0535HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ VÙNG GEN nrSSU

Nhóm gen gi nhà (housekeeping gene) trong đ nh danh phân t

Nghiên cứu phân tích phylogenetic của nhóm Cordyceps dựa trên các vùng gen mã hóa rRNA (SSU nrDNA, LSU nrDNA) đã được sử dụng để xác định mối quan hệ phân loại trong các loài nấm Tuy nhiên, để cải thiện độ chính xác, các nhà phân loại học đã tìm kiếm các gen thay thế, chủ yếu là các gen mã hóa protein như tef1-, rpb1, rpb2, tub, và atp6 Những gen này đã được chọn trong dự án AFTOL (Assembling the fungal tree of life) và nhiều nghiên cứu khác dựa trên nhiều locus khác nhau, nhằm xây dựng cây phát sinh loài cho nhóm nấm này.

SVTH: Tr ng Th B ch Vân 11

In this study, we utilized housekeeping genes, including nrSSU (nuclear ribosomal small subunit essential for ribosome function), nrLSU (nuclear ribosomal large subunit crucial for ribosome activity), and several other important genes such as tef1 (elongation factor 1), rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II), rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II), tub (tubulin), and atp6 (mitochondrial ATP synthase).

Nhóm gene Cordyceps chứa rDNA (DNA ribosome) là một vùng gen quan trọng mã hóa cho rRNA của ribosome, có vai trò thiết yếu trong nghiên cứu phân loại và tiến hóa của các loài nấm rDNA không mã hóa protein nhưng là công cụ chính xác để xác định sự tương đồng và khác biệt giữa các sinh vật, từ đó hỗ trợ trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền Việc phân loại nấm dựa vào hình thái và đặc điểm sinh hóa có thể dẫn đến kết quả không chính xác nếu không sử dụng rDNA, do đó, nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về sự tiến hóa và đa dạng của các dòng nấm.

Ribosome là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào của sinh vật nhân thực và sinh vật nhân sơ, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein của tế bào RNA ribosome là một trong hai thành phần chính cấu tạo nên ribosome.

Ribosome chứa 18S RNA, 28S, 5.85S và 5S RNA ribosome được phiên mã từ DNA ribosome, bao gồm nhiều đoạn và lặp lại Các đoạn này bao gồm vùng ITS (internal transcribed spacer), 18S, 5.8S, 25-28S, 5S RNA và vùng IGS (intergenic spacer) Vùng IGS đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc ribosome.

SVTH: Tr ng Th B ch Vân 12 g m ph n ETS (external transcribed spacer) và ph n không phiên mã NTS (non- transcribed spacer)

rDNA 18S là phần quan trọng trong nghiên cứu, trong khi rDNA 5,8S có kích thước nhỏ và ít biến đổi rRNA 5S là thành phần thiết yếu của nu- LSU-rRNA, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc ribosome và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein Mặc dù rDNA 25S có ít biến đổi, nhưng nó vẫn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại.

Gen nrSSU đóng vai trò quan trọng trong việc mưu hóa vùng 18S rRNA, nơi hình thành tiểu phân nhắc đến nrSSU Vùng trình tự này có tính bảo tồn cao, nhưng cũng chứa các vùng biến động cho phép so sánh trình tự giữa các loài khác nhau Thông qua việc thu nhận trình tự để phân tích, vùng nrSSU có thể được trình bày bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer), được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide bảo tồn.

Vi t Nam, các nghiên c u v thành ph n loài v n ch a đ c quan tâm Do v y, cho đ n nay ch a có m t công b đ y đ nào v các loài n m ký sinh côn trùng

Thông tin về thành phần loài là rất quan trọng trong việc khai thác các lợi nhuận từ nấm trong nghiên cứu Nó giúp xây dựng quy trình nuôi trồng nấm hiệu quả và sản xuất dược liệu, góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho nhiều địa phương.

Tại Việt Nam, nghiên cứu về thành phần loài nấm trùng hợp đã được công bố vào những năm 1996 và 2001, với ba loại nấm thuộc chi Cordyceps: Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps sabrolifera Ngoài ra, hai loài mới được phát hiện tại khu vực miền núi Việt Nam là Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii.

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu mẫu ông trùng hạ thổ tại các Vườn quốc gia và Khu bảo tồn, ghi nhận 24 loài nấm ông trùng hạ thổ độc Các loài nấm này thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocriales, lớp Sordariomycetes, và hiện đang được lưu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Dựa trên nguồn gen thu thập được từ Trung Quốc và Nhật Bản, Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng đã nghiên cứu nuôi trồng quần thể nấm này.

SVTH: Trồng Thảo Bích Vân 14 đông trùng hạ thảo trên giá thể nhân tạo Một số loài được quy trình công nghệ sản xuất chuyển giao cho các cơ sở sản xuất nấm nhân tạo: quy trình nuôi trồng nấm Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris), nấm trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) và nấm trùng hạ thảo bạch xít (Cordyceps nutans).

Năm 2009, lần đầu tiên tại Việt Nam, ái Duy Ban cùng các nhà khoa học uy tín đã tìm ra và nuôi thành công ông Trùng H Th o với công trình “Nghiên cứu phát hiện mới loài đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae Việt Nam và xác định một số hoạt chất sinh học trong đông trùng hạ thảo”.

Ph h phân t là nghiên c u v m i quan h ti n hóa c a t p h p các trình t gen, d

Xây dựng cây phả hệ phân tử là một quá trình phức tạp và không thể thực hiện một cách đơn giản Tập hợp dữ liệu phát sinh loài có thể bao gồm nhiều hình thức khác nhau, trong đó có thể thay đổi tùy thuộc vào các yếu tố tiến hóa Do đó, có rất nhiều mô hình tiến hóa khác nhau và các phương pháp phân tích phát sinh chủng loài để tìm kiếm cây tiến hóa phù hợp cho một phân tích phát sinh loài.

Nh ng b

B c đ u tiên là c n xác đ nh protein hay trình t DNA s là d li u đ c ch trình t quan tâm có th l y t trang NCBI hay các công c tìm ki m t ng đ ng khác, đ t o ra m t c s d li u cuc b [15]

1.4.2.2 c và hi u ch nh trình t

Các phân tích phát sinh chủng loài dựa trên những số liệu khác biệt khi quan sát các trình tự DNA so sánh thường không chính xác Điều này xảy ra khi trình tự DNA có độ biến đổi cao và nhà phân tích chọn mô hình phân tích phức tạp, dẫn đến kết quả sai lệch đáng kể Để tránh tình trạng sai sót do chủ quan, cần phải thực hiện quy trình phân tích hai lần và đảm bảo tính khách quan hơn.

Vi c s p c c hi n b ng máy tính m t cách t đ i nh ng gen hay vùng

DNA kém b ổn định có thể gây ra lỗi trong quá trình sao chép thông tin di truyền Do đó, các gene hoặc vùng DNA có độ biến thiên cao cần được theo dõi chặt chẽ trong quá trình sao chép Đối với những vùng không có khả năng sao chép thông tin di truyền, cần phải phân tích kỹ lưỡng để hiểu rõ hơn về chức năng của chúng.

1.4.2.4 Ch n l a mô hình ti n hóa i d li u ph i tr i qua quá trình ki m tra dò tìm mô hình ti n hóa thích h p

Trong mô hình tiểu hóa đơn giản nhất, tất cả các biến đổi cứng đầu của gia đình đều bằng nhau cho mọi điểm biến đổi Khi đó, số lượng các dạng biến đổi trong mô hình tiểu hóa này được thiết lập là 1.

Mô hình tiểu hóa phục tùng hiện nay là mô hình có khả năng hồi biến tổng quát theo thời gian (General time reversible model), với 6 kiểu biến đổi khác nhau, mỗi kiểu đều có những đặc điểm riêng biệt.

M t vài mô hình ti n hóa ng u nhiên ph bi n g m Jukes-Cantor, Kimura 2- parameter (K2P), Tamura 3-parameter, Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), Tamura Nei, General Time Reversible (GTR)…

M t s ch ng trình ph n m m, nh PAUP *, s t đ ng s d ng m t mô hình m c đ

Với phương pháp nhắm suy luận cây phát sinh, hiện nay đã xác định rõ các phương pháp kết hợp thích hợp và một nhóm tiêu chuẩn tiêu chí Tiến trình thực hiện của nó bao gồm việc dò tìm những cây tiến hóa tiềm năng, sau đó đánh giá các cây tiến hóa này dựa trên tiêu chuẩn tiêu chí đã đặt ra để tạo ra một cây tiến hóa tối ưu.

Trong th c nghi m ng n hai ph ng pháp dò tìm cơy ti n hóa đó lƠ ph ng pháp branch-and-bound vƠ ph ng pháp heuristics.

Trong phương pháp branch-and-bound, một cây đệ quy được coi là điểm chuẩn, sau đó cây này được đánh giá theo các tiêu chuẩn đã định trước Cây này sẽ được ghi trong bảng với điểm của cây được xem là “điểm chuẩn” Điểm của các cây khác được so sánh; nếu điểm của cây mới vượt qua, nếu cao hơn điểm chuẩn thì sẽ trở thành cây tối ưu mới Tiến trình có thể tiếp tục cho đến hết Thuật toán này cho phép dò tìm cây tối ưu một cách hiệu quả, tiết kiệm nhiều thời gian.

Phương pháp heuristics, mặc dù không mang lại kết quả chính xác cao như các phương pháp khác, vẫn thường được áp dụng trong nhiều lĩnh vực Một trong những ứng dụng nổi bật của phương pháp này là trong việc phát triển các thuật toán phức tạp, chẳng hạn như phương pháp phơn rủ hình ngôi sao.

Ph ng pháp nƠy có nguyên lý lƠ đ u tiên m t hình cây d chnh đ c t o thành, k đ n m t taxa liên h g n nh t đ c đ a vƠo sao cho nó ph i

SVTH: Tr ng Th B ch Vân 17 tìm đ c v trí t t nh t Ti n trình th c hi n nhi u l n cho đ n khi cây ti n hóa hình thành

Tiêu chuẩn tối ưu trong việc xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào thông tin chưa hoàn chỉnh của dữ liệu có hai bước chính: bước đầu tiên là xác định mục tiêu cần tính toán, và bước hai là tìm một cây thay thế cho một tiêu chuẩn cây Phương pháp maximum parsimony tìm kiếm cây sao cho số lượng thay đổi tối ưu là thấp nhất, nhằm thích nghi với những số liệu khác nhau được quan sát trên cây có tổng chiều dài nhỏ nhất Cách tiếp cận này dựa vào khoảng cách tiến hóa giữa các cặp đối tượng đang được so sánh Phương pháp khoảng cách giúp tìm ra một cây thích hợp dựa vào ma trận khoảng cách gen của các trình tự Khi tất cả các khoảng cách giữa các trình tự được tính toán, hình ảnh của một cây được xây dựng thông qua các phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp khoáng vững mô hình đã được áp dụng.

SVTH: Tr ng Th B ch Vân 18 minh đ c kho ng cách đúng gi a các gen b i vì m t s v trí nucleotide có th đƣ x y ra quá trình đ t bi

Phương pháp "hàng xóm" (Neighbor Joining) là một kỹ thuật trong xây dựng cây phylogenetic, giúp xác định các cấp hàng xóm hợp lý nhất để giảm thiểu chiều dài tổng thể của cây Nguyên tắc cốt lõi của phương pháp này là tìm ra các nhánh gần gũi nhất, từ đó tạo ra một cấu trúc cây tối ưu và chính xác hơn trong việc phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.

Phương pháp thống kê là một nhóm phương pháp toán học được áp dụng để phân tích dữ liệu đã quan sát Hàm này cho phép tích hợp các quá trình thống kê thành mô hình xác suất, giúp hiểu rõ hơn về các hiện tượng trong nghiên cứu.

Ph ng pháp h p lý c c đ i ch n l a cây ti n hóa t i đa mƠ khi quan sát các d li u d i m t mô hình nƠo đó có xác xu t t

Chỉ số bootstrap là một phương pháp thống kê dùng để đánh giá độ tin cậy của các nhóm (cluster) trên cây phát sinh loài Theo Felsenstein (1985), bootstrap là công cụ hữu ích trong việc xây dựng cây phát sinh loài, giúp xác định mức độ tin cậy của các nhánh liên kết giữa các taxa trên cây phát sinh Chỉ số này được biểu thị dưới dạng phần trăm (%) và phản ánh độ chính xác trong việc phân loại các taxa.

PCR, hay phản ứng chuỗi polymerase, được phát triển bởi Kary Mullis vào năm 1980, là một phương pháp sinh hóa quan trọng trong việc sao chép DNA Phản ứng này phụ thuộc vào nhiệt độ và bao gồm các thành phần chính như DNA khuôn, dNTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm PCR được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, thường được gọi là máy PCR, với nhiều chu kỳ khác nhau Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước: biến tính (DNA được biến tính ở nhiệt độ cao 94-95 độ C), bắt cặp mồi (nhiệt độ cần thiết cho sự bắt cặp giữa mồi và DNA khuôn là Ta, với Ta < Tm không quá 5 độ C, trong đó Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi), và kéo dài (nhiệt độ tăng lên 72 độ C để enzyme polymerase hoạt động).

SVTH: Tr ng Th B ch Vân 20 n chu k t o đ c m t l ng l n b n sao t DNA g c, dùng đ t o dòng, gi i trình t , l p b n đ di truy n hay s n xu t m u dò

PCR suy bi n là một kỹ thuật PCR đặc biệt, được áp dụng để phân tích các đoạn trình tự DNA chưa xác định, dựa trên mối liên hệ với các trình tự DNA đã biết Kỹ thuật này cho phép xác định các nucleotide (nu) có thể kết hợp với hai hoặc nhiều hơn, mở rộng khả năng nghiên cứu trong các ứng dụng PCR thông thường.

Nguyên lý hoàn toàn mới trong thiết kế dựa trên nguyên tắc sử dụng dNTP do Sanger phát minh đã mang lại những bước tiến đáng kể Mỗi loại dNTP được đánh dấu bằng huỳnh quang riêng biệt, cho phép phân biệt các màu sắc khác nhau trong quá trình phân tích Điều này giúp cải thiện độ chính xác và hiệu quả trong nghiên cứu gen và xét nghiệm di truyền.

PCR là một kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử Sau khi thực hiện PCR, các trình tự DNA có độ dài khác nhau sẽ di chuyển qua vị trí phát tín hiệu vào những thời điểm khác nhau Khi đó, máy sẽ tự động báo lại kết quả phân tích.

2 PH N 2 ậ V T LI U VÀ PH NG

V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

D ậ ậ

V/VIS, Smart Spec, BioRad) -Cycler Thermal, BioRad)

100àg/ml Proteinase K 1mg/ml

Annhyb: phiên b n 4.946 (Olivier Friard, 2012) là ph n m m mi n phí giúp làm vi c và qu n lý các trình t nucleotide d i nhi u đ nh d ng

Clustalw2: là m t ph n m m mi n phí (giao di n window) dùng cho vi c so sánh s t ng đ ng c a hai hay nhi u trình t sinh h c

Chromas Lite phiên bản 2.1.1 (Technelysium) là phần mềm miễn phí đa năng, cho phép chỉnh sửa và lưu trữ các tập tin trình tự thuộc nhiều định dạng khác nhau như Fasta, text, EMBL, và SwissProt Phần mềm này đặc biệt hỗ trợ các trình tự được giải bằng hệ thống ABI, giúp biểu diễn hình ảnh quang học một cách hiệu quả.

Sea View: phiên b n 4.2.12 (Manolo Gouy) Sea View là ph n m m mi n phí có các tính n ng h tr cho các phân tích t ng đ ng, s p gióng c t các trình t

TreeView: phiên b n 1.6.6 (Roderic, 2001), ph n m m mi n phí dùng đ xem và hi u ch nh cây ti n hoá

Fig Tree: phiên b n 1.3.1 (Andrew Rambaut Group) Fig Tree là ph n m m mi n phí, dùng đ h tr đ h a nh m xu t b n cây ti n hoá rõ rƠng h n.

MEGA: phiên b n 6.06 (Kumar, 2013) Ph n m m mi n phí dùng đ xây d ng cơy phát sinh loƠi theo các ph ng pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining

SVTH: Tr ng Th B ch Vân 24 jModelTest: phiên b n 0.1.1(Posada, 2008), là ph n m m mi n phí dùng đ dò tìm mô hình ti n hoá t i u.

Ti n trình nghiên c u

- Thu th p trình t gen nrSSU

Ti n hành thu th p 62 trình t gen nrSSU tham kh o t bài báo c a Sung và c ng s (2007) lƠm c s d li u c c b Các trình t nƠy đ c li t kê chi ti t trong

- Thu nh n vƠ đánh giá m i p m i NS1/NS4 b i tính ph quát giúp khu ch đ i và gi i trình t u m u n c s d ng trong nhi u nghiên c u ph h phân t trong nh ng n m g n đơy

[47] Vùng gen nrSSU khu ch đ i s n ph m có chi u dài 1102 bp [37]

B ng 2.1 Trình t các m i s d ng trong ph n ng PCR

Tên m i Trình t (5’-3’) Chi u dƠi TƠi li u tham kh o

- C s d li u trình t nrSSU nhóm n m ký sinh côn trùng

Các trình t đ c s d ng đ phân tích cây phát sinh loài bao g m 62 trình t tham kh o trên GenBank v i mã s truy c p trình t l y t công trình nghiên c u c a

Sung et al (2007) đã chỉ ra rằng tất cả các trình tự làm tham chiếu đều có nguồn gốc rõ ràng, bao gồm bài báo công bố, mã truy cập trình tự trên GenBank và tên loài của mẫu được cung cấp Đặc biệt, tên "Ngân hàng giống" cũng được cung cấp, ví dụ như CBS: Centraal bureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Hà Lan.

The Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF) in the U.S., along with the American Type Culture Collection (ATCC), the Bioresources Collection and Research Center (CCRC) in Taiwan, and the Institute for Fermentation (IFO) in Osaka, Japan, play crucial roles in the preservation and distribution of microbial cultures Utilizing platforms like SeaView, these collections ensure the effective management of various fungal strains in optimal storage conditions.

Cơ sở dữ liệu vùng gen nrSSU là công cụ quan trọng trong việc tham chiếu và đánh giá các trình tự ban đầu, nhằm xây dựng và tái hiện cấu trúc đa hình học trên cây phát sinh loài Việc phát triển cơ sở dữ liệu này giúp cải thiện khả năng kiểm chứng và hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực sinh học phân tử.

T i u quy trình tách chi t DNA theo ph ng pháp Phenol:Chloroform không b sung ho c b sung -mercaptoethanol

+ Ly gi i t bào v i lysis buffer không b sung -mercaptoethanol

Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một phần mẫu nhỏ (khoảng 1,5g) hòa tan trong 700µl dung dịch lysis buffer, bao gồm 70µl Tris-HCl pH 1M, 14µl EDTA 0,5M, 140µl SDS 10%, 140µl NaCl 0,5M, 266µl nước cất và 70µl Proteinase K 1mg/ml Sau đó, lắc đều và ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 65 độ C.

Sử dụng que cấy vô trùng, tiến hành lấy một phần hạt giống (khoảng 1,5g) và hòa tan trong 700 µl dung dịch lysis buffer đã chuẩn bị sẵn, bao gồm 70 µl Tris-HCl pH 1M, 14 µl EDTA 0,5 M, 140 µl SDS 10%, 140 µl NaCl 0,5 M, 7 µl -mercaptoethanol 99,9%, 259 µl dd H2O và 70 µl Proteinase K 1mg/ml Sau đó, hỗn hợp được ủ qua đêm ở nhiệt độ 65 độ C để đảm bảo quá trình ly giải diễn ra hiệu quả.

+ Tách chi t DNA theo ph ng pháp Phenol:Chloroform [14]

Ti n hành ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

Lo i b ph n c n, thu d ch n i, b sung 700 àl dung d ch PCI (Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol v i t l 25:24:1), l c đ u ng và ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

Thu d ch n i, b sung 1V Chloroform, l c đ u Ly tâm 13000 vòng/phút

Thu d ch n i, ti n hành b sung 1/10V dung d ch NaOAc 3M, l c đ u B sung 1V isopropanol, l c đ u và nhi t đ 4 o C trong vòng 2 gi

Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút Lo i b d ch n i, thu t a

Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút 4 o C, lo i d ch n i

Lo i b ethanol và làm khô c n t i 50 o C

T i u quy trình PCR v i các m i NS1/NS4

Quy trình xử lý nhiệt bao gồm các giai đoạn như sau: đầu tiên, gia nhiệt đến 95°C trong 5 phút (1 chu kỳ); tiếp theo, duy trì nhiệt độ 95°C trong 30 giây; sau đó, làm nguội nhanh xuống 42,2°C trong 30 giây; tiếp tục kéo dài nhiệt độ 72°C trong 2 phút (35 chu kỳ); và cuối cùng, giữ ở 72°C trong 5 phút (1 chu kỳ).

Giai đo n Bi n tính Bi n tính M i b t c p Kéo dài Kéo dài cu i cùng

Th i gian 5 phút 30 giây 30 giây 2 phút 5 phút

Chú thích: X- nhi t đ m i b t c p đ khu ch đ i ng v nrSSU

Tổng số mẫu thu thập được trong nghiên cứu là 6 mẫu bao gồm: DL0006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, và DL0077 Các mẫu này được thu thập từ những chuyến đi thực địa tại vùng núi Langbiang, thuộc tỉnh Lâm Đồng, do Hội Sinh học TP Hồ Chí Minh thực hiện.

Hi u ch nh trình t

Trình t thu đ c sau khi gi i trình t s đ c hi u ch nh qua các b c:

Loại bỏ những tín hiệu không chính xác trong quá trình khảo sát là rất quan trọng Đối với các tín hiệu gần mũi, tín hiệu thường nằm ở biên độ không ổn định và các đánh tín hiệu không rõ ràng Với các tín hiệu gần cuối quá trình, chúng thường rất thập và không thể phân biệt rõ ràng các đánh Việc có cơ sở vùng này hoàn toàn không đảm bảo được độ tin cậy và cần được loại bỏ.

- Ki m tra các sai l ch gi a hai k t qu gi i trình t :

Đoạn DNA được khảo sát theo hai chiều, bao gồm mạch thẳng và mạch ngược, nhằm giảm thiểu sai sót trong quá trình đọc Điều này giúp nhận diện các tín hiệu không rõ ràng trong trình tự, từ đó quyết định kết quả giữa hai mạch Trước khi so sánh, một trong hai kết quả cần được chuyển đổi thành dạng đảo ngược và bổ sung Việc xác định sự tương đồng và tìm sai lệch giữa hai trình tự (mạch thẳng và mạch ngược) được thực hiện bằng công cụ Dot Plot và Alignment của Sea View Hai trình tự sau khi được sắp xếp phải hoàn toàn tương đồng, nhưng những sai lệch thu được có thể chỉ ra các lỗi trong quá trình đọc bằng máy và cần được kiểm tra tiếp trên biểu đồ phát huỳnh quang bằng phần mềm Chromas Lite.

So sánh tín hiệu huỳnh quang tại vị trí sai lệch giữa hai ký tự có thể xác định được đúng loại base nếu tương ứng với vị trí đó Trong một trường hợp hợp, các tín hiệu vân không thể phân biệt, nhưng vị trí này sẽ được ghi nhận và xác nhận lại theo quy tắc ký hiệu chung theo chuẩn IUPAC (IUPAC ambiguous nucleotide code).

Việc đăng ký kết quả mà sự khác biệt khi so sánh cặp gen quá lớn (trên 50%) do tín hiệu huỳnh quang rất nhiều vị trí không thể phân biệt được, thường là do mẫu bị nhiễm các DNA khác, dẫn đến nhiều trình tự được xác định cùng trên một thí nghiệm Khi đó, các trình tự không thể sử dụng để phân tích, khiến việc hiểu chính xác các trình tự này không còn ý nghĩa và độ tin cậy.

K T QU ÁNH GIÁ M I

ánh giá m i trên IDT

M i Trình t (5’-3’) L %GC Tm Hairpin dimer

+ Chi u dài hai m i n m trong kho ng 17 ậ28 base đ m b o tính duy nh t chi u dài c a m i

+ Thành ph n %(G+C) c a hai m i t ng đ i n đ nh, không quá chênh l ch nhau

+Tm c a hai m i < 5 o C, đ m b o cho quá trình khu ch đ i trình t DNA khuôn

+ G (n ng l ng t do hình thành c u trúc th c p) đ m b o G> -9kcal/mol + Ch có m t v trí b t c p duy nh t c a m i trên trình t DNA khuôn

K t qu phân tích trên IDT cho th y các đ c tính c a h m i là phù h p v i ph n ng PCR

K t qu ki m tra Annhyb c p m i NS1/NS4 trên trình t gen nrSSU31 3.1.3 ánh giá m i b ng BLAST trên NCBI

Hình 3.2 K t qu Annhyb c p m i NS1/NS4 v i trình t gen nrSSU

Kết quả nghiên cứu cho thấy vị trí bộc lộ của mRNA NS1 và mRNA NS4 trong vùng gen nrSSU của Cordyceps militaris thu được sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1130 bp, tương đương với kích thước mà nhóm nghiên cứu tham khảo trong bài báo của Sung (khoảng 1102 bp) Điều này cho thấy cặp mRNA NS1 và NS4 phù hợp với các phân tích thực nghiệm sau này.

3.1.3 ánh giá m i b ng BLAST trên NCBI

Hình 3.2 K t qu BLAST c p m i NS1/NS4 khu ch đ i vùng gen nrSSU

- Theo k t qu BLAST thì c p m i này khu ch đ i đ c vùng trình t 18S rRNA c a các loài n m khác nhau có trên c s d li u Do đó, c p m i này có tính ph quát

Dựa trên bảng xếp hạng, sự xuất hiện của một sản phẩm hoặc dịch vụ có thể ảnh hưởng đến điểm số trong quá trình đạt được mục tiêu Nếu một sản phẩm liên tục xuất hiện ở vị trí cao, tỷ lệ kỳ vọng (E) sẽ tăng lên, cho thấy hiệu quả của sản phẩm đó càng cao Tỷ lệ kỳ vọng (Expect: xác suất của các trình tự xảy ra) đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá sự thành công.

K t lu n: T các k t qu kh o sát m i thu đ c, chúng tôi nh n đnh c p m i NS1/NS4 có đ đ c hi u cao khi khu ch đ i các vùng trình t 18S rDNA các loài n m ký sinh

3.2 C S D LI U C C B TRỊNH T nrSSU NHịM N M KÝ SINH CÔN TRÙNG

B ng 3.2 Thông tin 62 trình t tham chi u dùng đ xây d ng d li u vùng trình t nrSSU [37]

STT TÊN KHOA H C NGÂN HÀNG

6 Cordyceps cf acicularis OSC 128580 DQ522543

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đa hình học của 62 mẫu Viridispora diparietispora ATCC MYA 627 AY489735, một loài ký sinh côn trùng, thông qua việc xây dựng cây phát sinh loài từ dữ liệu gen nrSSU Sử dụng ba phương pháp phân tích là Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML) với phần mềm Mega 6.06, chúng tôi đã thực hiện kiểm tra độ tin cậy với 1000 lần bootstrap Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa ba cây phát sinh được xây dựng từ các phương pháp này.

The article lists various fungal species, including Cordyceps militaris OSC 93623, Cordyceps scarabaeicola Arsef 5689, and Lecanicillium psalliotae CBS 101270, among others Notable entries include Cordyceps tuberculata OSC 111002, Cordyceps cardinalis CBS 113411, and Isaria tenuipes OSC 111007 The collection also features unique fungi such as Mariannaea pruinosa ARSEF 5413, Cordyceps gunnii OSC 76404, and Rotiferophthora angustispora CBS 101437 Other species mentioned are Pochonia chlamydosporia CBS 504.66, Metarhizium album ARSEF 2082, and Epichloe typhina ATCC 56429 Additional entries include Balansia pilulaeformis AEG 94-2, Cordyceps ophioglossoides OSC 106405, and Haptocillium balanoides CBS 250.82 The list concludes with Cordyceps variabilis ARSEF 5365, Hypocrella sp GJS 89-104, and Hypocrella schizostachyi BCC 14123, showcasing a diverse range of fungal biodiversity.

Shimizuomyces paradoxus EF CC 6279 Shimizuomyces paradoxus EF CC 6564 Shimizuomyces clade Aschersonia badia BCC 8105

Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Cordyceps taii ARSEF 5714

Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 C taii clade Simplicillium lanosoniveum IMI 317442

Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simplicillium lamellicola CBS 116.25

Haptocillium zeosporum CBS 335.80 Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 Hydropisphaera peziza GJS92-101

Ophionectria trichospora CBS 109876 Leuconectria clusiae ATCC 22228 Pseudonectria rousseliana AR 2716 Viridispora diparietispora

Cosmospora coccinea AR2741 Verticillium incurvum CBS 460.88 Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 Hypocrea lutea ATCC 208838

Verticillium dahliae ATCC 16535 Glomerella cingulata F AU 553 Glomerella cingulata F AU 513

Hình 3.3 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Neighbor Joining v i b d li u 62 trình t (Các con s hi n th trên cây là giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i)

Engyodontium aranearum CBS 309.85, Lecanicillium antillanum CBS 350.85, and Lecanicillium psalliotae (CBS 532.81 and CBS 101270) are notable fungal species Additionally, Cordyceps militaris OSC 93623 and Cordyceps scarabaeicola Arsef 5689 contribute to the diversity of the Cordyceps genus Other significant species include Isaria tenuipes OSC 111007, Mariannaea pruinosa ARSEF 5413, and Cordyceps cardinalis (CBS 113411 and CBS 113412) Lastly, Cordyceps tuberculata OSC 111002 and Torrubiella confragosa IMI 304807 further enrich the catalog of these fascinating fungi.

The article lists various fungal species, including Cordyceps gunnii OSC 76404, Cordyceps japonica OSC 110991, and Cordyceps capitata OSC 71233, highlighting their significance in mycology Additionally, it mentions Rotiferophthora angustispora CBS 101437 and Metarhizium album ARSEF 2082, which are known for their ecological roles Other notable species include Pochonia chlamydosporia CBS 504.66 and Balansia pilulaeformis AEG 94-2, which contribute to soil health and pest control The article also references Epichloe typhina ATCC 56429 and Verticillium epiphytum CBS 384.81, emphasizing their importance in agricultural practices Lastly, it includes lesser-known species such as Haptocillium zeosporum CBS 335.80 and Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279, showcasing the diversity within the fungal kingdom.

Cordyceps fracta OSC 110990 Aschersonia placenta BCC 7869 Hypocrella sp GJS 89-104 Hypocrella clade Cordyceps cf acicularis OSC 128580

Cordyceps agriotidis ARSEF 5692 Cordyceps taii ARSEF 5714 Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 C taii clade Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915

Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Haptocillium balanoides CBS 250.82 Haptocillium sinense CBS 567.95 Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 Simplicillium lanosoniveum IMI 317442

Nectria cinnabarina GJS 89-107 Hydropisphaera peziza GJS92-101 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 Roumegueriella rufula CBS 346.85

Ophionectria trichospora CBS 109876 Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 Hypocrea lutea ATCC 208838

Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 Verticillium incurvum CBS 460.88

Cosmospora coccinea AR2741 Pseudonectria rousseliana AR 2716 Leuconectria clusiae ATCC 22228 Viridispora diparietispora

Verticillium dahliae ATCC 16535 Glomerella cingulata FAU 553 Glomerella cingulata FAU 513

Hình 3.4 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Maximum Parsimony v i b d li u 62 trình t (Các con s hi n th trên cây là giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i)

The article lists various fungal species, including Cordyceps cardinalis CBS 113411 and CBS 113412, Cordyceps tuberculata OSC 111002, and Isaria tenuipes OSC 111007 It also mentions Cordyceps militaris OSC 93623, Mariannaea pruinosa ARSEF 5413, and Torrubiella confragosa IMI 304807 Additionally, the fungi Lecanicillium psalliotae is represented by CBS 101270 and CBS 532.81, alongside Cordyceps scarabaeicola ARSEF 5689, Engyodontium aranearum CBS 309.85, and Lecanicillium antillanum CBS 350.85.

The article lists various fungal species, including Cordyceps gunnii OSC 76404, Cordyceps japonica OSC 110991, and Cordyceps chlamydosporia CBS 101244 It also mentions Pochonia chlamydosporia CBS 504.66 and Rotiferophthora angustispora CBS 101437 Additional species include Metarhizium album ARSEF 2082, Epichloe typhina ATCC 56429, and Balansia pilulaeformis AEG 94-2 The list continues with Verticillium epiphytum CBS 384.81, Pochonia gonioides CBS 891.72, and Balansia henningsiana AEG 96-27a, along with Cordyceps capitata OSC 71233, Cordyceps ophioglossoides OSC 106405, and Cordyceps taii ARSEF 5714.

Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 C taii Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915

Aschersonia badia BCC 8105 Shimizuomyces paradoxus EF CC 6279 Shimizuomyces paradoxus EF CC 6564 Shimizuomyces clade Cordyceps fracta OSC 110990

The article discusses various fungal species, including Haptocillium zeosporum (CBS 335.80), Hypocrella schizostachyi (BCC 14123), and Aschersonia placenta (BCC 7869) It also highlights additional strains such as Hypocrella sp (GJS 89-104), Cordyceps cf acicularis (OSC 128580), and Cordyceps agriotidis (ARSEF 5692) Other notable species mentioned are Cordyceps variabilis (ARSEF 5365), Haptocillium balanoides (CBS 250.82), and Haptocillium sinense (CBS 567.95) The article further includes Metarhizium flavoviride (ARSEF 2037) and two strains of Simplicillium lanosoniveum (IMI 317442 and CBS 704.86), along with Simplicillium lamellicola (CBS 116.25).

Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Hydropisphaera peziza GJS92-101

Nectria cinnabarina GJS 89-107 Ophionectria trichospora CBS 109876 Cosmospora coccinea AR2741 Leuconectria clusiae ATCC 22228 Viridispora diparietispora Pseudonectria rousseliana AR 2716

Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 Hypocrea lutea ATCC 208838

Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 Verticillium incurvum CBS 460.88

Verticillium dahliae ATCC 16535 Glomerella cingulata F AU 553 Glomerella cingulata F AU 513

Hình 3.5 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Maximum Likelihood v i b d li u 62 trình t (Các con s hi n th trên cây là giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i)

Kết quả đa hình học của các cây phát sinh loài mà chúng tôi thu thập được phù hợp với cây mà Sung và cộng sự (2007) đã thực hiện Điều này là hợp lý vì các trình tự chúng tôi sử dụng làm tham chiếu trong phương pháp nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007) Hơn nữa, kết quả đa hình học của ba cây phát sinh xây dựng bằng ba phương pháp Neighbor Joining (NJ), Maximum Likelihood (ML), và Maximum Parsimony (MP) đều tương đồng nhau Các giá trị bootstrap trên tất cả các cây phát sinh đều có ý nghĩa (lớn hơn 50).

Phân tích m t cách chi ti t: s phân nhóm c a t t c các trình t n m trên các cây ph h đ u r t đ ng nh t c ba cây ph h

Nhóm Clavicipitaceae Clade A (Clavicipitacease s.s) bao g m m t s phân nhóm: Hypocrella clade, Shimizuomyces clade, Claviceps clade, C taii clade

D a trên k t qu cây ph h phân t đ c xây d ng b i Sung et al., 2007, nhóm

C taii clade (hay còn g i là Metacordyceps) bao g m m t s nhóm chính (C subg Cordyceps, C subg Neocordyceps, C subg Ophiocordyceps), trong đó, phơn nhóm

C subg Neocordyceps g m C taii t ng ng v i k t qu chúng tôi xây d ng, trong đó C taii trùng v i Metacordyceps taii (Liang, at el., 1991) Phân nhóm C subg Ophiocordyceps g m Cordyceps chlamydosporia (Pochonia) chính là Metacordyceps chlamydospria (Evans, et al., 2001) Ngoài ra phân nhóm C taii này còn có m t s các loƠi khác nh Pochonia gonioides, Metarhizium anisopliae, Cordyceps taii, Rotiferophthora agustispora, Pochonia chlamydosporia… K t qu này phù h p v i k t qu c a Sung et al., 2007

The Claviceps clade includes species such as Balanisa henningsiana, Balansia pilulaeformis, Epichloe typhina, and Verticillium epiphytum Additionally, the Shimizuomyces clade comprises Shimizuomyces paradoxus, while the Hypocrella clade consists of Hypocrella sp., Aschersonia planceta, and Aschersonia badia.

Trong nghiên cứu về phân nhóm C taii clade, các giá trị bootstrap cho các phơn nhóm đầu cho thấy sự phân chia rõ ràng giữa các taxa Cụ thể, hai taxa (Cordyceps chlamydosporia, Pochonia chlamydosporia) có giá trị bootstrap lần lượt là 74% (NJ), 79% (MP) và 72% (ML) Trong khi đó, cặp taxa (Cordyceps taii, Metarhizium anisopliae) đạt giá trị bootstrap cao hơn với 97% (NJ), 100% (MP) và 99% (ML), khẳng định sự phù hợp với phân nhóm C taii clade theo nghiên cứu của Sung et al.

Nhóm Clavicipitaceae Clade B (Ophiocordycipitaceae ) bao g m 5 phân nhóm chính: C unilateralis clade, C ophioglossoides clade, C gunnii clade, P lilacinus clade, C sphecocephala clade

Chúng tôi đã xây dựng clade B bao gồm clade C gunnii và clade C ophioglossoides, với phân nhóm C gunnii clade có sự tương đồng rõ rệt với kết quả của Sung (2007) Các loài đại diện bao gồm Haptocillium sinense, Haptocillium balanoides, Haptocillium zeosporum và Cordyceps gunnii Đặc biệt, hai taxa Haptocillium balanoides và Haptocillium sinense có giá trị bootstrap cao lần lượt là 96% (NJ), 94% (MP) và 97% (ML).

Nhóm Clavicipitaceae Clade C (Cordycipitaceae) có đ a hình hình h c khá t ng đ ng gi a các cây và cây c a Sung và c ng s đƣ d ng

Nhóm này g m 2 phân nhóm chính là Simplicillium clade và Cordyceps clade

Phân nhóm Cordyceps được chia thành ba nhóm chính: C subg Ophiocordyceps, C subg Cordyceps và C subg Bolacordyceps Hai phân nhóm C subg Cordyceps và C subg Bolacordyceps thuộc nhóm Cordyceps s s Trong đó, C subg Cordyceps bao gồm các loài như Isaria tenuipes, Cordyceps militaris và Cordyceps scarabaeicola Phân nhóm C subg Bolacordyceps chứa loài Mariannaea pruinosa, trong khi phân nhóm C subg Ophiocordyceps có loài Cordyceps cardinalis, còn được gọi là Mariannaea hoặc Clonostachys.

K T QU XÂY D NG CÂY PHÁT SINH LOÀI

V lý thuy t

Chúng tôi đã xây dựng cơ sở lý luận cho việc xác định danh sách các loài nấm ký sinh côn trùng thông qua các bước khởi đầu đánh giá các hệ thống in silico Việc thu thập và xây dựng cơ sở dữ liệu các vùng gen mục tiêu nrSSU được thực hiện để phát triển quy trình thực nghiệm nhằm thu thập các vùng gen này, giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự để đạt được độ chính xác cao Thành công trong việc xây dựng cây phân loại dựa trên 62 trình tự tham khảo từ Sung và cộng sự đã được thực hiện Các cây phân loại được xây dựng để xác định các mẫu nấm ký sinh côn trùng bằng ba phương pháp: Neighbor Joining, Maximum Parsimony và Maximum Likelihood.

V th c nghi m

Xây d ng đ c ph ng pháp tách chi t có b sung -mercaptoethanol và h tr đnh danh loài n m ký sinh côn trùng v i th t nh sau:

Chúng tôi đƣ xơy d ng thành công quy trình th c nghi m tách chi t DNA t h s i n m b ng ph ng pháp phenol-chloroform có b sung -mercaptoethanol

Xây d ng thành công quy trình PCR đ khu ch đ i vùng gen m c tiêu nrSSU

Giới thiệu về 6 trình tự của 6 mẫu nấm ký sinh côn trùng, bao gồm DL0006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075 và DL0077, với việc phân tích NS1/NS4 khu vực gen nrSSU, đã cho ra các trình tự chính xác.

Xây d ng thành công các cây ph h phân t nh m đnh danh 6 m u n m.

NGH

Chúng tôi d ki n t ng thêm c m u đ kh o sát trong gi i h n b s u t p m u n m t i phòng thí nghi m

M r ng kh o sát thêm các vùng gen m c tiêu khác thu c nhóm House-keeping genes nh m h tr đnh danh các m u n m thu c chi n m ký sinh côn trùng.

[1] Lê T n H ng, Võ Th H nh, Lê Th Bích Ph ng, Tr n Th nh Phong, Tr ng

Th H ng Vơn, Somsak Sivichai (2010), “N m côn trùng t i v n qu c gia Cát Tiên:

Ngu n tài nguyên quý cho các ng d ng sinh h c”, H i ngh Khoa h c k ni m 35 n m Vi n Khoa h c và Công ngh Vi t Nam-Hà N i, tr 1-10

[2] Nguy n D ng Khuê (2005), “S d ng n m Metarhizium anisopliae Sorok Phòng tr m i nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo ph ng pháp lơy nhi m”,

H i ngh côn trùng h c toàn qu c l n th 5, Hà N i, tr 409-414

[3] Nguy n Th L c, Võ Th Bích Chi, Nguy n Th Nhàn, Ph m Quang H ng, Hu nh

V n Nghi p, V Ti n Khang và Nguy n c ThƠnh (2002), “Nghiên c u, s n xu t và ng d ng hai ch ph m sinh h c đ qu n lý các loài sâu h i lúa”, Vi n lúa BSCL, tr 274-295

Phó giáo sư Quang Thủ (2013) đã trình bày nghiên cứu về ông trùng hạ thổ và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản tại hội thảo quốc tế về khoa học công nghệ phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tổ chức tại Lâm Đồng.

Phạm Thị Thùy (2010) trong bài báo cáo tại Hội thảo Quốc gia về bảo vệ thực vật Việt Nam đã nghiên cứu phát triển các nguồn nấm Beauveria và Metarhizum nhằm phòng trừ sâu hại cây trồng và cây rừng, đồng thời phát triển nấm Cordyceps như một thực phẩm chức năng cho con người Báo cáo được xuất bản bởi Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 224-231.

[6] Tr n V n Hai, Trnh Th Xuân, Ph m Kim S n (2006), “T o sinh kh i và th nghi m hi u l c c a m t s lo i n m ký sinh trên sơu n t p và r y m m h i rau c i t i

TP C n Th ”, T p chí nghiên c u khoa h c, tr ng HCT

[7] Tr nh Tam Ki t (2001), “Danh l c các loài th c v t Vi t Nam (ph n N m)”, NhƠ xu t b n Nông nghi p, Hà N i

Võ Thị Thu Oanh, Lê Minh Hôn, và Bùi Cách Tuyền (2007) đã nghiên cứu về tác động sinh học và khả năng gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đối với sâu khoang (Spodoptera litura F.) trên rau cải xanh (Brassica juncea L.) Nghiên cứu này được công bố trong Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2, Đại học Nông Lâm TP HCM, trang 58-63.

[9] Ban M., Hettich D., Goutet M (1998), “Serum-borne factor(s) of 1,1- dichloroethylene and 1,2- dichlorobenzene-treated mice inhibited in vitro antibody forming cell response and natural killer cell activity”, Toxicol Lett, 94(2), pp 93-101

[10] Bok J W., Lermer L., Chilton J., Klingeman H G., Tower G H N (1999),

"Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis” Phytochemistry, 51(7), pp 891-898

[11] Borneman J., and Hartin R J (2000), “PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples”, Appl Environ Microbiol, 66, pp 4356-4360

[12] Cabib E., Bowers B., Sburlati A., Silverman S J (1988), “Fungal cell wall synthesis: the construction of a biological structure”, Microbiological Sciences, 5(12), pp 370-375

In the study by Chiou et al (2000), the sorption behavior of various organic compounds from water to peat soil and its humic acid and humin fractions was examined The research highlights potential sources of nonlinearity in sorption processes, providing valuable insights for environmental science and technology The findings, published in Environmental Science & Technology, underscore the complexity of interactions between organic pollutants and soil components.

[14] Chomczynski P, Sacchi N (1987), Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal Biochem, 162(1), pp 156-9

[15] Dowell K (2008), “Molecular Phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationship”, Math 500, pp 1-16

[16] Felsenstein J (1985), “Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap”, Evolution, 39(4), pp 783-791

[17] Guarro J., Gené J., and Alberto M Stchigel (1999), “Developments in Fungal Taxonomy”, Clinical Microbiology Reviews, pp 454-500

[18] Hall B.G (2001), “Phylogenetic Trees Made Easy: A How-to Manual for Molecular Biologists”, Sunderland Massachusetts: Sinauer Associates

[19] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), “Toiypocladium injatum is the anamorph of Cordyceps subsessilis”, Mycologia, 88(5), pp 715-719

[20] Holliday J., Cleaver M (2008), “Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the Genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A Review”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 10(3), pp 219-234

A study by Itoh et al (1994) published in Archives of Biochemistry and Biophysics investigates the impact of iron ions on mitochondrial DNA damage in HTC rat hepatoma cell cultures The research highlights the significant role of antioxidants in protecting mitochondrial DNA from oxidative stress induced by iron ions, emphasizing the importance of these protective agents in cellular health.

[22] Jones E., Moodie I M (1990), “2-Thiophenethiol”, Org Synth 6: 979

[23] Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella”, Transactions of the Mycological Society of Japan, 23, pp 329-364

[24] Kuo Y C., Tsai W J., Shiao M S., Chen C F., Lin C Y (1996), “Cordyceps sinensis as an immunomodulatory agent”, Am J Chin Med, 24(2), pp 111-25

[25] Lemey P., Salemi M., Vandamme A M (2009), The Phylogenetic Handbook: A practical approach to phylogenetic analysis and hypothesis testing, Cambridge University press

[26] Li S P, Tsim K W (2004), “The biological and pharmacological properties of Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine that has broad clinical applications”, Herbal and Traditional Medicine (New York), pp 657-682

[27] Liu Y J., Whelen S., Hall B D (1999), “Phylogenetic Relationships Among Ascomycetes: Evidence from an RNA Polymerse II Subunit”, Molecular Biology and Evolution, 16(2), pp 1799-1808

A study by Manabe et al (1996) published in the Japanese Journal of Pharmacology investigated the impact of mycelial extract from cultured Cordyceps sinensis on hepatic energy metabolism in mice The findings demonstrated significant effects on the energy metabolism processes within the liver, highlighting the potential therapeutic benefits of Cordyceps sinensis in enhancing hepatic function.

[29] McCoy C W (1990), “Entomogenous fungi as microbial pesticides”, pp 139-

159 In R R Baker, and P E Dunn (eds.), New Directions in Biological Control Alan

[30].Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Kwon Y M., Shinozuka K., Kunitomo

M (1999), “Inhibitory effect of Cordyceps sinensis on spontaneous liver metastasis of Lewis lung carcinoma and B16 melanoma cells in syngeneic mice”, Japanese Journal of Pharmacology, 79(3), pp 335-341

[31] Ng T B, Wang H X (2005), “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 57, pp 1509-1519

[32] Schabereiter-Gurtner C., Piủar G., Lubitz W and Rửlleke S (2001), “Analysis of fungal communities on historical church window glass by denaturing gradient gel electro- phoresis and phylogenetic 18S rDNA sequence analysis”, J Microbiol Methods, 47, pp 345-354

[33] Shim J.S., Min E.G., Chang H.R., Lee C.Y., Kim S.S., Han Y.H (2000),

“Cytoctxicity against human cancer cell lines by Paecilomyces tenuipes DGUM 32001”, Korean J Microbiol, 36, pp 312-315

[34] Smit E., Leeﬂang P., Glandorf B., van Elsas, J.D., and Wernars, K (1999),

“Analysis of fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCR- ampliﬁed genes encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electro- phoresis”, Appl Environ Microbiol, 65, pp 2614-2621

[35] Spatafora J W., Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., White J F Jr

(2007), “Phylogenetic evidence for an animal pathogen origin for ergot and the grass endophytes”, Molecular Ecology, 16, pp 1701-1711

[36] Sun Y J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H X Chen C., Zhang C.K (2003), “Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690-694

[37] Sung G H., Hywel-Jones N L., Sung J M., Luangsa-ard J J., Shrestha B., Spatafora J W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”, Studies in Mycology, 57(1), pp 5-59

[38] Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., Spatafora J W (2007), “A multi- gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identiﬁcation of localized incongruence using a combinational bootstrap approach”, Molecular Phylogenetics and Evolution, in press

“5S ribosomal RNA data- base Y2K”, Nucl Acids Res, 28(1), pp 166-167

[40] Taborsky V (1992), Small-scale processing of microbial pestcides FAO Agric Service Bull 96 Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome

[41] Tang, Ming-chak., 逃慧咩, (2007), “Phylogenetic utility of ribosomal and protein-coding genes in Sordariomycetes systematics and evolutionary relationships within theXylariaceae”, The University of Hong Kong

[42] Taylor A L., Watson C J., Bradley J A (2005), “Immunosuppressive agents in solid organ transplantation: Mechanisms of action and therapeutic efficacy”, Critical review in oncology Hematology, 56(1), pp 23-46

[43] Waddington M (2009), “Identification of Fungi Using Ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Sequences”, Pharmaceutical Technology

[44] Wang S Y., Shiao M S (2000), “Pharmacological Functions of Chinese Medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species”, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4), pp 248-257

[45] Wasser S P (2002), “Medicinal mushrooms as a source of anti-tumor and immunomodulating polysaccharides”, Appl Microbiol Biotechnol, 60, pp 258-274

[46] Wenger R M (1984), “Synthesis of cyclosporine Total syntheses of

„cyclosporin A‟ and „cyclosporin H‟, two fungal metabolites isolated from the species Tolypocladium inflatum GAMS”, HCA, 67, pp 502-525

In the seminal work by White et al (1990), the authors presented methods for amplifying and directly sequencing fungal ribosomal RNA genes, which are crucial for phylogenetic studies This research is detailed in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications," edited by Innis et al., and published by Academic Press The techniques outlined in this chapter (pp 315-322) have significantly advanced our understanding of fungal taxonomy and evolutionary relationships.

[48] Yanada H (1984) “Structure and antitumor activity of alkali-soluble polysaccharides from Cordyceps ophioglossiodes”, Carbonhydr Res, 125, pp 107-

[49] Yoshikawa N., Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2‟ ậDeoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo, 21, pp 291-296

[50] Zhou J., Tang K (2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journnal of Pharmacy and Pharmacology, 61, pp 279-291.

Tiêu đề	Hỗ Trợ Định Danh Các Loài Nấm Thuộc Chi Nấm Ký Sinh Côn Trùng Dựa Trên Phân Tích Phả Hệ Phân Tử Vùng Gen nrSSU
Tác giả	Trịnh Thị Bích Vân
Người hướng dẫn	PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy, ThS. Lào Trúc Thu
Trường học	Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Vi Sinh
Thể loại	báo cáo khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2014
Thành phố	Thành Phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	4,34 MB