nhiệt độ 400C (48,96 U) pH nhiệt độ tối ưu Trọng lượng phân tử enzyme collagenase vi khuẩn Bacillus subtilis nằm khoảng 12,103 – 79,392 KDa 4.2 Đề nghị Do thời gian điều kiện vật chất hạn chế nên q trình thực đề tài cịn nhiều hạn chế Vì để tiến đến hiểu biết xác, đầy đủ enzyme collagenase phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm enzyme thương mại đáp ứng nhu cầu sử dụng chúng tơi có số đề nghị sau:  Tiếp tục nghiên cứu tìm tịi thêm đối tượng (vi sinh vật, động vật… ) có khả thu nhận nguồn enzyme collagenase cao, hoạt tính mạnh  Khảo sát khả sinh tổng hợp collagenase từ nguồn vi sinh vật có thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam số nước lân cận  Tiến hành nghiên cứu thời gian nuôi cấy thu dịch thô enzyme thời gian tủa, tác nhân tủa thu CPT thích hợp hiệu cao tiến đến tối ưu hóa q trình thu nhận tinh enzyme từ vi khuẩn Bacillus subtilis  Khảo sát thêm yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme như: ảnh hưởng ion kim loại, nồng độ muối  Nghiên cứu thăm dò khả sử dụng collagenase sản xuất nước mắm, gia vị chứa collagenase, sản xuất xúc xích, bittet từ thịt bị cấp thấp (chứa nhiều collagen)  Nghiên cứu phát triển hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm collagenase thương mại ứng dụng vào lĩnh vực: chế biến bảo quản thực phẩm; mỹ phẩm; công nghiệp y dược… SVTH: Trần Khương Vy Trang 72 Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Các phương pháp sắc ký, 1985, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lê Ngọc Tú, Hóa sinh cơng nghiệp, 2002, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng, Công Nghệ Enzyme, 2004, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình thực tập Cơng Nghệ Enzyme Protein, 2004, Viện Sinh học Nhiệt Đới Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, 2001, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Thi, Nguyễn Lân Dũng, Mười vạn câu hỏi cơng nghệ sinh học, 1999, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình Cơng Nghệ Enzyme, 2006, Viện Sinh học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, Công Nghệ Sinh Học Tập Ba – Enzyme ứng dụng, 2007, Nhà xuất Giáo dục Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, 2003, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 10 Pyo – Jam Park, Sang-Hoon Lee, Hee-Guk Byun, Soo-Hyun Kim and Se-Kwon Kim, 2002 Purification and Characterization of a Collagenase from the Mackerel, Scomber japonicus Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 35: 576-582 11 Se-Kwon Kim*, Pyo-Jam Park, Jong-Bae Kim and Fereidoon Shahidi, 2002, Purification and Characterization of a Collagenolytic Protease from the Filefish, Novoden modestrus Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 35: 165-171 SVTH: Trần Khương Vy Luận văn tốt nghiệp 12 D.Petrovaa, A.Derekovab, SVlaova, 2006 Furification and properties of individual Collagenase Streptomyces sp Strain 3B.Folia Microbiol, 51(2): 93-98 13 GRAHAM C.REID, DAVID R.WOODS, AND FRANK T.ROBB, 1980 Petone induction and Rifampin-Insentitiv Collagenases Production by Vibrio alginolyticus Journal of Bacteriolog, 142: 447-454 SVTH: Trần Khương Vy Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN ĐƯỜNG CHUẨN LEUCINE SVTH: Trần Khương Vy ... phụ thuộc vào: - Điện tích phân tử thay đổi tùy theo pH mơi trường phải dùng dung dịch đệm để trì pH ổn định - Hình dáng trọng lượng phân tử - Cường độ điện trường - Nhiệt độ - Tính chất giá... dụng xúc tác enzyme Chất hoạt hóa thường có chất khác Ví dụ amino nhóm Halogen Cl-, B-, I- có tác dụng hoạt hóa  - amylase Glutathione có tác dụng hoạt hóa nhiều enzyme protease thực vật, số enzyme... maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose SVTH: Trần Khương Vy Trang 15 Luận văn tốt nghiệp  Indol (-) , VP (+), nitrat (+), H2S (-) , NH3(+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+)