0528HỖ TRỢ ĐỊNH DANH NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHẢ HỆ VÙNG GEN TEF1

TR B GIÁO D C VÀ ÀO T O NG I H C M TP H CHệ MINH KHịA LU N T T NGHI P Tên đ tài: H TR NH DANH N M Kụ SINH CỌN TRỐNG D A TRểN PHỂN TệCH PH H VỐNG GEN TEF1 KHOA CỌNG NGH SINH H C CHUYểN NGÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHỂN T GVHD: PGS.TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n SVTH : Ph m Xuơn Xinh MSSV : 1053010978 KHOÁ: 2010 ậ 2014 Tp.H Chì Minh, tháng 05 n m 2014 L IC M N L i đ u tiên, em xin g i l i c m n chơn thƠnh đ i v i PGS.TS Lê Huy n Ái Thuý, ThS Tr ng Kim Ph ng đƣ t o u ki n t t nh t đ em hoƠn thƠnh th c t p t t nghi p nƠy Em xin t lòng tri ơn sơu s c đ n ThS Lao ln t n tình h ng d n giúp đ , tin t c Thu n, th y đƣ ng vƠ đ ng viên em nh ng lúc g p khó kh n q trình lƠm đ tƠi Em xin chơn thƠnh bi t n th y cô Chúc th y cô vui kho vƠ ngƠy cƠng thƠnh công h n đ Bên c nh đó, tơi c ng xin c m n nh ng ng nghi m Sinh h c phơn t tr ng ng khoa h c i b n đƣ lƠm đ tƠi t i phịng thí i h c M thƠnh ph H Chí Minh, b n đƣ ln bên c nh, giúp đ tơi q trình lƠm đ tƠi Em xin trơn tr ng g i l i c m n đ n th y cô khoa cơng ngh sinh h c nói chung vƠ th y chun ngƠnh vi sinh nói riêng đƣ truy n đ t ki n th c quý báu cho em su t b n n m qua Cu i cùng, xin g i l i c m n đ n cha m , nh ng ng i đƣ yêu th ng, d y d , nuôi n ng khôn l n nh ngƠy hôm Bình D ng, ngƠy 20 tháng n m 2014 Ph m Xuơn Xinh KHịA LU N T T NGHI P M CL C TV N .1 PH N T NG QUAN TÀI LI U 1.1 1.1.1 T NG QUAN V CÁC LO I N M Kụ SINH CỌN TRỐNG c m chung 1.1.2 S phơn b vƠ thƠnh ph n loƠi 1.1.3 L ch s nghiên c u 1.1.4 ng d ng sinh h c 1.1.5 Các ho t ch t 1.2 NGHIểN C U NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 1.2.1 c m nh n d ng vƠ đ nh danh 1.2.2 nh danh phơn t 1.2.3 Gi i thi u v gen Tef1 1.3 TỊNH HỊNH NGHIểN C U TRONG N 1.4 NGHIểN C U PH H PHỂN T 1.4.1 Gi i thi u s l C c v cơy ph h phơn t 1.4.2 Các nghiên c u phát sinh loƠi 10 1.5 CÁC K THU T TRONG SINH H C PHỂN T 15 1.5.1 K thu t PCR 15 1.5.2 i n di 15 1.5.3 K thu t gi i trình t 15 1.5.4 K thu t hi u ch nh trình t 16 PH N V T LI U VÀ PH 2.1 TH I GIAN VÀ NG PHÁP A I M NGHIểN C U 17 2.2 V T LI U 17 2.2.1 V t li u s d ng kh o sát in sillico 17 2.2.2 V t li u s d ng th c nghi m 18 SVTH: PH M XUỂN XINH i KHịA LU N T T NGHI P 2.3 PH NG PHÁP 20 2.3.1 Khai thác vƠ thu th p tƠi li u 20 2.3.2 Kh o sát in sillco 21 2.3.3 Th c nghi m 21 2.3.4 Ki m tra s n ph m DNA đƣ tách chi t 22 2.3.5 PCR 23 2.3.6 i n di 24 2.3.7 Gi i trình t 24 2.3.8 Hi u ch nh trình t 24 2.3.9 So sánh v i c s d li u 25 2.3.10 Xơy d ng b c s d li u DNA 25 2.3.11 Dị tìm mơ hình ti n hóa 25 2.3.12 Xơy d ng cơy phát sinh loƠi 25 PH N III K T QU VÀ TH O LU N 3.1 K T QU KHAI THÁC D LI U 26 3.2 K T QU XỂY D NG CỂY PH H PHỂN T T C S D LI U C C B 28 3.3 K T QU ÁNH GIÁ M I 34 3.3.1 ánh giá m i IDT 34 3.3.2 Ki m tra m i b ng BLAST 35 3.3.3 K t qu ki m tra Annhyb c p m i 983F/2218R v i trình t gen Tef1 36 SVTH: PH M XUỂN XINH ii KHịA LU N T T NGHI P 3.4 XỂY D NG QUY TRỊNH TH C NGHI M KHU CH I VỐNG GEN TEF1 CHO CÁC M U N M Kụ SINH CỌN TRỐNG 37 3.5 K T QU HI U CH NH TRỊNH T 41 3.6 K T QU SO SÁNH V I C S D LI U GENBANK 48 3.7 K T QU XỂY D NG CỂY PH H PHỂN T 48 PH N IV K T LU N VÀ NGH 4.1 K T LU N 55 4.1.1 Lý thuy t 55 4.1.2 Th c nghi m 55 4.2 NGH 55 TÀI LI U THAM KH O 56 SVTH: PH M XUỂN XINH iii KHịA LU N T T NGHI P DANH M C B NG B ng 2.1 ThƠnh ph n ph n ng PCR 23 B ng 3.1.Thơng tin trình t gen Tef1 đ c s d ng đ thi t l p cơy phát sinh loƠi 26 B ng 3.2 Thông s đánh giá c p m i 983F/2218R khu ch đ i vùng gen Tef1 .34 B ng 3.3 K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát m u n m ký sinh côn trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform .37 B ng 3.4 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol .38 B ng 3.5 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol .39 B ng 3.6 Hi u ch nh nucleotide t i v trí vùng (2), (4) đ u m ch xuôi .43 B ng 3.7 Hi u ch nh nucleotide t i v trí cu i m ch xuôi (5’-3’) .45 B ng 3.8 T ng h p k t qu hi u ch nh trình t gen Tef1 c a m u ký sinh côn trùng 47 B ng 3.9 K t qu chi u dƠi trình t gen Tef1 tr c vƠ sau hi u ch nh 47 B ng 3.10 K t qu so sánh trình t Tef1 đƣ h u ch nh v i trình t Genbank 48 B ng 3.11 T ng h p k t qu đ nh danh m u n m t d li u phơn t vƠ Genbank 54 SVTH: PH M XUỂN XINH iv KHịA LU N T T NGHI P DANH M C HỊNH Hình 1.1 Cordyceps militaris Hình 1.2 C u trúc cordycepin Hình 1.3 C u trúc ergosterol Hình 1.4.Vai trị c a EF1 q trình d ch mƣ Hình 1.5 C u trúc gen Tef1 vƠ v trí m i khu ch đ i c a H Jecorina Hình 3.1 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp NJ c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t 29 Hình 3.2 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp ML c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t 30 Hình 3.3 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp MP c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t 31 Hình 3.4 K t qu ki m tra m i b ng BLAST 35 Hình 3.5 K t qu Annhyb c p m i 983F/2218R v i trình t gen Tef1 36 Hình 3.6 K t qu n di s n ph m PCR đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol: Chloroform 37 Hình 3.7 K t qu n di s n ph m PCR đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol: Chloroform có b sung -mercaptoethanol 38 Hình 3.8 K t qu n di s n ph m PCR v i m u n m 39 Hình 3.9 K t qu n di s n ph m PCR v i m u n m 40 Hình 3.10 K t qu thi t l p chu k nhi t PCR khu ch đ i vùng gen Tef1 c a n m ký sinh côn trùng 40 Hình 3.11 K t qu n di s n ph m PCR v i m u n m 41 Hình 3.12 Hi u ch nh tín hi u nhi u t i vùng (1) đ u m ch xuôi (5’-3’) 42 Hình 3.13 Hi u ch nh tín hi u nhi u t i vùng (2), (3), (4) đ u m ch xuôi (5’-3’) 42 Hình 3.14 V trí sai l ch vùng (2) đ u m ch xuôi (5’-3’) 43 Hình 3.15 V trí sai l ch vùng (4) đ u m ch xuôi (5’-3’) 43 Hình 3.16 V trí sai l ch vùng (3) đ u m ch xuôi (5’-3’) 44 Hình 3.17 Hi u ch nh vùng gi a m ch 44 SVTH: PH M XUỂN XINH v KHịA LU N T T NGHI P Hình 3.18 Hi u ch nh vùng (5) gi a m ch xuôi (5’-3’) 44 Hình 3.19 Hi u ch nh vùng cu i m ch xuôi (5’-3’) 45 Hình 3.20 V trí sai l ch c a hai k t qu gi i trình t cu i m ch xi (5’-3’) 45 Hình 3.21 K t qu BLAST trình t Tef1 m ch xuôi đƣ hi u ch nh 46 Hình 3.22 Ki m tra m c đ t ng đ ng b ng công c Dot plot 46 Hình 3.23 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp NJ c a gen Tef1 v i b d li u 68 trình t 49 Hình 3.24 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp ML c a gen Tef1 v i b d li u 68 trình t 50 Hình 3.25 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp MP c a gen Tef1 v i b d li u 68 trình t 51 SVTH: PH M XUỂN XINH vi KHịA LU N T T NGHI P DANH SÁCH CH VI T T T ATP : Adenosine triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : base-pair DNA : deoxyribonucleotide triphosphate ML : maximum likelihood MP : maximum parsimony NJ : neighbor-joining rDNA : ribosomal DNA RNA : ribosomal RNA TEF1 : The elongation factor alpha SVTH: PH M XUỂN XINH vii KHịA LU N T T NGHI P TV N N m Cordyceps đ d c bi t đ n lƠ m t lo i n m ký sinh trùng mang l i giá tr c tính cao nh ho t tính kháng oxy hóa, hi u qu b t g c t do, kháng kh i u, đáp ng mi n d ch, N m Cordyceps có thƠnh ph n loƠi vơ phong phú vƠ kh n ng bi n đ i cao giai đo n phát tri n đƣ n cho nhƠ nghiên c u g p nh m l n vi c xác đ nh tên loƠi Tuy nhiên, nh ng nghiên c u v hình thái h c hay ph ng pháp truy n th ng g p nhi u h n ch b i m i quan h gi a th vơ tính (anamorph) vƠ th h u tính (teleomorph) c a chúng Trái l i, vi c áp d ng ph ng pháp đ nh danh phơn t d a vƠo nh ng đo n gen chuyên bi t hay ch c n ng mang đ c tr ng c a loƠi sinh v t tr lên c n thi t vƠ hi u qu Do xác đ nh vùng gen chuyên bi t nh vùng Tef1 lƠ gen mƣ hóa cho protein EF-1 s cho k t qu xác h n Gen nƠy l n đ u tiên đ nghiên c u phát sinh loƠi đ tìm m i t c s d ng nh m t marker ng quan vƠ m c đ di truy n gi a loƠi Vì th , d a vƠo vùng gen Tef1 có th phơn bi t gi a chi v i hay gi a loƠi chi Do tính ch t quý hi m c ng nh giá tr có s chênh l ch cao gi a loƠi chi n m Cordyceps nên nhi u ng i đƣ l m d ng, gi m o chúng Vì v y, phơn bi t xác tên loƠi thu c chi n m nƠy s cung c p thông tin quan tr ng v ngu n g c c a Cordyceps đ có ngu n d c li u t t cho ng vi c lƠm c p thi t Tuy nhiên, nghiên c u loƠi nƠy ch môi tr n i s d ng lƠ m t c đ n ch h n ng nuôi c y chúng, ch a th t s quan tơm nhi u đ n đ nh danh m t s n m Cordyceps vƠ chi n m liên quan Xu t phát t th c t trên, ti n hƠnh đ tƠi H tr đ nh danh n m ký sinh côn trùng d a phân tìch ph h vùng gen Tef1 v i hy v ng góp ph n xơy d ng ph ng pháp lu n nghiên c u nh m m c tiêu h tr đ nh danh n m ký sinh côn trùng lƠm n n t ng cho nghiên c u ng d ng sau nƠy SVTH: PH M XUỂN XINH KHịA LU N T T NGHI P K t qu hình cho th y, đ th đ ph n ánh s t c bi u di n b ng m t đ ng chéo liên t c ng đ ng cao gi a hai k t qu gi i trình t B ng 3.8 T ng h p k t qu hi u ch nh trình t gen Tef1 c a m u ký sinh c n trùng STT M u Lo i tín hi u K t qu DL006 R c hai m ch X DL0015 R c hai m ch X DL0038B R c hai m ch X DL0069 R c hai m ch X DL0075 R c hai m ch X DL0077 R c hai m ch X Chú thích: K t lu n: X: có th dùng cho phơn tích v sau; “-” : khơng th dùng cho phơn tích v sau B ng 3.9 K t qu chi u dƠi trình t gen Tef1 tr STT M u Chi u dƠi tr c c vƠ sau hi u ch nh Chi u dƠi sau hi u ch nh hi u ch nh DL006 1021 938 DL0015 1026 770 DL0038 1033 884 DL0069 1040 939 DL0075 954 750 DL0077 1026 922 SVTH: PH M XUỂN XINH 47 KHịA LU N T T NGHI P 3.6 K T QU SO SÁNH V I C S D LI U GENBANK B ng 3.10 K t qu so sánh trình t Tef1 đƣ h u ch nh v i trình t Genbank M u LoƠi t ng đ ng nh t Accession Chi u Number dƠi đƣ coverage Genbank Query Max E- S Tái ident value mismatch ch p hi u nh n ch nh (*) DL0015 Cordyceps Pruinosa EF468762 750 99% 99% 0.0 Ch p nh n DL0075 Beauveria bassiana JQ867157 770 100% 99% 0.0 Ch p nh n DL0006 Lencanicillium psalliotae EF469067 938 100% 96% 0.0 Ch p nh n DL0038 Isaria tenuipes KC519365 883 99% 98% 0.0 Ch p nh n DL0069 Simplicillum lanosoniveum DQ522356 939 98% 90% 0.0 Ch p nh n DL0077 Simplicillum lamellicola DQ522356 923 100% 92% 0.0 Ch p nh n (*): Tái ki m tra v trí sai l ch bi u đ tín hi u hu nh quang “Ch p nh n” ch p nh n sai l ch vƠ gi nguyên k t qu hi u ch nh trình t b i tín hi u hu nh quang r t r rƠng t i nh ng v trí nƠy 3.7 K T QU XỂY D NG CỂY PH H PHỂN T Qua k t qu đ a hình h c c a cơy ph h phơn t t c s d li u c c b có s t ng đ ng so v i Sung vƠ c ng s Vì v y, đƣ b sung m u n m DL006, DL0038B, DL0077A, DL0069, DL0075, DL0015 vƠo c s d li u tr c Chúng tơi ti p t c xơy d ng cơy ph h phơn t đ nh danh nh m xác đ nh tên loƠi c a m u n m ký sinh côn trùng SVTH: PH M XUỂN XINH 48 KHịA LU N T T NGHI P DL0077 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 Cordyceps cf acicularis DL0075 Cordyceps scarabaeicola DL0038B DL0069 Cordyceps militaris DL0015 Mariannaea pruinosa Isaria tenuipes OSC 111007 DL006 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 cordyceps clade Lecanicillium psalliotae CBS 101270 Cordyceps tuberculata Torrubiella confragosa Cordyceps cardinalis CBS 113411 Cordyceps cardinalis CBS 11412 cordyceps clade Lecanicillium antillanum CBS 726.73 Engyodontium aranearum Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simiplicillium clade Simplicillium lanosoniveum CBS 101267 Sphaerostilbella berkeleyana Hypocreaceae Verticillium incurvum Aphysiostroma stercorarium Hypocrea lutea Cordyceps capitata Cordyceps ophioglossoides C.ophioglossoides clade Cordyceps fracta Cordyceps japonica Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Cordyceps gunnii Haptocillium balanoides Haptocillium zeosporum Haptocillium sinense Cordyceps taii Metarhizium anisopliae Metarhizium flavoviride Metarhizium album C.taii clade Rotiferophthora angustispora Cordyceps chlamydosporia Pochonia chlamydosporia Pochonia gonioides Shimizuomyces paradoxus EF CC 6279 Shimizuomyces clade Shimizuomyces paradoxus EF CC6564 Verticillium epiphytum CBS 384.81 Epichloe typhina Balansia henningsiana Balansia pilulaeformis Hypocrella schizostachyi Aschersonia placenta Hypocrella clade Aschersonia badia Hypocrella sp Hydropisphaera erubescens Hydropisphaera peziza Bionectraceae Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Leuconectria clusiae Pseudonectria rousseliana Cosmospora coccinea Nectriaceae Nectria cinnabarina Ophionectria trichospora CBS 109876 Viridispora diparietispora Verticillium dahliae Glomerella cingulata out group Glomerella cingulata F AU 553 Cordyceps agriota Hình 3.23 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph Tef1 v i b d li u 68 trình t SVTH: PH M XUỂN XINH ng pháp NJ c a gen 49 KHịA LU N T T NGHI P Cordyceps taii Metarhizium anisopliae Metarhizium flavoviride Metarhizium album Rotiferophthora angustispora Cordyceps chlamydosporia Pochonia chlamydosporia Pochonia gonioides Verticillium epiphytum CBS 384.81 Clade A Shimizuomyces paradoxus EF CC 6279 Shimizuomyces paradoxus EF CC6564 Epichloe typhina Aschersonia badia Hypocrella sp Hypocrella schizostachyi Aschersonia placenta Balansia henningsiana Balansia pilulaeformis Haptocillium sinense Haptocillium balanoides Haptocillium zeosporum Cordyceps gunnii Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Clade B Cordyceps capitata Cordyceps ophioglossoides Cordyceps fracta Cordyceps japonica Aphysiostroma stercorarium Hypocrea lutea Hypocreaceae Sphaerostilbella berkeleyana Verticillium incurvum Ophionectria trichospora CBS 109876 Viridispora diparietispora Cosmospora coccinea Nectriaceae Nectria cinnabarina Leuconectria clusiae Pseudonectria rousseliana DL0077 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 Cordyceps cf acicularis Cordyceps agriota DL0038B DL0069 Simplicillium clade Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simplicillium lanosoniveum CBS 101267 Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Cordyceps cardinalis CBS 113411 Cordyceps cardinalis CBS 11412 Lecanicillium antillanum CBS 726.73 Engyodontium aranearum DL0015 Mariannaea pruinosa Cordyceps militaris DL0075 Cordyceps scarabaeicola Isaria tenuipes OSC 111007 DL006 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 Lecanicillium psalliotae CBS 101270 Cordyceps tuberculata Torrubiella confragosa Hydropisphaera erubescens Hydropisphaera peziza Bionactriaceae Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Verticillium dahliae Glomerella cingulata out group Glomerella cingulata F AU 553 Hình 3.24 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph Tef1 v i b d li u 68 trình t SVTH: PH M XUỂN XINH ng pháp ML c a gen 50 KHịA LU N T T NGHI P Sphaerostilbella berkeleyana Verticillium incurvum Epichloe typhina Pochonia gonioides Metarhizium flavoviride Cordyceps chlamydosporia Pochonia chlamydosporia Rotiferophthora angustispora Metarhizium album Cordyceps taii Metarhizium anisopliae Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279 Shimizuomyces clade Shimizuomyces paradoxus EFCC6564 Verticillium epiphytum CBS 384.81 Balansia henningsiana Balansia pilulaeformis Aschersonia placenta Aschersonia badia Hypocrella clade Hypocrella sp Aphysiostroma stercorarium Hypocreaceae Hypocrea lutea Leuconectria clusiae Pseudonectria rousseliana Cosmospora coccinea Nectriaceae Nectria cinnabarina Ophionectria trichospora CBS 109876 Viridispora diparietispora Cordyceps gunnii Haptocillium balanoides C gunnii clade Haptocillium zeosporum Cordyceps capitata Cordyceps ophioglossoides C ophioglossoides clade Cordyceps fracta Cordyceps japonica Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Haptocillium sinense Hypocrella schizostachyi Cordyceps agriota Cordyceps cf acicularis Isaria tenuipes OSC 111007 DL0075 Cordyceps scarabaeicola DL0077 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 Simpicillium clade Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simplicillium lanosoniveum CBS 101267 DL0038B DL0069 DL006 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 Cordyceps tuberculata Lecanicillium psalliotae CBS 101270 Torrubiella confragosa DL0015 Mariannaea pruinosa cordyceps clade Cordyceps militaris Cordyceps cardinalis CBS 113411 Cordyceps cardinalis CBS 11412 Lecanicillium antillanum CBS 726.73 Engyodontium aranearum Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Verticillium dahliae out group Glomerella cingulata out group Glomerella cingulata FAU 553 Hydropisphaera erubescens Hydropisphaera peziza Bionetriaceae Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Hình 3.25 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph Tef1 v i b d li u 68 trình t SVTH: PH M XUỂN XINH ng pháp MP c a gen 51 Clade C KHịA LU N T T NGHI P K t qu đ a hình h c c a ba cơy ph h xơy d ng b ng ba ph ng pháp Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) vƠ Maximum Likehood (ML) kh o sát vùng gen Tef1 đ u t Sung đƣ th ng đ ng vƠ t ng thích v i cơy mƠ nhóm c hi n Các giá tr bootstrap t t c cơy ph h đ u có ý ngh a (l n h n 50) Sau thi t l p cơy phát sinh loƠi theo ph ng pháp, m u n m kh o sát đ u chung m t nhóm l n mƠ khơng có m u nƠo b tách riêng xa Chúng tơi k t h p phơn tích k t qu d a ph h phơn t vùng gen Tef1 vƠ truy v n trình t t ng đ ng Genbank (NCBI) đ đ nh danh m u DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075 vƠ DL0077 Chi ti t phơn tích nƠy đ th hóa cho t ng tr cc ng h p m u M u DL0077 ln phơn nhóm v i đ i di n tham chi u Simplicillium lamellicola thu c ngơn hƠng gi ng CBS 116.25 v i mƣ s truy c p DQ 522356 (Sung vƠ c ng s , 2007) v i giá tr bootstrap 99% c cơy (NJ, ML, MP) so sánh v i Genkbank (NCBI) cho k t qu Simplicillum lamellicola (DQ522356) T t ng th i k t qu ng đ ng cao nh t v i đó, chúng tơi đ a k t qu m u DL0077 lƠ loƠi r t g n v i Simplicillum lamellicola M u DL006 phơn nhóm v i trình t tham kh o Lecanicillium psalliotae (EF469067) t ngơn hƠng gi ng CBS 532.81 K t qu phơn nhóm nƠy đ u có c ba lo i cơy NJ (Neighbor-Joining), ML (Maximum Likelihood), MP (Maximum Parsimony) vƠ DL006 th hi n s psalliotae Cùng v i k t qu phơn thƠnh đ n nhóm v i Lecanicillium kh o sát Genbank (NCBI) (Lecanicillium psalliotae) cho m u nƠy, đƣ ch ng minh r : m u n m DL006 thu đ c lƠ m t loƠi r t g n v i Lecanicillium psalliotae Hai m u DL0038B vƠ DL0069 t o thƠnh đ n nhóm c ba cơy ph h phơn t v i giá tr bootstrap r t cao (99%) V y có th k t lu n hai m u nƠy lƠ bi n d khác c a m t loƠi ho c hai loƠi khác chi Hai m u nƠy đ u phơn thƠnh đ n nhóm v i đ i di n tham chi u thu c chi Simplicillum, đ c bi t lƠ loƠi Simplicillum lamellicola (trên cơy ML, MP) vƠ đ i diên tham chi u thu c chi Simplicillum, Cordyceps (NJ) K t qu phơn tích c th m u nh sau: M u DL0069 cho k t qu phơn tích Genbank t ng đ ng v i loƠi Simplicillum lamellicola (DQ 522356) t ngơn hƠng gi ng CBS 116.25, k t qu SVTH: PH M XUỂN XINH 52 KHịA LU N T T NGHI P nƠy trùng v i k t qu cơy ph h phơn t T đó, có th đ a k t lu n m u DL0069 lƠ loƠi r t g n ho c t ng đ ng v i Simplicillum lamellicola M u DL0038B phơn nhóm cơy phơn phát sinh loƠi cho th y m i quan h g n nh t v i đ i di n tham chi u loƠi Simplicillum lamellicola v i giá tr bootstrap đáng tin c y (71% đ i v i cơy MP, 63% đ i v i ML), có quan h g n v i chi Simplicillum, Cordyceps (cơy NJ) Tuy nhiên, k t qu truy v n Genbank (NCBI) cho th y m u nƠy t ng đ ng nh t v i Isaria tenuipes (KC 519365) thu c chi Cordyceps V i nh ng d li u hi n có, chúng tơi k t lu n m u DL0038B lƠ m t loƠi thu c chi Cordyceps ho c g n v i loƠi Simplicillum lamellicola M u DL0015 phơn thƠnh v i tr s bootstrap đ t 99% c ba cơy Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) vƠ Maximum Likehood (ML) v i đ i di n tham chi u lƠ Cordyceps pruinosa (AY184968) t ngơn hƠng gi ng ARSEF 5413 K t qu kh o sát Genbank (NCBI) vƠ cơy phát sinh loƠi vùng gen Tef1 đ u ng h DL0015 lƠ loƠi t ng đ ng Cordyceps pruinosa (có th vơ tính Mariannaea pruinosa) M u DL0075 cho k t qu phơn nhóm c ba cơy Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) vƠ Maximum Likehood (ML) v i Cordyceps scarabaeicola (AF339524) t ngơn hƠng gi ng ARSEF 5689, v i giá tr bootstrap cao (99% đ i v i cơy ML, MP) K t qu so sánh v i Genbank NCBI vƠ ph h phơn t vùng gen Tef1 đ u ch ng minh r DL0075 lƠ loƠi r t g n v i Cordyceps scarabaeicola (có th vơ tính thu c chi Beauveria sp.) SVTH: PH M XUỂN XINH 53 KHịA LU N T T NGHI P B ng 3.11 T ng h p k t qu đ nh danh m u n m t d li u phơn t vƠ Genbank LoƠi t M u ng đ ng nh t Cơy ti n hóa NJ Cơy ti n hóa ML Cơy ti n hóa MP K t lu n Cordyceps Marinnaea Marinnaea Pruinosa pruinosa pruinosa DL0075 Beauveria bassiana Cordyceps scarabaeicola Cordyceps scarabaeicola Cordyceps scarabaeicola DL006 Lencanicillium psalliotae Lecanicillium psalliotae Lecanicillium Lecanicillium psalliotae psalliotae DL0038B Simplicillum Simplicillum Cordyceps sp ho c Isaria tenuipes lamellicola lamellicola Simplicillum lamellicola DL0069 Simplicillum lanosoniveum Simplicillum Simplicillum lamellicola lamellicola DL0077A Simplicillum lamellicola Simplicillum lamellicola Simplicillum lamellicola Genbank DL0015 SVTH: PH M XUỂN XINH Cordyceps sp ho c Simplicillum sp Cordyceps sp ho c Simplicillum sp Simplicillum lamellicola Marinnaea pruinosa Cordyceps pruinosa (có th vơ tính Marinnaea pruinosa) Cordyceps scarabaeicola (có th vơ tình Beauveria bassiana) Lecanicillium psalliotae Simplicillum lamellicola Simplicillum lamellicola 54 PH N IV K T LU N VÀ NGH KHịA LU N T T NGHI P 4.1 K T LU N 4.1.1 Lý thuy t tƠi c ng đƣ xơy d ng thƠnh cơng quy trình kh o sát in sillico nh m đ nh danh m u n m nh xơy d ng c s d li u c c b g m 62 trình t tham kh o t Sung vƠ c ng s , đánh giá m i IDT, BLAST vƠ Annhyb NgoƠi ra, chúng tơi cịn xơy d ng đ c cơy ph h phơn t 62 trình t b ng ph ng pháp NJ (Neighbor Joining), ML (Maximum Parsimony), ML (Maximum Likelihood) 4.1.2 Th c nghi m Xơy d ng quy trình th c nghi m nh m khu ch đ i vùng gen Tef1 c a m u n m ký sinh trùng nh quy trình tách chi t DNA vƠ quy trình t i u hóa nhi t đ đ khu ch đ i vùng gen Tef1 Gi i trình t vƠ hi u ch nh đ sinh trùng Chúng tơi cịn xơy d ng đ c m u n m ký c cơy ph h phơn t đ nh danh c a m u nh m xác đ nh tên loƠi c a m u n m ký sinh côn trùng 4.2 NGH Trong th i gian t i, m t s h ng nghiên c u ti p t c th c hi n cho đ tƠi nh : Ti p t c đ nh danh thêm m u n m ký sinh côn trùng khác K t h p k t qu đ nh danh m u n m d a vùng gen Tef1 vƠ k t qu đ nh danh s b đ có th xác đ nh xác tên loƠi nh ng m u ch a th k t lu n đ tƠi nƠy NgoƠi ra, d ki n k t h p thêm m t ho c hai vùng gen khác đ đ nh danh loƠi n m nƠy SVTH: PH M XUỂN XINH 55 KHịA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O TÀI LI U TI NG VI T [1] Bùi Chí B u, Nguy n Th Lang, (1999), "Di truy n phơn t - Nh ng nguyên t c c b n chon gi ng cơy tr ng", hà xu t b n ơng nghi p, thành ph H Chì Minh [2] L i HƠ T Hoa, (2006), “ nh danh n m Trichoderma d a vƠo trình t vùng ITS ậ rDNA vƠ vùng Tef1” [3] Nguy n D ng Khuê, 2005 “S d ng n m Metarhizium anisopliae Sorok phòng tr m i nhƠ (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo ph ng pháp lơy nhi m”, H i ngh côn trùng h c toàn qu c l n th HƠ N i 11-12/04/2005 Trang 409 ậ 414 [4] Ph m Quang Thu (2013), “ ông trùng h th o vƠ nghiên c u nuôi tr ng th qu vi n Khoa h c Lơm nghi p Vi t Nam”, H i th o qu c t ngh ph c v s n xu t nông nghi p công ngh cao t nh âm hoa h c công ng [5] Tr nh Tam Ki t (2001), “Danh l c loƠi th c v t Vi t Nam (ph n N m)”, hà xu t b n ông nghi p, Hà i TÀI LI U TI NG ANH [6] Baldauf, S.L., Doolittle, W.F (1997), “Origin and evolution of slime molds (Mycetozoa)” Proc Natl Acad Sci USA 94, pp 12007-12012 [7] Berkeley, M.J., Broome, C.E (1875), “On the fungi of Ceylon”, Journal Linnean Society 14, pp 110 [8] Buyck B, Hofstetter V (2011), “The contribution of tef-1 sequences to species delimitation in the Cantharellus cibarius species complex in the southeastern USA”, Fungal Diversity 49, pp 35-46 [9] Castlebury L A., Rossman A Y., Sung G H., Hyten A S., Spatafora J W (2004), “Multigene phylogeny reveals new lineage for Stachybotrys chartarum, the indoor air fungus”, Mycol Res 108, pp 864-872 [10] Cho S, Mitchell A, Regier JC, Mitter C, Poole RW, Friedlander TP, Zhao S, (1995), “A highly conserved nuclear gene for low-level phylogenetics: SVTH: PH M XUỂN XINH 56 KHịA LU N T T NGHI P elongation factor-1 alpha recovers morphology-based tree for heliothine moths”, Mol Biol Evol 12 (4), pp 650 [11] Dowell K (2008), “Molecular Phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationship”, Math 500, pp 1-16 [12] Druzhinina I., Kubicek C P (2005), “Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters”, Journal of Zhejiang University SCIENCE 6B(2), pp 100-112 [13] Hajek, A.E and R.J St Leger.( 1994), “Interactions between fungal pathogens and insect hosts” Annu Rev Entomol 39, pp 293-322 [14] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), “Toiypocladium injatum isthe anamorph of Cordyceps subsessilis”, Mycologia 88(5), pp 715-719 [15] Itoh, H., Shioda, T., Matsura, T., Koyama, S., Nakanishi, T., Kajiyama, G., Kawasaki, T (1994), “Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC Rat Hepatoma Cell Culture - Role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses”, Arch Biochem Biophys 313 (1), pp 120-125 [16] Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella”, Transactions of the Mycological Society of Japan 23, pp 329364 [17] Kuo H C.,Su Y L., Yang H L., Chen T Y (2005), “Identification of Chinese Medicinal Fungus Cordyceps sinensis by PCR- Single-Stranded Conformation Polymorphism and Phylogenetic Relationship” J gris Food Chem [18] Li SP, Li P, Dong TTX, Tsim KWK, (2001), “Anti-oxidation activity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia’’, Phytomedicine, (3), pp 207-212 [19] Linz JE, Lira LM, Sypherd PS (1986),"The primary structure and the functional domains of an elongation factor-1 alpha from Mucor racemosus" J Biol Chem 261(32), pp 15022ậ15029 SVTH: PH M XUỂN XINH 57 KHịA LU N T T NGHI P [20] Liu, Z.Y., Liang, Z.Q., Whalley, A.J.S., Liu, A.Y and Yao, Y.J (2001), “A new species of Beauveria, the anamorph of Cordyceps sobolifera”, Fungal Diversity 7, pp 61-70 [21] Mao X.L.(2000), “The macrofungi in China”, Henam Technical and Science Publication House [22] Matheny, P B., Wang Z., Binder M., Curtis, J M., Lim, Y W., Nilsson, H R., Hughes, K W., Hofstetter, V., Ammirati, J F., Schoch, C., Langer, E., Langer, G., McLaughlin, D J., Wilson, A W., Frøslev, T., Ge, Z W., Kerrigan, R W., Slot, J C., Yang, Z L., Baroni, T J., Fischer, M., Hosaka, K., Matsuura, K., Seidl, M T., Vauras, J., and Hibbett, D S (2007) “Contributions of rpb2 and tef1 to the phylogeny of mushrooms and allies (Basidiomycota, Fungi)”, Molecular Phylogenetics and Evolution 43, pp 430451 [23] McCoy, C.W.(1990), “Entomogenous fungi as microbial pesticides”, pp 139159 In R.R Baker, and P.E Dunn (eds.), New Directions in Biological Control Alan R Liss, New York pp 139-159 [24] Moldave, K (1985), “Eukaryotic protein synthesis”, Annual review of biochemistry 54, pp 1109-1149 [25] Pokalsky A R, Hiatt W R, Ridge N, Houck C M and Shewmaker C K (1989), “Structure and expression of elongation factor alpha in tomato”, Nucleic Acids Res 17 (12), pp 4661- 4673 [26] Rehner.S.A, Buckley.E, (2005), “A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs”, Mycologia 97(1), pp 84ậ98 [27] Shah, P.A and J.K Pell.,(2003), “Entomopathogenic fungi as biological control agents” Appl Microbiol Biotech.61, pp 413-423 [28] Sun, Y.J., Lü, P., Ling, J.Y., Zhang, H.X., Chen, C., Zhang, C.K (2003), “Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690 ậ 694 [29] Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., Spatafora J W (2007), “A multigene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of SVTH: PH M XUỂN XINH 58 KHịA LU N T T NGHI P localized incongruence using a combinational bootstrap approach”, Molecular Phylogenetics and Evolution, in press [30] Sung Gi-Ho, Hywel-Jones Nigel L., Sung Jae-Mo, Luangsa-ard J Jennifer, Shrestha Bhushan, Spatafora Joseph W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”, Stud Mycol 57 (1), pp 5ậ59 [31] Sung Jae Mo ,(2000) “Insect-born fungus of Korea”, Kangwon National Univ., Korea [32] Waddington M, (2009),”Identification of Fungi Using Ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Sequences”, Pharmaceutical Technology [33] Wang BJ, Won SJ, Yu ZR, Su CL, (2005), “Free radical scavenging and apoptoric effects of Cordyceps sinensis fractionated by supercritical carbon dioxide”, Food chem toxicol 43 (4), pp 543-552 [34] Wang, S.Y., Shiao, M.S (2000), “Pharmacological functions of Chinese medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species”, Journal of Food and Drug Analysis (4), pp 248 ậ 257 [35] White T J., Bruns T., Lee S., Taylor J (1990), “Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics”.In Innis, M A., Gelfand, D H., Sninsky, J J., White, T J., (Eds) PCR protocols, a guide to methods and applications, Academic Press: San Diego pp 315-322 [36] Xie, J.W., Huang, L.F., Hu, W., He, Y.B., Wong, K.P (2010), “Analysis of the main nucleosids in Cordyceps sinensis by LC/ESI-MS”, Molecules 15, pp 305 ậ 314 [37] Yoshikawa, N., Nakamura, K., Yamaguchi, Y., Kagota, S., Shinozuka, K., Kunitomo, M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2’ ậ Deoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo 21, pp 291 ậ 296 [38] Yu, H.M., Wang, B.S., Huang, S.C., Duh, P.D (2006), “Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage”, ational Science Council of the epublic of China, China SVTH: PH M XUỂN XINH 59 KHịA LU N T T NGHI P [39] Zhou, X., Gong, Z., Su, Y., Lin, J., Tang, K (2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journnal of Pharmacy and Pharmacology 61, pp 279 ậ 291 [40] Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones (1998), “The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis”, Part I J Altern Complement Med 4(3), pp 289-303 WEBSITE [41] Báo n t , Greebiotech ậ Th c ph m dinh d ng- Gi i pháp s c kh e cho m i nhƠ [42] Báo n t Th n d c ông trùng h th o - Cơu l c b n m tr ng Vi t Nam- Mush clubVN Com.NgƠy 3/5/2009 [43] http://en.wikipedia.org/wiki/Cordycepin [44] http://en.wikipedia.org/wiki/Ergosterol [45] http://www.mushroomexpert.com/cordyceps_militaris.html SVTH: PH M XUỂN XINH 60