Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài nấm ký sinh côn trùng metarhizium anisopliae etsch sorok beauveria bassiana bals vuill và paecilomyces spp trên nhóm rau ăn lá ở đồng bằng sông cửu long

THU THẬP, PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok Paecilomyces spp Ở SÁU TỈNH ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG Lê Hữu Phước* TĨM LƯỢC Kết đề tài thu thập tổng cộng 288 dòng nấm từ tỉnh An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng Hậu Giang lồi sâu bị nhiễm bệnh, bao gồm loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae Sorok., Beauveria bassiana Vuill Paecilomyces spp Bainier Trong đó, q trình phân lập, tách rịng định danh (trong mơi trường PDA) thu 51 dòng Kết đánh giá độ hữu hiệu dòng nấm ấu trùng sâu ăn tạp tuổi phịng thí nghiệm cách nhỏ 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm (mật số 108 bào tử.ml-1) chọn 10 dịng nấm có hiệu M2-AG, M5-AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2AG P3-TG Môi trường SDAY3 môi trường thích hợp cho sinh trưởng bào tử (bào tử.ml-1) loại môi trường lỏng (không chứa agar): CDA, CAM, SDAY1 SDAY3 ABSTRACT 288 isolates of entomopathogenic fungi of Metarhizium anisopilae Sorok., Beauveria bassiana Vuill and Paecilomyces spp Bainier were collected from diseased insects in An Giang, Tien Giang, Can Tho, Vinh Long, Soc Trang and Hau Giang provinces Among them, isolation, purification and identification got 51 isolates in PDA medium The evaluation results of the effectiveness on the Armyworm (Spodoptera litura) in the laboratory by coated dropping with 20µl (approximately 108 condia.ml-1) of the entomopathogenic fungi suspension on the second instars larve Armyworm showed that the most effectiveness of these isolates were M2-AG, M5-AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2-AG P3-TG isolates SDAY3 is the best medium for conidia growing (conidia.ml-1), compared with four liquid medium (containing no agar): CDA, CAM, SDAY1 and SDAY3 ĐẶT VẤN ĐỀ Phòng trừ sâu hại khó khăn lớn nghề trồng rau mối quan tâm lo lắng hàng đầu nơng dân Biện pháp phịng trừ nơng dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học mà biết đến biện pháp khác Sự phát triển tính kháng thuốc sâu hại ảnh hưởng thuốc hóa học lên sức khỏe người môi trường tạo áp lực mạnh mẽ cho phát triển tác nhân sinh học phịng trừ tổng hợp trùng gây hại Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu nước giới Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela cho thấy việc sử dụng loại nấm ký sinh trùng phịng trừ tổng hợp loài sâu gây hại cách hợp lý mang lại hiệu cao (Butt, T M Copping, L., 2000) Ở nước, có số nghiên cứu Viện Bảo vệ thực vật Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long rầy nâu đạt hiệu tốt, 67% sau 10 ngày Đề tài thực nhằm phân lập định danh số dòng nấm sáu tỉnh Đồng sông Cửu Long, làm tiền đề cho việc nghiên cứu hiệu loài nấm lên số đối tượng gây hại quan trọng rau màu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm phân lập loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok Paecilomyces spp tỉnh An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang Tiền Giang - Thời gian thu mẫu: tháng 08 – 11/2008, thu vào thời điểm ngày tốt vào buổi sáng sớm hay chiều mát lúc ẩm độ cao, sợi nấm mọc trương nước, khả sinh trưởng mạnh, thu thập phân lập dễ Lịch thu mẫu theo địa phương, lần thu mẫu không đủ sâu bị nhiễm nấm bổ sung vào lần khác mẫu/ruộng x loại nấm x xã x tỉnh = 288 mẫu - Cách lấy mẫu sâu nhiễm nấm: Dùng kẹp inox đặt mẫu sâu nhiễm nấm tự nhiên (quan sát mắt thường) vào có sẵn bơng gịn thấm ướt để tạo ẩm độ, ghi nhãn nơi thu thập - Nhận biết mẫu sâu bị nhiễm nấm tự nhiên: Quan sát mắt thường, nhận diện hình thái bên ngồi nấm thể trùng: + Nấm Metarhizium anisopilae: có màu lục xanh lục (nên thường gọi nấm lục cương) Sợi nấm phát triển bề mặt côn trùng ban đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh nhạt Trên bề mặt thể trùng có lớp phấn rõ màu xanh lục, sợi nấm mịn * Bộ môn Khoa học Cây Trồng, Khoa NN&TNTN, Email: lhphuoc@agu.edu.vn + Nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương): đặc điểm loại nấm sợi nấm mọc xốp, trông sợi nấm trắng, mịn mọc xốp, bao phủ bề mặt côn trùng + Nấm Paecilomyces spp (nấm tím): sợi nấm mọc mịn bao phủ trùng, ban đầu có màu tím nhạt sau sợi nấm chuyển sang màu tím 2.2 Phân lập, tách ròng, định danh tồn trữ mẫu nấm thu môi trường PDA (Potato Destrose Agar) - Phương pháp phân lập: Mẫu thu trữ đĩa petri có lót giấy thấm bơng gịn ẩm để tạo ẩm độ cho nấm phát triển, quan sát thấy tơ nấm xuất tiến hành nuôi cấy nấm môi trường PDA Nuôi cấy theo phương pháp Slide culture để quan sát bào tử cành bào đài Các bước phân lập: • Chuẩn bị mảnh mơi trường Agar đặt đĩa petri, có diện tích mm2, dầy mm • Đặt mảnh mơi trường Agar lame, đĩa petri có để giấy thấm nước tạo ẩm độ • Cấy bào tử nấm vào mảnh Agar Sau dùng lame đậy lên • Ủ đĩa Petri nhiệt độ 250C – ngày Sau chuyển mảnh Agar sang lame đem quan sát kính hiển vi huỳnh quang Quan sát nhận diện, mô tả chụp hình dạng bào tử, cành bào đài dòng nấm - Tiến hành định danh theo hệ thống phân loại Barnett, H L and Barry, B Hunter (1998) sau có dạng bào tử cành bào đài dòng nấm Quan sát, ghi nhận số đặc điểm sinh học trình phân lập để bước đầu ghi nhận dịng nấm sinh trưởng mạnh, dễ nhân sinh khối màu sắc, hình dạng, đặc điểm bào tử, khuẩn lạc đĩa petri 2.3 Thử nghiệm hoạt lực sinh học mẫu nấm thu thập sâu ăn tạp điều kiện phịng thí nghiệm Sử dụng dòng nấm phân lập tách ròng từ mẫu sâu bị ký sinh tự nhiên, cấy nguồn nấm sang môi trường PDA khoảng 7-10 ngày cho sợi nấm phát triển sinh lượng bào tử định Sau tiến hành cạo nấm thu lấy bào tử, đếm mật số bào tử pha loãng huyền phù bào tử đến mật số 108 bào tử.ml-1 Thí nghiệm bố trí theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên, 52 nghiệm thức (51 dòng nấm đối chứng), lần lặp lại, lặp lại 20 cá thể sâu đồng cở Nghiệm thức đối chứng sử dụng nước cất trùng Mỗi cá thể sâu nuôi riêng cốc nhỏ có nắp đậy để tránh bị lây nhiễm Chủng vào cốc 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm cho thức ăn nhân tạo vào, đậy cốc lại tránh lây nhiễm Ghi nhận số sâu chết sau 4, 6, 8, 10 ngày sau xử lý loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana Paecilomyces spp Mỗi lần lấy tiêu đo nhiệt độ ẩm độ Tính độ hữu hiệu (%) công thức Abbott (1925) 2.4 Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng lên hình thành phát triển bào tử loại nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana nấm Paecilomyces spp mơi trường lỏng Sử dụng 10 dịng nấm phân lập thử độ hữu hiệu sâu ăn tạp phịng thí nghiệm Cấy nguồn nấm vào đĩa petri có chứa 10 ml mơi trường PDA loại nấm từ 10 đến 14 ngày cho nấm phát triển sinh số lượng bào tử định Sau đó, cho 10ml nước cất vào đĩa dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi trường để thu lấy bào tử đếm mật số bào tử ban đầu Bố trí thí nghiệm theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên với nghiệm thức tương ứng với loại môi trường CDA, CAM, SDAY1, SDAY3 lần lặp lại Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với bình tam giác 400ml (chứa 100ml môi trường thử nghiệm) Ở bình tam giác, chủng 1ml huyền phù bào tử nấm có mật số 107 bào tử.ml-1 Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa mơi trường) đặt máy lắc tốc độ 120 vòng.phút-1 nhiệt độ ánh sáng phịng thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm Qua trình thu thập mẫu trùng bị nhiễm vi nấm ngồi tự nhiên đồng ruộng, chúng tơi nhận định trùng bị nhiễm lồi nấm ký sinh chúng diện với mật số cao sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Hai trăm tám mươi tám dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana Paecilomyces spp thu thập từ ruộng sản xuất rau nơng dân vườn rau gia đình tỉnh: An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang Tiền Giang (Bảng 1) Các dòng nấm chủ yếu thu thập đối tượng gây hại như: sâu ăn tạp (Spodoptera litura), sâu ăn đọt (Crocidolomia binotalis), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), rầy phấn trắng (Aleurodicus dispersus), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu đục trái đậu nành (Etiella zinckenella), rầy mềm (Brevicoryne brassacicae) bọ nhảy (Phyllotetra striolata) Bảng Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập số tỉnh Đồng sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008 STT Phường, Xã Quận, Huyện Tỉnh Số mẫu Nhiệt độ / ẩm độ TB Kiến An Chợ Mới An Giang 12 29,40C / 70,4% Long Điền A Chợ Mới An Giang 12 30,40C / 68,5% 10 31,10C / 62,5% Bình Phước Xuân Chợ Mới An Giang Chợ Mới An Giang 12 26,40C / 62,6% Mỹ Hiệp Bình Thủy Cần Thơ 16 30,60C / 70% Long Tuyền Bình Thủy Cần Thơ 12 25,80C / 75% Long Hịa Bình Thủy Cần Thơ 18 31,30C / 69,7% Bình Thủy Cần Thơ 12 29,90C / 61% An Thới Bình Thủy Bình Minh Vĩnh Long 14 32,20C / 70% Mỹ Hịa Bình Minh Vĩnh Long 12 28,50C / 66% 10 Đơng Bình Bình Minh Vĩnh Long 12 30,40C / 69,8% 11 Đơng Thạnh Bình Minh Vĩnh Long 12 27,60C / 71% 12 Đông Thành Hậu Giang 12 29,9 0C / 70,1% 13 Tân Phú Long Mỹ Long Mỹ Hậu Giang 12 30,80C / 69% 14 Vĩnh Thuận Đông Hậu Giang 12 25,90C / 74,8% 15 Thuận Hòa Long Mỹ Long Mỹ Hậu Giang 12 32,10C / 69,8% 16 Thuân Hưng Sóc Trăng 12 27,60C / 70,3% 17 Lai Hịa Vĩnh Châu Vĩnh Châu Sóc Trăng 30,40C / 69,6% 18 Vĩnh Tân Vĩnh Châu Sóc Trăng 12 29,60C / 71,2% 19 Vĩnh Phước Vĩnh Châu Sóc Trăng 30,50C / 74% 20 Vĩnh Hiệp 12 31,60C / 74,4% 21 Phú Kiết Chợ Gạo Tiền Giang 12 30,00C / 70,1% 22 Hòa Tịnh Chợ Gạo Tiền Giang Chợ Gạo Tiền Giang 12 29,60C / 69,7% 23 Mỹ Tịnh An Chợ Gạo Tiền Giang 29,70C / 70,8% 24 Trung Hòa Các dòng nấm Metarhizium anisopliae Beauveria bassiana dễ tìm, thường xuyên diện với tỷ lệ sâu chết cao so với dịng nấm Paecilomyces spp Ngồi ra, nấm Paecilomyces spp tồn ngồi tự nhiên đơi khơng có màu đặc trưng (tơ nấm màu tím) giai đoạn đầu ký sinh sâu có màu trắng, sau chuyển dần sang hồng nhạt, giai đoạn sau nấm thối hóa có màu nâu đen nhạt 3.2 Phân lập, định danh tồn trữ Các dòng nấm sau thu thập ngồi mang phịng thí nghiệm để phân lập đĩa petri với môi trường nấm chuẩn PDA Kết phân lập 51 dòng nấm, cụ thể sau: - Nấm Metarhizium anisopliae (20 dòng): dòng An Giang (M1-AG, M2-AG, M3-AG, M4AG, M5-AG), dòng Cần Thơ (M1-CT, M2-CT, M3-CT, M4-CT), dòng Vĩnh Long (M1-VL, M2-VL, M3-VL), dòng Hậu Giang (M1-HG, M2-HG, M3-HG), dịng Sóc Trăng (M1-ST, M2ST, M3-ST) dòng Tiền Giang (M1-TG, M2-TG) - Nấm Beauveria bassiana (17 dòng): dòng An Giang (B1-AG, B2-AG, B3-AG, B4-AG), dòng Cần Thơ (B1-CT, B2-CT, B3-CT), dòng Vĩnh Long (B1 –VL, B2-VL, B3-VL), dòng Hậu Giang (B1-HG, B2-HG), dịng Sóc Trăng (B1-ST, B2-ST) dịng Tiền Giang (B1-TG, B2-TG, B3-TG) - Nấm Paecilomyces spp (14 dòng): dòng An Giang (P1-AG, P2-AG, P3-AG), dòng Cần Thơ (P1-CT, P2-CT), dòng Vĩnh Long (P1-VL, P2-VL, P3-VL), dòng Hậu Giang (P1-HG, P2-HG), dịng Sóc Trăng (P1-ST) dịng Tiền Giang (P1-TG, P2-TG, P3-TG) Khoảng 3-5 ngày đầu sợi tơ nấm có màu trắng nhạt nên dễ nhầm lẫn loại nấm không quan sát kỹ, nhiên nấm Paecilomyces spp tương đối khó tìm ngồi tự nhiên với màu sắc đặc trưng Giai đoạn sau nấm công vào thể côn trùng, sợi nấm nẩy chồi bao phủ thể trùng loại nấm có màu sắc, hình dáng đặc trưng Nấm Metarhizium anisopliae, mặt đĩa xuất vòng màu xanh sậm, đen (còn gọi nấm xanh hay nấm lục cương), nấm Beauveria bassiana mặt đĩa petri tồn thể có màu trắng (cả tơ nấm bào tử nên gọi nấm trắng hay nấm bạch cương), nấm Paecilomyces spp tơ nấm dần chuyển sang màu tím than từ nhạt đến đậm (khoảng từ 5-7 ngày sau cấy, nên cịn có tên nấm tím) Nhiều lồi trùng chết có tơ nấm màu đen, nâu nhạt, chí có màu vàng rơm nấm Paecilomyces spp Sự đa dạng hình thái bên ngồi Phạm Thị Thùy mô tả năm 2001 thu thập, phân lập dòng nấm Paecilomyces spp tự nhiên a b c d e f (a,b,c): Nấm Metarhizium anisopliae (d,e): Nấm Beauveria bassiana (f): Nấm Paecilomyces spp Hình Hình dạng, màu sắc tơ nấm điển hình số chủng nấm mơi trường PDA vào 10 NSKC 3.3 Thí nghiệm hoạt lực dòng nấm sâu ăn tạp phòng thí nghiệm Mười dịng nấm có hiệu cao sâu ăn tạp điều kiện phịng thí nghiệm M2-AG, M5AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2-AG P3-TG Hiệu sâu ăn tạp vào thời điểm 10 ngày sau chủng nấm nấm Metarhizium anisopliae từ 75,7% (M5-AG) đến 82,5 % (M1-CT), nấm Beauveria bassiana từ 67,8% (B2-TG) đến 80,1% (B1-VL) nấm Paecilomyces spp từ 69,2% (P3-TG) - 69,5% (P2-AG) 3.4 Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng Kết thí nghiệm cho thấy, tất 10 dịng nấm khác biệt có ý nghĩa thống kê mức độ 1% so với nghiệm thức đối chứng vào thời điểm ngày sau lắc (NSKL) môi trường lỏng, độ hữu hiệu tăng dần từ NSKL đến 14 NSKL Tuy nhiên, độ hữu hiệu cao sâu ăn tạp thể môi trường SDAY3 Cụ thể, môi trường SDAY3 cho mật số bào tử (bào tử.ml-1) cao với nhiều dòng nấm nhất, chọn để nhân sinh khối việc quy trình xuất chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh sau Về thời gian nhân sinh khối (thời gian lắc môi trường lỏng để nhân sinh khối nấm) cho kết sau: NSKL thời điểm tối ưu nấm Metarhizium anisoplia Trong đó, đến NSKL, mật số bào tử tạo cao nấm Beauveria bassiana nấm Paecilomyces spp đạt mật số bào tử cao vào NSKL KẾT LUẬN Kết thu thập 24 Phường/Xã thuộc tỉnh: An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Vĩnh Long Hậu Giang (bao gồm lồi nấm ký sinh trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana Paecilomyces spp.) tổng cộng 288 dịng nấm Trong đó, phân lập định danh 51 dòng nấm Hiệu sâu ăn tạp vào thời điểm 10 NSKC nấm nấm Metarhizium anisopliae 82,5 % (M1-CT), nấm Beauveria bassiana 80,1% (B1-VL) nấm Paecilomyces spp 69,5% (P2-AG) Môi trường SDAY3 cho mật số bào tử cao NSKL, chọn môi trường nhân sinh khối chung TÀI LIỆU THAM KHẢO Butt, T M and Copping, L 2000 “Fungal biological control agents”, Pesticide Outlook 11: 186-191 Barnett, H L and Barry B Hunter 1998 “Key for insects pathologens” Collection Of Insect Pathogens Insect Pathology Manual 2, Acadamic Press Smith, D 2002 “Attachment of mycopathogens to cuticle”, The initial event of mycoses in arthropod hosts p100 ... ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana Paecilomyces spp. ) tổng cộng 288 dịng nấm Trong đó, phân lập định danh 51 dòng nấm Hiệu sâu ăn tạp vào thời điểm 10 NSKC nấm nấm Metarhizium. .. ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng lên hình thành phát triển bào tử loại nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana nấm Paecilomyces spp môi trường lỏng Sử dụng 10 dòng nấm phân lập thử...+ Nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương): đặc điểm loại nấm sợi nấm mọc xốp, trông sợi nấm trắng, mịn mọc xốp, bao phủ bề mặt trùng + Nấm Paecilomyces spp (nấm tím): sợi nấm mọc mịn bao phủ côn