Hình trên th hi n k t qu s p x p gi a trình t gen Tef1 vƠ Cordyceps v i đ i di n Cordyceps militaris. Theo k t qu Annhyb cho th y m i xuơi 983F khu ch đ i t v trí 283bp ậ 305bp vƠ m i ng c 2218R khu ch đ i t v trí 1300bp -1322bp thu đ c s n ph m khu ch đ i cĩ chi u dƠi 1040bp, kích th c nƠy n m trong kho ng kích th c 900bp-1200bp mƠ chúng tơi đƣ tham kh o tr c đĩ [25].
T k t qu ki m tra c p m i b ng IDT, BLAST, Annhyb, chúng tơi nh n th y r ng c p m i 983F/ 2218R lƠ c p m i t i u đ dùng cho quá trìnhth c nghi m sau nƠy.
SVTH: PH M XUỂN XINH 37
3.4. XỂY D NG QUY TRỊNH TH C NGHI M KHU CH I VỐNG GEN TEF1 CHO CÁC M U N M Kụ SINH CỌN TRỐNG
Quy trình tách chi t phenol:chloroform đ c kh o sát đ u tiên. K t qu đo m t đ quang 2 m u tiêu bi u đ c trình bƠytrong b ng 3.3.
B ng 3.3. K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát trên 3 m u n m ký sinh c n trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform
M u A260 A260/A280 C (µg/ml)
DL0038B 0,261 1,375 13,061
DL0075 0,117 1,203 5,850
Theo b ng 3.3, giá tr OD A260/A280 c a các m u kh o sát nh h n so v i tiêu chu n (1,8 - 2). i u nƠy ch ng t trong s n ph m tách chi t cĩ ch a nh ng ch t nhi m khác (đ c bi t lƠ protein). Vi c n ng đ các ch t gơy nhi m khá cao cĩ th lƠm sai l ch k t qu ki m tra b ng quang ph k . Tuy nhiên, đ ki m tra s hi n c a gen Tef1, ph n ng PCR v n th c hi n trên các m u DL0038B, DL0075.
Hình 3.6. K t qu đi n di s n ph m PCR đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol: Chloroform
Trong k t qu đi n di, ch cĩ m u DL0075 xu t hi n b ng v i kích th c kho ng
1000bp cịn m u DL0038B khơng xu t hi n b ng. i u nƠy ch ng t hi u qu tách chi t DNA khơng t t. Do v y, đ kh c ph c k t qu trên chúng tơi ti n hƠnh b
SVTH: PH M XUỂN XINH 38
B ng 3.4. K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k các m u n m tách chi t cĩ b sung -mercaptoethanol.
M u A260 A260/280 C (µg/ml)
DL0038B 0,028 1,635 1,394
DL0075 0,029 1,983 1,468
Theo b ng 3.4, k t qu đo m t đ quang choth y giá tr OD A260/A280n m trong kho ng (1,6-2) t t c các m u vƠ đ u cao h n ph ng pháp tách chi t b ng
phenol:chloroform. Nh v y, DNA thu đ c theo ph ng pháp tách chi t b ng phenol:chloroform cĩ b sung -mercaptoethanol cĩ đ tinh s ch cao h n vƠ k t qu đo m t đ quang c ng chính xác h n. K t qu n ng đ các ch t theo ph ng pháp cĩ b sung -mercaptoethanol t t c cácm u gi m đáng k (2-10 l n).
Hình 3.7. K t qu đi n di s n ph m PCR đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol: Chloroform cĩ b sung -mercaptoethanol
K t qu đi n di cho th y l ng DNA đ c khu ch đ i nhi u h n. M u DL0075 cho v ch sáng h n vƠ xu t hi n v ch m u DL0038B v i kích th c s n ph m kho ng 1000bp. T đĩ cho th y, -mercaptoethanol đƣ lo i b đ c t p ch t trong
quá trình tách chi t DNA. Sau khi xơy d ng đ c quy trình th c nghi m đ khu ch đ i vùng gen Tef1 cho các m u n m ký sinh cơn trùng (s d ng ph ng pháp tách chi t b ng phenol:chloroform cĩ b sung -mercaptoethanol). Chúng tơi ti n hƠnh t i u hĩa nhi t đ b t c p c a c p m i 983F/2218R vƠ thêm l ng m u đ t ng hi u qu tách chi t.
SVTH: PH M XUỂN XINH 39
B ng 3.5. K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k các m u n m tách chi t cĩ b sung -mercaptoethanol.
M u A260 A260/A280 N ng đ (µg/ml) DL006 0,0170 1,3509 0,828 DL0015 0,0230 1,0388 1,1519 DL0075 0,0290 1,9832 1,4675 DL0038B 0,0280 1,6347 1,3940 DL0069 0,0180 1,6250 0,0950 DL0077 0,0330 1,4547 1,6748
Qua quá trình tham kh o tƠi li u, chúng tơi đƣ k th a nhi t đ b t c p Ta= 55oC
đ khu ch đ i vùng gen Tef1 c a n m ký sinh cơn trùng [42].