Ki m tra n ng đ DNA b ng ph ng pháp đo m t đ quang b c sĩng
SVTH: PH M XUỂN XINH 23 2.3.5. PCR 2.3.5.1. Thành ph n ph n ng PC B ng 2.1. ThƠnh ph n ph n ng PCR ThƠnh ph n N ng đ Th tích Master mix 7,5l Primer Forward 10M 0,5 µl Primer reverse 10M 0,5 µl DNA 1µl
Water free nuclease 5,5 µl
T ng 15µl
2.3.5.2. Chu k nhi t cho ph n ng PC
Hình 2.1. Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i 983F/ 2218R
SVTH: PH M XUỂN XINH 24
2.3.6. i n di
Trên gel agarose 1,5%, đ m TBE 1X, đi n th 70V, trong 50 phút. Xem k t qu b ng máy ch p nh gel.
2.3.7. Gi i trình t
Các s n ph m khu ch đ i vùng Tef1 đ c đi gi i trình t cơng ty Nam Khoa.
2.3.8. Hi u ch nh trình t
2.3.8.1. o i b nh ng tìn hi u khơng chình xác hai đ u trính t kh o sát
i v i các tín hi u 2 đ u mƠ m i khuy ch đ i, tín hi u th ng l n vƠ cĩ biên đ khơng n đ nh, các đ nh tín hi u khơng r rƠng. V i các tin hi u g n cu i trình t , c ng đ th ng r t th p vƠ khơng th phơn bi t r rƠng các đ nh. Vi c đ c base vùng nƠy hoƠn toƠn khơng đ m b o đ c đ tin c y vƠ c n đ c lo i b .
2.3.8.2. i m tra các sai l ch gi a hai k t qu gi i trính t
Thơng th ng, đo n DNA kh o sát s đ c gi i trình t hai l n b i m i xuơi vƠ m i ng c. Vi c nƠy s giúp gi m thi u vi c đ c sai base, nh ng tín hi u khơng r rƠng trong trình t khi đ c v i m i xuơi cĩ th đ c gi i quy t trong k t qu đ c v i m i ng c vƠ ng c l i. Do đ c đ c theo hai chi u nên m t trong hai k t qu c n đ c đ i l i (reverse-complement) tr c khi ti n hƠnh so sánh. M c đ t ng đ ng vƠ tìm sai l ch gi a hai k t qu gi i trình t (m i xuơi vƠ m i ng c) đ c th c hi n b ng cơng c Dot plot vƠ Alignment c a Sea View. Hai trình t sau khi đ c s p giĩng c t c n ph i t ng đ ng nhau, nh ng sai l ch thu đ c cho th y các sai sĩt trong khi đ c base b ng máy t đ ng vƠ c n đ c ki m tra tr c ti p l i trên bi u đ phát hu nh quang (hi n th nh ph n mêm Chromas Pro).
So sánh tín hi u hu nh quang ngay t i v trí sai l ch gi a hai k t qu gi i trình t cĩ th xác đ nh đ c đúng lo i base nƠo t ng ng v trí đĩ. Trong m t vƠi tr ng h p, các tín hi u v n khơng th phơn bi t, nh ng v trí nƠy s đ c ghi nh n vƠ xác nh n l i ho c vi t d i d ng kí hi u chung theo m u IUPAC (IUPAC
ambigous nucleotide code).
V i nh ng k t qu mƠ s khác bi t khi s p giĩng c t quá l n (s t ng đ ng d i 50%) do tín hi u hu nh quang r t nhi u v trí khơng th phơn bi t đ c
SVTH: PH M XUỂN XINH 25
(th ng lƠ do m u b nhi m các DNA khác lƠm cho nhi u trình t đ c xác đ nh cùng trên m t thí nghi m) khi đĩ các trình t khơng th đ c s d ng đ phơn tích, vi c hi u ch nh các trình t nƠy khơng cịn ý ngh a vƠ đ tin c y.
2.3.9. So sánh v i c s d li u
Sau khi hi u ch nh các sai l ch, trình t b o t n (consensus) đ c rút ra t hai k t qu gi i trình t đƣ ki m tra các sai l ch. Trình t consensus lƠ trình t t ng đ i chính xác cho đo n DNA kh o sát. Tuy nhiên, k t qu nƠy c n đ c ki m tra m t l n n a trên cƠc c s d li u nucleotide nh Genbank b ng Blastn. Các sai l ch n u cĩ gi a trình t trên c c s d li u vƠ trình t truy v n c n đ c xem xét vƠ ki m tra tín hi u hu nh quang các v trí nƠy m t l n n a đ xác nh n k t qu gi i trình t . NgoƠi ra, vi c th c hi n BLAST cịn giúp ki m tra s nhi m m u vƠ đánh giá quá trình thu nh n vƠ b o qu n m u.
2.3.10. Xơy d ng b c s d li u DNA
NgoƠi các m u n m đ c tr c ti p thu nh n trình t , trình t c a các loƠi n m thu c chi Cordyceps vƠ các chi h hƠng trong h Clavicipitaceae đ c tham kh o trên genbank sau đĩ đ a thêm vƠo trong phơn tích phát sinh loƠi.
2.3.11. Dị tìm m hình ti n hĩa
Xác đ nh mơ hình ti n hĩa phù h p nh t đ d ng cơy Maximum likelihood b ng ch c n ng Find Best DNA/Protein Models (ML) trong Mega 6.06. Mơ hình cĩ đi m s BIC score th p nh t lƠ mơ hình t t nh t đ d ng cơy ML. Các cơy Neighbour-Joining vƠ cơy Maximum Parsimony s d ng mơ hình ti n hĩa theo m c đ nh c a ch ng trình Mega.
2.3.12. Xơy d ng cơy phát sinh loƠi
Theo ph ng pháp Maximim Likelihood: đ c t o b ng ph n m m MEGA 6.06 s d ng các thơng s mơ hình ti n hĩa t ch c n ng Test Models.
Theo ph ng pháp Neighbor Joining: đ c th c hi n b ng MEGA 6.06. Cơy ti n hĩa đ c suy ra v i thu t tốn Neighbor-Joining.
Theo ph ng pháp Maximum Parsimony: đ c th c hi n b ng MEGA 6.06 v i thi t l p ch y v i giá tr bootstrap lƠ 1000 l n.
PH N III.
SVTH: PH M XUỂN XINH 26
3.1. K T QU KHAI THÁC D LI U
Vi c khai thác d li u (các cơng b đƣ cĩ trên th gi i) khơng nh ng khái quát l i m t cái nhìn mang tính t ng qt v v n đ c n nghiên c u (vùng Tef1 c a n m
Cordyceps) mƠ cịn th y đ c nh ng nghiên c u v n m ký sinh cơn trùng Vi t
Nam. Do đĩ, chúng tơi ti n hƠnh thu th p 62 trình t c a gen Tef1 đ s d ngphơn tích cơy phát sinh loƠi. đ m b o đ tin c y c a vi c xơy d ng c s d li u c c b thì các trình t gen Tef1 đ c tham kh o t Genbank v i ngu n g c r rƠng: bƠi báo cơng b , mƣ s truy c p trên Genbank vƠ tên loƠi cùng v i tên ngu n g c đ y
đ , ví d : CBS: Centraal bureau voor Schimmelculures, Utrecht, The Netherlands,
AREF: A gricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal
Cultures, U.S, ATCC: American Type Culture Collection Center, …
B ng 3.1.Th ng tin trình t gen Tef1 đ c s d ng đ thi t l p cơy phát sinh loƠi.
STT Tên khoa h c n Tef1
1 Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 AF543782
2 Aschersonia badia BCC 8105 DQ522317
3 Aschersonia placenta BCC 7869 EF469056
4 Balansia henningsiana GAM 16112 AY489610
5 Balansia pilulaeformis A.E.G. 94-2 DQ522319
6 Cordyceps cf. acicularis OSC 128580 DQ522326
7 Cordyceps agriotidis ARSEF 5692 DQ522322
8 Cordyceps capitata OSC71233 AY489615
9 Cordyceps cardinalis OSC 93609 DQ522325
10 Cordyceps cardinalis OSC 93610 EF469059
11 Cordyceps chlamydosporia CBS 101244 DQ522327
12 Cordyceps fracta OSC 110990 DQ522328
13 Cordyceps gunnii OSC7 6404 AY489616
14 Cordyceps japonica OSC 110991 DQ522330
15 Cordyceps militaris OSC 93623 DQ522332
16 Cordyceps ophioglossoides OSC 106405 AY489618
17 Cordyceps scarabaeicola ARSEF 5689 DQ522335
SVTH: PH M XUỂN XINH 27
19 Cordyceps tuberculata OSC 111002 DQ522338
20 Cordyceps variabilis ARSEF 5365 DQ522340
21 Cosmospora coccinea AR2741 AY489629
22 Engyodontium aranearum CBS 309.85 DQ522341
23 Epichloë typhina ATCC 56429 AF543777
24 Glomerella cingulata FAU 553 AF543773
25 Glomerella cingulata FAU 513 AF543772
26 Haptocillium balanoides CBS 250.82 DQ522342
27 Haptocillium sinense CBS 567.95 DQ522343
28 Haptocillium zeosporum CBS 335.80 EF469062
29 Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 DQ522344
30 Hydropisphaera peziza GJS92-101 AY489625
31 Hypocrea lutea ATCC 208838 AF543781
32 Hypocrella schizostachyi BCC 14123 DQ522346
33 Hypocrella sp. GJS 89-104 DQ522347
34 Isaria tenuipes OSC 111007 DQ522349
35 Lecanicillium antillanum CBS 350.85 DQ522350
36 Lecanicillium psalliotae CBS 101270 EF469066
37 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 EF469067
38 Leuconectria clusiae ATCC 22228 AY489627
39 Mariannaea pruinosa ARSEF 5413 DQ522351
40 Metarhizium album ARSEF 2082 DQ522352
41 Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 AF543774
42 Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 DQ522353
43 Nectria cinnabarina GJS 89-107 AF543785
44 Ophionectria trichospora CBS 109876 AF543779
45 Pochonia chlamydosporia CBS 504.66 EF469069
46 Pochonia gonioides CBS 891.72 DQ522354
47 Pseudonectria rousseliana AR 2716 AF543780
48 Rotiferophthora angustispora CBS 101437 AF543776
49 Roumegueriella rufula CBS 346.85 DQ522355
50 Roumegueriella rufula GJS 91-164 EF469070
51 Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279 EF469071
SVTH: PH M XUỂN XINH 28
53 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 DQ522356
54 Simplicillium lanosoniveum IMI 317442 DQ522357
55 Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 DQ522358
56 Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 AF543783
57 Torrubiella confragosa IMI 304807 DQ522359
58 Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 DQ522360
59 Verticillium dahliae ATCC 16535 AY489632
60 Verticillium epiphytum CBS 384.81 DQ522361
61 Verticillium incurvum CBS 460.88 DQ522362
62 Viridispora diparietispora ATCC MYA 627 AY489630
3.2. K T QU XỂY D NG CỂY PH H PHỂN T T C S D LI U C C B D LI U C C B
Sau khi thu th p c s d li u c c b t GenBank, chúng tơi ti n hƠnh xơy d ng cơy ph h phơn t b ng 3 ph ng pháp NJ (Neighbor-Joining), ML (Maximum Likelihood), MP (Maximum Parsimony ) c a 62 trình t trên nh m ki m tra đ a hình h c vƠ s phơn nhánh c a 3 cơy ph h phơn t . T t c các trình t nƠy đ c s p giĩng c t th ng hƠng b ng Clustal vƠ th c hi n hi u ch nh m t s v trí ch a h p lý b ng m t. Sau đĩ, ti n hƠnh d ng cơy b ng ph n m m Mega 6.06, các cơy đ c thi t l p v i bootstrap 1000 l n.
SVTH: PH M XUỂN XINH 29
Hình 3.1. Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp NJ c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t
SVTH: PH M XUỂN XINH 30
Hình 3.2. Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp ML c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t
SVTH: PH M XUỂN XINH 31
Hình 3.3. Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp MP c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t
SVTH: PH M XUỂN XINH 32
K t qu so sánh cơy ph h phơn t c a gen Tef1 b ng 3 ph ng pháp pháp NJ (Neighbor-Joining), ML (Maximum Likelihood), MP (Maximum Parsimony ) v i cơy phát sinh loƠi c a Sung vƠ c ng s đƣ nghiên c u đ u cĩ đ a hình h c t ng đ ng nhau. Do đĩ, chúng tơi ch n cơy ph h phơn t xơy d ng b ng ph ng pháp ML lƠm m u phơn tích đ i di n.
Clade A
Nhĩm Clavicipitaceae Clade A (Clavicipitacease s.s) bao g m m t s phơn nhĩm: Hypocrella clade, Shimizuomyces clade, Claviceps clade, .C. taii clade,
Phơn nhĩm C. taii hay cịn g i lƠ nhĩm Metacordyceps. D a trên k t qu cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b i Sung et al., (2007), nhĩm Metacordyceps bao g m m t s nhĩm chính (C. subg. Cordyceps, C. subg. Neocordyceps, C. subg. Ophiocordyceps. Phơn nhĩm C. subg Ophiocordyceps g m Cordyceps chlamydosporia (Pochonia) chính lƠ Metacordyceps chlamydospria (Evans, et al., 2001). NgoƠi ra phơn nhĩm C. taii nƠy cịn cĩ m t s các loƠi khác nh Pochonia gonioides, Metarhizium anisopliae, Cordyceps taii, Rotiferophthora agustispora… K t qu nƠy phù h p v i k t qu c a Sung et al., (2007).
Phơn nhĩm Claviceps clade bao g m các loƠi Balanisa henningsiana, Balansia pipulaeformis, Epicholoe typhina. Phơn nhĩm Shimizuomyces clade g m
Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279, Shimizuomyces paradoxus EFCC6564 vƠ phơn nhĩm Hypocrella clade g m Hypocrella sp., Aschersonia planceta, Aschersonia badia, Hypocrella.
Trong phơn nhĩm clade A các phơn nhánh nh cĩ các taxa cĩ giá tri bootstrap cao nh (Cordyceps chlamydosporia, Pochonia chlamydosporia) cĩ giá tr 99%; (Cordyceps taii, Metarhizium anisopliae) cĩ giá tr bootstrap 98%, Balansia henningsiana vƠ Balansia pilulaformis đ t 94%, Aschersonia badia và Hypocrella sp cĩ giá tr 59%, các k t qu nƠy hoƠn toƠn phù h p v i phơn nhĩm C.taii clade c a Sung et al., 2007.
Clade B:
Nhĩm Clavicipitaceae Clade B (Ophiocordycipitaceae ) bao g m 5 phơn nhĩm chính: C. unilateralis clade, C. ophioglossoides clade, C.gunnii clade, P. lilacinus
SVTH: PH M XUỂN XINH 33
chúng tơi ch s d ng b c s d li u 62 trình t nên ch xơy d ng đ c 2 phơn nhĩm chính C.gunni clade, C.ophioglossoides clade. Phơn nhĩm C. gunnii clade mƠ chúng tơi xơy d ng đ c r t t ng ng v i k t qu c a Sung, 2007. Trong đĩ, các loƠi Haptocillium balanoides,Cordyceps gunni, trong đĩ giá tr boostrap 50. Phơn
nhĩm C. C.ophioglossoides clade g m các loƠi Cordyceps fracta, cordyceps japonica v i giá tri bootrstrap 54%.
Clade C:
Nhĩm Clavicipitaceae Clade C (Cordycipitaceae) cĩ đ a hình hình h c khá t ng đ ng v i các cơy mƠ Sung đƣ d ng v i giá tr bootrap 66%. Nhĩm nƠy g m 2 phơn nhĩm chính lƠ Simplicillium clade vƠ Cordyceps clade.
Phơn nhĩm Cordyceps clade g m m t s phơn nhĩm chính lƠ (C. subg. Ophiocordyceps, C. subg. Cordyceps, C. subg. Bolacordyceps). Hai phơn nhĩm C. subg. Cordyceps vƠ C. subg. Bolacordyceps đ c x p chung vƠo nhĩm g i lƠ Cordyceps s. s. Trong đĩ, phơn nhĩm C. subg. Cordyceps g m các loƠi: Isaria tenuipes, Cordyceps militaris, phơn nhĩm C. subg. Bolacordyceps g m loƠi
Cordyceps pruinosa, Phơn nhĩm C. subg. Ophiocordyceps g m loƠi Cordyceps cardinalis. a s các nhánh trong phơn nhĩm Cordyceps clade đ u cĩ giá tr bootstrap trên 60%
Phơn nhĩm Simplicillium clade g m các loƠi Simplicillium lamellicola, Simplicillium lanosoniveum mƠ chúng tơi xơy d ng đ c r t t ng ng vƠ phù h p v i cơy mƠ Sung vƠ c ng s th c hi n vƠ đ t giá tr bootstrap 100%.
NgoƠi ra, các nhĩm Bionectriaceae, Nectriaceae, Hypocreaceae vƠ nhĩm ngo i đ u cĩ giá tr bootstrap trên 50% vƠ cho k t qu t ng đ ng v i Sung.
Sau khi xơy d ng cơy ph h phơn t c a 62 trình t c a các loƠi n m ký sinh cơn
trùng, chúng tơi ti n hƠnh s d ng các phơn tích trên lƠm n n t ng cho vi c đ nh danh các m u n m sau nƠy.
SVTH: PH M XUỂN XINH 34
3.3. K T QU ÁNH GIÁ M I3.3.1. ánh giá m i trên IDT 3.3.1. ánh giá m i trên IDT
B ng 3.2. Th ng s đánh giá c p m i 983F/2218R khu ch đ i vùng gen Tef1
Trong đĩ, Tm lƠ nhi t đ nĩng ch y c a m i, L lƠ chi u dƠi đo n m i, (1) lƠ m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc hairpin dimer, (2)
lƠ m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc self dimer, vƠ (3) lƠ m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc hetero dimer. Trong đĩ, F-m i xuơi, R-m i ng c vƠ ký hi u các base trong các đo n trình t m i trên: R lƠ A ho c G, Y lƠ C ho c T.
D a vƠo phơn tích IDT, chúng tơi đƣ ti n hƠnh đánh giá các thơng s quan tr ng c a các c p m i tham kh o nh chi u dƠi m i, thƠnh ph n GC, nhi t đ nĩng ch y, kh n ng hình thƠnh c u trúc k p tĩc, primer dimer c a h th ng m i v i m t s tiêu chí nh sau: chi u dƠi m i lƠ m t y u t quan tr ng trong ph n ng PCR, chi u dƠi thơng th ng dao đ ng 18bp ậ 25bp; M i đ c thi t k v i hƠm l ng GC kho ng 50-60%. Các vùng v i hƠm l ng GC cao h n cĩ th khơng bi n tính t t trong ti n trình PCR, d n đ n ph n ng kém hi u qu . Tránh l p l i các base G hay C liên ti p dƠi h n 3 base. T i đ u 3’ c a m i, c n cĩ base G hay C đ t ng đ đ c hi u cho b t c p; Nhi t đ nĩng ch y c a các m i (Tm) c ng lƠ thơng s r t quan tr ng. D a trên đĩ mƠ ta cĩ th quy t đ nh nhi t đ (b t c p) trong chu trình PCR cho thích h p. Theo nhi u nghiên c u, nhi t đ chênh l ch gi a hai m i xuơi vƠ m i ng c khơng nên quá 5oC (lý t ng lƠ 2-3oC). Duy trì nhi t đ nĩng ch y Tm trong kho ng 50-65oC; M i đ c thi t k cĩ nhi t đ b t c p (lai) trong kho ng 55- 60oC đ tránh s n ph m khu ch đ i khơng đ c hi u; C u trúc th c p bao g m c u trúc k p tĩc (hairpin dimer ậ t b t c p gi a các base trong cùng m t
oligonucleotide), self dimer (hai oligonucleotide gi ng nhau t b t c p) vƠ hetero
Tên
m i Trình t m i (5’-3’) L Tm (1) (2) (3) %GC
982F GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT 23 55,1 61,2 68,2 1,2 -11,8 -8,6 55,7%
SVTH: PH M XUỂN XINH 35
dimer (các oligonucleotide khác nhau b t c p v i nhau). N u c u trúc nƠy cƠng b n v ng thì hi u qu c a ph n ng PCR s cƠng th p vì nĩ s gĩp ph n c n tr kh