0535HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ VÙNG GEN nrSSU

B TR GIÁO D C VÀ ÀO T O NG IH CM TP.HCM  BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Tên đ tài: H TR NH DANH CÁC LOÀI N M THU C CHI N M KÝ SINH CÔN TRÙNG D A TRÊN PHÂN TÍCH PH H PHÂN T VÙNG GEN nrSSU KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao SVTH: Tr c Thu n ng Th B ch Vân MSSV: 1053010938 Khóa: 2010 - 2014 Tp H Chí Minh, tháng 05, n m 2014 L IC M N L i đ u tiên, xin g i l i cám n chơn thƠnh nh t đ n nh ng ng nh ng ng i b n đƣ bên, truy n cho ni m đam mê nghiên c u khoa h c cho tơi nh ng l i khun b ích đ tơi có th v ng b b i th y, c h n đ ng mà c Tôi xin g i l i tri ân sâu s c đ n cô PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n đƣ t n tình h ng d n, giúp đ , truy n đ t kinh nghi m ki n th c quý báu su t th i gian ph vi c t i phịng thí nghi m Sinh h c phân t đ hồn thành t t khóa lu n t t nghi p C m n b n ph vi c phịng thí nghi m Sinh h c phân t tr ng H M Tp.HCM đƣ nhi t tình giúp đ , đ ng viên tơi nh ng lúc khó kh n th i gian th c hi n khóa lu n t t nghi p Tôi c ng xin g i l i cám n đ n quý th y cô tham gia gi ng d y khóa 2010 khoa Cơng ngh sinh h c đƣ giúp em trau d i ki n th c, t o n n t ng v ng ch c đ em th c hi n đ tƠi c ng nh kinh nghi m làm vi c sau Và h t, xin g i l i c m n đ n cha m , nh ng ng thƠnh, d i đƣ có cơng sinh ng d c con, t o m i u ki n t t nh t, yêu th đ Bình D ng vƠ ng h ng đƣ ch n ng, ngƠy 22 tháng 05 n m 2014 Tr ng Th B ch Vân i DANH M C B NG B ng 2.1 Trình t m i s d ng ph n ng PCR B nrSSU B ng 3.1 vùng gen nrSSU B ng 3.2 Thơng tin 62 trình t tham chi u dùng đ xây d ng d li u vùng trình t nrSSU B ng 3.3 K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát m u n m ký sinh côn trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp Phenol:Chloroform B ng 3.4 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol B ng 3.5 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol B t l p chu k nhi t PCR khu ch đ i vùng gen nrSSU c a m u n m ký sinh côn trùng B ng 3.7 B ng hi u ch nh nucleotide t i v trí (i) đ n (xi) B ng 3.8 T ng h p k t qu hi u ch nh trình t m u n m ký sinh côn trùng B ng 3.9 K t qu chi u dài trình t tr c sau hi u ch nh B ng 3.10 K t qu so sánh trình t nrSSU đƣ hi u ch nh v i trình t GenBank B ii DANH M C HÌNH Hình 1.1 Cordyceps sinensis Hình 1.2 Hình 1.3 C u trúc c a rDNA nrSSU Hình 3.1 K t qu Annhyb c p m i NS1/NS4 v i trình t gen nrSSU Hình 3.2 K t qu BLAST c p m i NS1/NS4 khu ch đ i vùng gen nrSSU Hình 3.3 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Neighbor Joining v i b d li u 62 trình t (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) Hình 3.4 Cây ph h phân t Parsimony v i b d đ c xây d ng b ng ph li u 62 trình t ng pháp Maximum (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) Hình 3.5 Cây ph h phân t Likelihood v i b d đ c xây d ng b ng ph li u 62 trình t ng pháp Maximum (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) Hình 3.6 K t qu n di s n ph m c p m i NS1/NS4 tách chi t theo ph ng pháp Phenol:Chloroform Hình 3.7 K t qu n di s n ph m c p m i NS1/NS4 tách chi t theo ph ng pháp Phenol:Chloroform b sung -mercaptoethanol Hình 3.8 K t qu n di s n ph m c p m i NS1/NS4, có b sung -mercaptoethanol, t i u hóa nhi t đ Hình 3.9 Vùng tín hi u nhi u đ u hai m ch c a SSU iii Hình 3.10 Hi u ch nh vùng tín hi u b nhi u Hình 3.11 Hi u ch nh m t m ch c a SSU vùng gi a hai m ch SSU Hình 3.12 V trí sai l ch c a hai k t qu gi i trình t đ u m ch xi c a nrSSU Hình 3.13 Hình k t qu BLAST trình t nrSSU m ch xi đƣ hi u ch nh Hình 3.14 Ki m tra m c đ t ng đ ng b ng công c Dot Plot Hình 3.15 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Neighbor Joining v i b d li u 68 trình t (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) Hình 3.16 Cây ph h phân t Parsimony v i b d đ li u 68 trình t c xây d ng b ng ph ng pháp Maximum (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) Hình 3.17 Cây ph h phân t Likelihood v i b d đ li u 68 trình t c xây d ng b ng ph ng pháp Maximum (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) iv M CL C TV N ……………………………………………………………… PH N I - T NG QUAN TÀI LI U 1.1 1.1.1 1.1.2 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 Nhóm gen gi nhà (house-keeping gene) đ nh danh phân t m 10 1.3 13 1.4 14 1.4.1 1.4.2 14 Nh ng b 14 19 1.5 1.5.1 19 1.5.2 20 PH N - V T LI U VÀ PH 2.1 2.2 NG PHÁP NGHIÊN CÚU 21 V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 21 2.2.1 2.2.2 21 D ậ ậ 21 2.2.3 23 2.2.4 Ti n trình nghiên c u 24 2.2.5 Hi u ch nh trình t 27 2.2.6 28 2.2.7 28 2.2.8 28 v 29 2.2.9 PH N - K T QU VÀ TH O LU N 3.1 K T QU ÁNH GIÁ M I 30 3.1.1 ánh giá m i IDT 30 3.1.2 K t qu ki m tra Annhyb c p m i NS1/NS4 trình t gen nrSSU31 3.1.3 ánh giá m i b ng BLAST NCBI 31 3.2 C S D LI U C C B TRÌNH T nrSSU NHĨM N M KÝ SINH CƠN TRÙNG 32 3.3 nrSSU UN 42 3.4 K T QU HI U CH NH TRÌNH T 47 3.5 K T QU SO SÁNH V I C S D 3.6 K T QU XÂY D NG CÂY PHÁT SINH LOÀI 54 PH N - K T LU N VÀ 4.1 LI U GENBANK 53 NGH K T LU N 61 4.1.1 V lý thuy t 61 4.1.2 V th c nghi m 61 4.2 NGH 61 TÀI LI U THAM KH O………………………………………………… 62 vi Khóa lu n t t nghi p TV N ông trùng h th o (Cordyceps sinensis) lƠ m t loƠi n m ký sinh côn trùng, t lơu đƣ đ c s d ng bƠi thu c c truy n c a nhi u qu c gia chơu Á bao g m Vi t Nam G n đơy, nhi u nghiên c u cho th y khơng ch Cordyceps sinensis mà cịn nhi u loƠi khác nhóm n m nƠy có ti m n ng ng d ng y d c r t l n, bao g m chi n m Cordyceps, Isaria, Paecilomyces… Nh ng nghiên c u v ho t ch t c a nhóm n m nƠy cho th y chúng có kh n ng ch a tr hi u qu nhi u b nh khác nhau, n hình nh kh n ng u hoƠ đáp ng mi n d ch c a C sinensis, C cicadae (Weng et al., 2002) hay c ch t bào kh i u c a C sinensis, C cicadae (Weng et al., 2002), C ophioglossoides n nay, h n 400 loƠi Cordyceps đƣ đ c phát hi n x p vào h Clavicipitaceae, d a c u trúc th sinh s n, bào t qu th Tuy nhiên, hi u bi t v thành ph n loài c a chi n m r t h n ch b i nhi u nguyên nhơn ph i k đ n lƠ khó kh n g p ph i công tác phân lo i, đ nh danh Vì v y, m c dù nhà n m h c đƣ m t nhi u n m nghiên c u, nhiên nh ng công b v thành ph n loài chi n m v n ch a th t s h p lý nhi u mâu thu n, đ c bi t xem xét nh ng bi n đ i di truy n nh h ng b i nh ng vùng đ a lý khác hay m i liên h gi a th vơ tính (anamorph) th h u tính (teleomorph) c a chúng Nguyên nhân d n đ n nh ng khó kh n nƠy lƠ kh n ng bi n đ i r t cao c a loài n m b i nh h đ ng c a u ki n môi tr ng Trong nh ng n m g n đơy, nghi ng đƣ c gi i quy t hi u qu nh s đóng góp tích c c c a sinh h c phân t V i h ng ti p c n này, trình t nrSSU (nuclear ribosomal small subunit ậ ti u đ n v nh c a ribosome) thu c vùng b o t n 18S rRNA, đ c s d ng đ phân tích s phát sinh loài s đa d ng di truy n c a sinh v t Nghiên c u phát sinh loài g n đơy d a nhi u locus đ c l p cung c p m t m c đ tin c y l n h n giúp xác đ nh danh pháp lồi n m kí sinh côn trùng Vi t Nam, hi u bi t v thƠnh ph n loƠi c a Cordyceps r t h n ch , nghiên c u v n ch a đ SVTH: Tr c quan tơm nhi u vƠ g n nh ch a có m t b s u t p hoƠn ng Th B ch Vân Khóa lu n t t nghi p ch nh nƠo đ c công b v chi n m nƠy n Cordyceps đ t n c bán th tr c Bên c nh đó, nhi u s n ph m t ng có ngu n g c khơng rõ rƠng, ch y u đ c ngoƠi V i m t chi n m có nhi u ng d ng r ng rƣi y d c nh p c, vi c s u t p vƠ phơn l p gi ng thu n, khai thác thông tin khoa h c v loƠi n m nƠy lƠ m t vi c lƠm c n thi t Khi có đ c nh ng hi u bi t đ y đ v thƠnh ph n loƠi, s t o u ki n cho vi c khai thác vƠ nuôi tr ng n i đ a ngu n d c li u quý nƠy, góp ph n lƠm gi m giá thƠnh, h n ch s nh p ngo i s n ph m Cordyceps không rõ ngu n g c H n n a, vi c có đ c nh ng thông tin khoa h c đ y đ v loƠi n m nƠy s lƠ c s cho nghiên c u ng d ng Cordyceps Vi t Nam Trong gi i h n đ tƠi, ti n hƠnh ti p c n vùng gen nrSSU vƠ xơy d ng c s d li u vùng gen nrSSU, ti p đ n ti n hƠnh th c nghi m xơy d ng quy trình tách chi t DNA t h s i n m, t i u hóa quy trình PCR đ khu ch đ i vùng gen m c tiêu nrSSU, gi i trình t , xơy d ng vƠ so sánh cơy ph h phơn t t c s d li u trình t thu th p đ SVTH: Tr c ng Th B ch Vân PH N ậ T NG QUAN TÀI LI U Khóa lu n t t nghi p 71 78 99 98 95 81 89 75 99 89 99 99 92 74 95 86 98 85 97 82 94 72 88 81 65 82 99 Cordyceps scarabaeicola Arsef 5689 DL0075 Cordyceps militaris OSC 93623 Lecanicillium psalliotae CBS 101270 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 Cordyceps clade Engyodontium aranearum CBS 309.85 Lecanicillium antillanum CBS 350.85 Torrubiella confragosa IMI 304807 Clade C Cordyceps tuberculata OSC 111002 Cordyceps clade Cordyceps cardinalis CBS 113411 Cordyceps cardinalis CBS 113412 Isaria tenuipes OSC 111007 DL0038B Mariannaea pruinosa ARSEF 5413 DL0015 Cordyceps gunnii OSC 76404 Cordyceps japonica OSC 110991 Rotiferophthora angustispora CBS 101437 C taii clade Cordyceps chlamydosporia CBS 101244 Pochonia chlamydosporia CBS 504.66 Pochonia gonioides CBS 891.72 Metarhizium album ARSEF 2082 Balansia pilulaeformis AEG 94-2 Claviceps clade Epichloe typhina ATCC 56429 Verticillium epiphytum CBS 384.81 Cordyceps ophioglossoides OSC 106405 Balansia henningsiana AEG 96-27a Cordyceps capitata OSC 71233 Haptocillium balanoides CBS 250.82 C gunnii clade Haptocillium sinense CBS 567.95 Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Clade B Cordyceps cf acicularis OSC 128580 C unilateralis clade Cordyceps agriotidis ARSEF 5692 Cordyceps fracta OSC 110990 Cordyceps taii ARSEF 5714 C taii clade Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279 Shimizuomyces clade Shimizuomyces paradoxus EFCC 6564 Aschersonia badia BCC 8105 Clade A Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Hypocrella schizostachyi BCC 14123 Hypocrella clade Aschersonia placenta BCC 7869 Hypocrella sp GJS 89-104 Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 Simplicillium lanosoniveum IMI 317442 Simplicillium clade Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 DL0069 DL0006 Haptocillium zeosporum CBS 335.80 DL0077 Verticillium incurvum CBS 460.88 Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 Hypocreaceae Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 Hypocrea lutea ATCC 208838 Leuconectria clusiae ATCC 22228 Pseudonectria rousseliana AR 2716 Nectriaceae Viridispora diparietispora Cosmospora coccinea AR2741 Nectria cinnabarina GJS 89-107 Ophionectria trichospora CBS 109876 Hydropisphaera peziza GJS92-101 Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 Bionectriaceae Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Verticillium dahliae ATCC 16535 Glomerella cingulata FAU 553 Glomerella cingulata FAU 513 Hình 3.15 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Neighbor Joining v i b d li u 68 trình t (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) SVTH: Tr ng Th B ch Vân 55 Khóa lu n t t nghi p 65 99 95 52 85 86 67 51 74 82 74 88 58 89 99 99 98 91 58 98 52 60 99 99 78 98 Hình 3.16 Cây ph h phân t đ Lecanicillium antillanum CBS 350.85 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 Cordyceps clade Engyodontium aranearum CBS 309.85 Lecanicillium psalliotae CBS 101270 Cordyceps scarabaeicola Arsef 5689 DL0075 Cordyceps militaris OSC 93623 Cordyceps cardinalis CBS 113411 Clade C Cordyceps clade Cordyceps cardinalis CBS 113412 Isaria tenuipes OSC 111007 DL0038B Mariannaea pruinosa ARSEF 5413 DL0015 Cordyceps tuberculata OSC 111002 Cordyceps clade Torrubiella confragosa IMI 304807 Ophionectria trichospora CBS 109876 Hydropisphaera peziza GJS92-101 Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 Bionectriaceae Roumegueriella rufula CBS 346.85 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Epichloe typhina ATCC 56429 Verticillium epiphytum CBS 384.81 Balansia pilulaeformis AEG 94-2 Metarhizium album ARSEF 2082 Rotiferophthora angustispora CBS 101437 C taii clade Cordyceps chlamydosporia CBS 101244 Pochonia chlamydosporia CBS 504.66 Pochonia gonioides CBS 891.72 Balansia henningsiana AEG 96-27a Cordyceps capitata OSC 71233 Cordyceps ophioglossoides OSC 106405 Cordyceps gunnii OSC 76404 Cordyceps japonica OSC 110991 Cordyceps cf acicularis OSC 128580 C unilateralis clade Cordyceps agriotidis ARSEF 5692 Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Aschersonia placenta BCC 7869 Hypocrella clade Hypocrella sp GJS 89-104 Hypocrella schizostachyi BCC 14123 Cordyceps fracta OSC 110990 Aschersonia badia BCC 8105 Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279 Shimizuomyces clade Shimizuomyces paradoxus EFCC 6564 Cordyceps taii ARSEF 5714 C taii clade Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 Haptocillium balanoides CBS 250.82 C gunnii clade Haptocillium sinense CBS 567.95 Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 Hypocrea lutea ATCC 208838 Hypocreaceae Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 Verticillium incurvum CBS 460.88 Cosmospora coccinea AR2741 Nectria cinnabarina GJS 89-107 Nectriaceae Pseudonectria rousseliana AR 2716 Leuconectria clusiae ATCC 22228 Viridispora diparietispora Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 DL0069 Simplicillium lanosoniveum IMI 317442 Simplicillium clade Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 DL0006 Haptocillium zeosporum CBS 335.80 DL0077 Verticillium dahliae ATCC 16535 Glomerella cingulata FAU 553 Glomerella cingulata FAU 513 c xây d ng b ng ph ng pháp Maximum Parsimony v i b d li u 68 trình t (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) SVTH: Tr ng Th B ch Vân 56 Khóa lu n t t nghi p 70 76 99 94 79 69 73 61 89 99 99 96 85 92 83 99 56 99 90 57 67 52 70 72 Cordyceps scarabaeicola Arsef 5689 DL0075 Cordyceps militaris OSC 93623 Lecanicillium psalliotae CBS 101270 Cordyceps clade Engyodontium aranearum CBS 309.85 Lecanicillium antillanum CBS 350.85 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 Torrubiella confragosa IMI 304807 Clade C Cordyceps cardinalis CBS 113411 Cordyceps cardinalis CBS 113412 Cordyceps tuberculata OSC 111002 Cordyceps clade Isaria tenuipes OSC 111007 DL0038B Mariannaea pruinosa ARSEF 5413 DL0015 Cordyceps gunnii OSC 76404 Cordyceps japonica OSC 110991 Rotiferophthora angustispora CBS 101437 Cordyceps chlamydosporia CBS 101244 Pochonia chlamydosporia CBS 504.66 Pochonia gonioides CBS 891.72 Balansia pilulaeformis AEG 94-2 Epichloe typhina ATCC 56429 Metarhizium album ARSEF 2082 Verticillium epiphytum CBS 384.81 Balansia henningsiana AEG 96-27a Cordyceps capitata OSC 71233 Cordyceps ophioglossoides OSC 106405 Aschersonia placenta BCC 7869 Hypocrella clade Hypocrella schizostachyi BCC 14123 Hypocrella sp GJS 89-104 Cordyceps fracta OSC 110990 Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279 Shimizuomyces clade Clade A Shimizuomyces paradoxus EFCC 6564 Aschersonia badia BCC 8105 Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 Cordyceps taii ARSEF 5714 C taii clade Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 Haptocillium balanoides CBS 250.82 C gunnii clade Haptocillium sinense CBS 567.95 Cordyceps variabilis ARSEF 5365 Clade B Cordyceps cf acicularis OSC 128580 C unilateralis clade Cordyceps agriotidis ARSEF 5692 Aphysiostroma stercorarium ATCC 62321 Hypocrea lutea ATCC 208838 Hypocreaceae Sphaerostilbella berkeleyana GJS 82-274 Verticillium incurvum CBS 460.88 DL0006 DL0077 Haptocillium zeosporum CBS 335.80 Leuconectria clusiae ATCC 22228 Viridispora diparietispora Nectriaceae Pseudonectria rousseliana AR 2716 Cosmospora coccinea AR2741 Ophionectria trichospora CBS 109876 Nectria cinnabarina GJS 89-107 Hydropisphaera peziza GJS92-101 Roumegueriella rufula GJS 91-164 Bionectriaceae Hydropisphaera erubescens ATCC 36093 Roumegueriella rufula CBS 346.85 Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 Simplicillium lanosoniveum IMI 317442 Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 Simplicillium clade Simplicillium lamellicola CBS 116.25 DL0069 Verticillium dahliae ATCC 16535 Glomerella cingulata FAU 553 Glomerella cingulata FAU 513 Hình 3.17 Cây ph h phân t đ c xây d ng b ng ph ng pháp Maximum Likelihood v i b d li u 68 trình t (Các s hi n th giá tr bootstrap c a 1000 l n l p l i) SVTH: Tr ng Th B ch Vân 57 Khóa lu n t t nghi p Chúng k t h p phân tích k t qu d a ph h phân t vùng gen nrSSU truy v n trình t t ng đ ng GenBank (NCBI) đ đ nh danh m u DL0006, DL0015, DL0038bB, DL0069, DL0075 DL0077 Chi ti t phơn tích nƠy đ th hóa cho t ng tr cc ng h p m u nh sau: M u DL0006 phân nhóm v i trình t (AJ292419) K t qu phơn nhóm nƠy đ tham kh o Haptocillium zeosporum c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likelihood (ML) Trên NJ, MP ML, DL0006 phân nhóm v i Haptocillium zeosporum (AJ292419) v i bootstrap l nl t đ t 98%, 99% 99% Cùng v i k t qu so sánh v i GenBank NCBI (Cordyceps gunnii) cho m u này, tính h p nh t đ c ch ng minh t ng đ i rõ: Cordyceps gunnii Haptocillium zeosporum đ u thu c phân nhóm C gunnii clade h Clavicipitaceae clade B Do đó, chúng tơi kh ng đ nh m u DL0006 có quan h g n g i v i lồi nhóm C gunnii clade M u DL0015 cho k t qu phân nhóm v i Mariannaea pruinosa (AY184979) t nhân hàng gi ng ARSEF 5413 đ c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likelihood (ML) v i giá tr bootstrap đáng tin c y l n l t 95%, 85% vƠ 79% GenBank NCBI cho k t qu t ng th i, k t qu so sánh v i ng đ ng cao nh t v i Mariannaea pruinosa (AY184979) V y có th k t lu n m u n m DL0015 thu đ c m t loài thu c chi Cordyceps sp r t g n ho c Mariannaea pruinosa (Cordyceps pruinosa) M u DL0038B cho k t qu phân nhóm v i lồi Isaria tenuipes (DQ522559) t ngân hàng gi ng OSC 111007 K t qu phơn nhóm nƠy hoƠn toƠn t ng đ ng gi a ba ph h v i giá tr bootstrap đáng tin c y (98% đ i v i cơy NJ, 95% đ i v i cơy MP vƠ 94% đ i v i ML K t h p v i k t qu truy v n GenBank hoƠn toƠn t ng đ ng v i k t qu đ nh danh ph h K t lu n rút đơy lƠ: m u DL0038B lồi r t g n ho c Isaria tenuipes M u DL0069 cho k t qu phân nhóm Neighbor Joining (Haptocillium zeosporum) v i bootstrap th p, Maximum Parsimony Maximum SVTH: Tr ng Th B ch Vân 58 Khóa lu n t t nghi p Likelihood (Simplicillium lamellicola) c ng t ng đ i th p K t qu truy v n GenBank c a NCBI cho th y m u nƠy t ng đ ng v i Cordyceps gunnii (DQ838789) Theo cơng trình nghiên c u c a Sung c ng s (2007), Cordyceps gunnii Haptocillium zeosporum thu c phân nhóm C gunnii clade c a clade B h Clavicipitaceae V y t m th i k t lu n m u có quan h g n g i v i nhóm C gunnii (còn g i C subg Cordyceps) M u DL0075 phân nhóm ph h phân t cho th y có m i quan h g n nh t v i đ i di n tham chi u thu c chi Cordyceps (Cordyceps scarabaeicola thu c ngân hàng gi ng ARSEF) K t qu phân nhóm r t rõ ràng, giá tr bootstrap r t đáng tin c y K t qu truy v n GenBank thu c NCBI cho th y m u nƠy t ng đ ng nh t v i Cordyceps scarabaeicola (AF339574) K t lu n v m u DL0075 có quan h g n g i ho c Cordyceps scarabaeicola (AF339574) M u DL0077 cho k t qu phân nhóm v i lồi Haptocillium zeosporum (AJ292419) c ba ph h phân t Trên ph h Neighbor Joining, giá tr bootstrap đ t 85%, Maximum Parsimony Maximum Likelihood, giá tr bootsstrap đ t 99%, cho th y đ tin c y cao K t h p v i k t qu truy v n GenBank c a NCBI có quan h g n g i v i loài Cordyceps gunnii (DQ838789) Do Cordyceps gunnii Haptocillium zeosporum thu c phân nhóm C gunnii clade B c a h Clavicipitaceaea nên không th k t lu n v loài cho m u DL0077, ch ghi nh n m t m u thu c chi Cordyceps thu c phân nhóm C gunnii SVTH: Tr ng Th B ch Vân 59 Khóa lu n t t nghi p B M u GenBank ML MP DL0006 Cordyceps gunnii Haptocillium zeosporum Haptocillium zeosporum Haptocillium zeosporum Haptocillium zeosporum ho c Cordyceps gunnii DL0015 Cordyceps pruinosa Mariannaea pruinosa Mariannaea pruinosa Mariannaea pruinosa Codyceps pruinosa (có th vơ tính Mariannaea pruinosa) DL0038B Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes DL0069 Cordyceps gunnii Haptocillium zeosporum Simplicillium lamellicola Simplicillium lamellicola Simplicillium lamellicola ho c Haptocillium zeosporum DL0075 Cordyceps scarabaeicola Cordyceps scarabaeicola Cordyceps scarabaeicola Cordyceps scarabaeicola Cordyceps scarabaeicola DL0077 Cordyceps gunnii Haptocillium zeosporum Haptocillium zeosporum Haptocillium zeosporum Haptocillium zeosporum ho c Cordyceps gunnii SVTH: Tr ng Th B ch Vân 60 PH N ậ K T LU N VÀ NGH Khóa lu n t t nghi p 4.1 K T LU N 4.1.1 V lý thuy t Chúng đƣ xơy d ng đ ký sinh côn trùng g m b c c s lý lu n cho vi c h tr đ nh danh loài n m c kh o sát in silico đ đánh giá h m i, thu th p xây d ng c s d li u c c b c a vùng gen m c tiêu nrSSU Xây d ng quy trình th c nghi m nh m thu đ c vùng gen m c tiêu, gi i trình t hi u ch nh trình t đ xu t nh ng trình t xác xây d ng thành cơng ph h phân t d a 62 trình t tham kh o t Sung c ng s Xây d ng ph h phân t đ nh danh m u n m ký sinh côn trùng v i ph ng pháp: Neighbor Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood 4.1.2 V th c nghi m Xây d ng đ c ph ng pháp tách chi t có b sung -mercaptoethanol h tr đ nh danh lồi n m ký sinh trùng v i th t nh sau: Chúng đƣ xơy d ng thành cơng quy trình th c nghi m tách chi t DNA t h s i n m b ng ph ng pháp phenol-chloroform có b sung -mercaptoethanol Xây d ng thành cơng quy trình PCR đ khu ch đ i vùng gen m c tiêu nrSSU Gi i trình t hi u ch nh đ c trình t c a m u n m ký sinh côn trùng DL0006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075 DL0077 v i c p m i NS1/NS4 khu ch đ i vùng gen nrSSU đ xu t nh ng trình t xác Xây d ng thành cơng ph h phân t nh m đ nh danh m u n m NGH 4.2 Chúng d ki n t ng thêm c m u đ kh o sát gi i h n b s u t p m u n m t i phịng thí nghi m M r ng kh o sát thêm vùng gen m c tiêu khác thu c nhóm House-keeping genes nh m h SVTH: Tr tr đ nh danh m u n m ng Th B ch Vân thu c chi n m ký sinh trùng 61 Khóa lu n t t nghi p TÀI LI U THAM KH O TI NG VI T [1] Lê T n H ng, Võ Th H nh, Lê Th Bích Ph ng, Tr n Th nh Phong, Tr Th H ng Vơn, Somsak Sivichai (2010), “N m côn trùng t i v ng n qu c gia Cát Tiên: Ngu n tài nguyên quý cho ng d ng sinh h c”, H i ngh Khoa h c k ni m 35 n m Vi n Khoa h c Công ngh Vi t Nam-Hà N i, tr 1-10 [2] Nguy n D ng Khuê (2005), “S d ng n m Metarhizium anisopliae Sorok Phòng tr m i nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo ph ng pháp lơy nhi m”, H i ngh trùng h c tồn qu c l n th 5, Hà N i, tr 409-414 [3] Nguy n Th L c, Võ Th Bích Chi, Nguy n Th Nhàn, Ph m Quang H ng, Hu nh V n Nghi p, V Ti n Khang Nguy n c ThƠnh (2002), “Nghiên c u, s n xu t ng d ng hai ch ph m sinh h c đ qu n lý loài sâu h i lúa”, Vi n lúa BSCL, tr 274-295 [4] Ph m Quang Thu (2013), “ ông trùng h th o nghiên c u nuôi tr ng th qu vi n Khoa h c Lâm nghi p Vi t Nam”, H i th o qu c t Khoa h c công ngh ph c v s n xu t nông nghi p công ngh cao t nh Lơm ng [5] Ph m Th Thùy (2010), “Nghiên c u phát tri n ngu n n m Beauveria Metarhizum đ ng d ng phòng tr sâu h i tr ng, r ng phát tri n n m Cordyceps làm th c ph m ch c n ng cho ng i”, Báo cáo t i H i th o Qu c gia b nh h i th c v t Vi t Nam, Nhà xu t b n Nông nghi p, tr 224 -231 [6] Tr n V n Hai, Tr nh Th Xuân, Ph m Kim S n (2006), “T o sinh kh i th nghi m hi u l c c a m t s lo i n m ký sinh sơu n t p r y m m h i rau c i t i TP C n Th ”, T p chí nghiên c u khoa h c, tr ng HCT [7] Tr nh Tam Ki t (2001), “Danh l c loài th c v t Vi t Nam (ph n N m)”, NhƠ xu t b n Nông nghi p, Hà N i SVTH: Tr ng Th B ch Vân 62 Khóa lu n t t nghi p [8] Võ Th Thu Oanh, Lê ình ơn, Bùi Cách Tuy n (2007), “ c m sinh h c kh n ng gơy b nh c a n m Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đ i v i sâu khoang (Spodoptera litura F.) h i rau c i xanh (Brassica juncea L.)”, T p chí KHKT Nơng Lâm nghi p, s 1&2, i h c Nông Lâm Tp HCM, tr 58-63 TI NG ANH [9] Ban M., Hettich D., Goutet M (1998), “Serum-borne factor(s) of 1,1dichloroethylene and 1,2- dichlorobenzene-treated mice inhibited in vitro antibody forming cell response and natural killer cell activity”, Toxicol Lett, 94(2), pp 93-101 [10] Bok J W., Lermer L., Chilton J., Klingeman H G., Tower G H N (1999), "Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis” Phytochemistry, 51(7), pp 891-898 [11] Borneman J., and Hartin R J (2000), “PCR primers that amplify fungal rRNA genes from environmental samples”, Appl Environ Microbiol, 66, pp 4356-4360 [12] Cabib E., Bowers B., Sburlati A., Silverman S J (1988), “Fungal cell wall synthesis: the construction of a biological structure”, Microbiological Sciences, 5(12), pp 370-375 [13] Chiou C T., Kile D E., Rutherford D W (2000), “Sorption of Selected Organic Compounds from Water to a Peat Soil and Its Humic-Acid and Humin Fractions: Potential Sources of the Sorption Nonlinearity”, Environ Sci Technol., 34(7), pp 1254-1258 [14] Chomczynski P, Sacchi N (1987), Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal Biochem, 162(1), pp 156-9 [15] Dowell K (2008), “Molecular Phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationship”, Math 500, pp 1-16 SVTH: Tr ng Th B ch Vân 63 Khóa lu n t t nghi p [16] Felsenstein J (1985), “Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap”, Evolution, 39(4), pp 783-791 [17] Guarro J., Gené J., and Alberto M Stchigel (1999), “Developments in Fungal Taxonomy”, Clinical Microbiology Reviews, pp 454-500 [18] Hall B.G (2001), “Phylogenetic Trees Made Easy: A How-to Manual for Molecular Biologists”, Sunderland Massachusetts: Sinauer Associates [19] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), “Toiypocladium injatum is the anamorph of Cordyceps subsessilis”, Mycologia, 88(5), pp 715-719 [20] Holliday J., Cleaver M (2008), “Medicinal Value of the Caterpillar Fungi Species of the Genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A Review”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 10(3), pp 219-234 [21] Itoh H., Shioda T., Matsura T., Koyama S., Nakanishi T., Kajiyama G., Kawasaki T (1994), “Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC Rat Hepatoma Cell Culture - Role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses”, Arch Biochem Biophys., 313 (1), pp 120-125 [22] Jones E., Moodie I M (1990), “2-Thiophenethiol”, Org Synth 6: 979 [23] Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella”, Transactions of the Mycological Society of Japan, 23, pp 329-364 [24] Kuo Y C., Tsai W J., Shiao M S., Chen C F., Lin C Y (1996), “Cordyceps sinensis as an immunomodulatory agent”, Am J Chin Med, 24(2), pp 111-25 [25] Lemey P., Salemi M., Vandamme A M (2009), The Phylogenetic Handbook: A practical approach to phylogenetic analysis and hypothesis testing, Cambridge University press SVTH: Tr ng Th B ch Vân 64 Khóa lu n t t nghi p [26] Li S P, Tsim K W (2004), “The biological and pharmacological properties of Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine that has broad clinical applications”, Herbal and Traditional Medicine (New York), pp 657-682 [27] Liu Y J., Whelen S., Hall B D (1999), “Phylogenetic Relationships Among Ascomycetes: Evidence from an RNA Polymerse II Subunit”, Molecular Biology and Evolution, 16(2), pp 1799-1808 [28] Manabe N., Sugimoto M., Azuma Y., Taketomo N., Yamashita A., Tsuboi H., Tsunoo A., Kinjo N., Nian-Lai H., Miyamoto H (1996), “Effects of the mycelial extract of cultured Cordyceps sinensis on in vivo hepatic energy metabolism in the mouse”, Japanese Journal of Pharmacoogy, 70(1), pp 85-88 [29] McCoy C W (1990), “Entomogenous fungi as microbial pesticides”, pp 139159 In R R Baker, and P E Dunn (eds.), New Directions in Biological Control Alan R Liss, New York [30].Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Kwon Y M., Shinozuka K., Kunitomo M (1999), “Inhibitory effect of Cordyceps sinensis on spontaneous liver metastasis of Lewis lung carcinoma and B16 melanoma cells in syngeneic mice”, Japanese Journal of Pharmacology, 79(3), pp 335-341 [31] Ng T B, Wang H X (2005), “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 57, pp 1509-1519 [32] Schabereiter-Gurtner C., Piñar G., Lubitz W and Rölleke S (2001), “Analysis of fungal communities on historical church window glass by denaturing gradient gel electro- phoresis and phylogenetic 18S rDNA sequence analysis”, J Microbiol Methods, 47, pp 345-354 [33] Shim J.S., Min E.G., Chang H.R., Lee C.Y., Kim S.S., Han Y.H (2000), “Cytoctxicity against human cancer cell lines by Paecilomyces tenuipes DGUM 32001”, Korean J Microbiol, 36, pp 312-315 SVTH: Tr ng Th B ch Vân 65 Khóa lu n t t nghi p [34] Smit E., Leeflang P., Glandorf B., van Elsas, J.D., and Wernars, K (1999), “Analysis of fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCRamplified genes encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electro- phoresis”, Appl Environ Microbiol, 65, pp 2614-2621 [35] Spatafora J W., Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., White J F Jr (2007), “Phylogenetic evidence for an animal pathogen origin for ergot and the grass endophytes”, Molecular Ecology, 16, pp 1701-1711 [36] Sun Y J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H X Chen C., Zhang C.K (2003), “Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690-694 [37] Sung G H., Hywel-Jones N L., Sung J M., Luangsa-ard J J., Shrestha B., Spatafora J W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”, Studies in Mycology, 57(1), pp 5-59 [38] Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., Spatafora J W (2007), “A multigene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach”, Molecular Phylogenetics and Evolution, in press [39] Szymanski M., Barciszewska M Z., Barciszewski J & Erdmann V A (2000), “5S ribosomal RNA data- base Y2K”, Nucl Acids Res, 28(1), pp 166-167 [40] Taborsky V (1992), Small-scale processing of microbial pestcides FAO Agric Service Bull 96 Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome [41] Tang, Ming-chak., , (2007), “Phylogenetic utility of ribosomal and protein-coding genes in Sordariomycetes systematics and evolutionary relationships within theXylariaceae”, The University of Hong Kong SVTH: Tr ng Th B ch Vân 66 Khóa lu n t t nghi p [42] Taylor A L., Watson C J., Bradley J A (2005), “Immunosuppressive agents in solid organ transplantation: Mechanisms of action and therapeutic efficacy”, Critical review in oncology Hematology, 56(1), pp 23-46 [43] Waddington M (2009), “Identification of Fungi Using Ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Sequences”, Pharmaceutical Technology [44] Wang S Y., Shiao M S (2000), “Pharmacological Functions of Chinese Medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species”, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4), pp 248-257 [45] Wasser S P (2002), “Medicinal mushrooms as a source of anti-tumor and immunomodulating polysaccharides”, Appl Microbiol Biotechnol, 60, pp 258-274 [46] Wenger R M (1984), “Synthesis of cyclosporine Total syntheses of „cyclosporin A‟ and „cyclosporin H‟, two fungal metabolites isolated from the species Tolypocladium inflatum GAMS”, HCA, 67, pp 502-525 [47] White T J., Bruns T., Lee S., Taylor J (1990) “Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics”.In Innis, M A., Gelfand, D H., Sninsky, J J., White, T J., (Eds) PCR protocols, a guide to methods and applications Academic Press: San Diego, pp 315-322 [48] Yanada H (1984) “Structure and antitumor activity of alkali-soluble polysaccharides from Cordyceps ophioglossiodes”, Carbonhydr Res, 125, pp 107115 [49] Yoshikawa N., Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2‟ ậ Deoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo, 21, pp 291-296 [50] Zhou J., Tang K (2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journnal of Pharmacy and Pharmacology, 61, pp 279-291 SVTH: Tr ng Th B ch Vân 67 Khóa lu n t t nghi p INTERNET [51] http://www.dongtrunghathao.com/ [52] http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm [53] http://cordyceps.us/pages/systematics [54] http://www.biology-online.org/dictionary/Housekeeping_genes [55] http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n7/box/nrg2592_BX2.html [56] http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/Protocols_Folder/Primers/Primers.htm SVTH: Tr ng Th B ch Vân 68