Phân Lập Và Tuyển Chọn Và Xác Định Môi Trường Nhân Sinh Khối Của Các Chủng Azotobacter Spp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phân lập và tuyển chọn và xác định môi trường nhân sinh

khối của các chủng Azotobacter spp trong đất trồng phục vụ

sản xuất phân bón vi sinh

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện :MAI THỊ QUỲNH TRÂN MSSV: 0851110255 Lớp: 08DSH1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Song song với sự phát triển không ngừng của các ngành công nghiệp thì nông nghiệp ở nước ta cũng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể nhờ tiến bộ của khoa học kĩ thuật, làm cho năng suất và chất lượng cây trồng tăng lên gấp nhiều lần Trong nông nghiệp, đạm được xem là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây trồng Việc cung cấp đạm cho cây trồng từ phân bón là vô cùng quan trọng nhằm đáp ứng nhu cầu sinh trưởng, phát triển của cây và phần nào bù đắp lại lượng đạm

mà cây trồng đã lấy đi từ đất qua các vụ mùa

Khi bón phân đạm vào đất, cây trồng chỉ hấp thu khoảng 40 - 50% lượng phân bón, lượng còn lại bị nước mưa, nước tưới rửa trôi, hoặc bị chuyển hóa và bốc hơi ở dạng NH3, NOx, N2 Bên cạnh đó, sự lạm dụng quá nhiều phân bón hóa học để gia tăng năng suất đã làm cho đất đai ngày càng bạc màu, độ phì nhiêu kém dần, tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt gây nên hiện tượng nước nở hoa, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và môi trường sống của con người cũng như các sinh vật khác trong tự nhiên (Shenoy và ctv, 2001; Huỳnh Thu Hòa, 2006) Vì vậy, việc gia tăng bón phân đạm hóa học chỉ là giải pháp tạm thời, không thể áp dụng lâu dài bởi chúng phát sinh nhiều mối lo ngại

Hiện nay, phân vi sinh có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với phân hóa học nhờ tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm chi phí sản suất thì phân

vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện

và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7]

Thời gian gần đây việc nghiên cứu và sử dụng phân sinh học có nguồn gốc

từ vi sinh vật, đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm nhằm tạo ra một sản phẩm sạch, giảm bớt chi phí đầu tư sản xuất trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường

hướng tới xây dựng một nền nông nghiệp bền vững Và một trong những hướng nghiên cứu đang được chú ý nhiều nhất hiện nay là sản xuất phân sinh bón vi sinh

cố định đạm có nguồn gốc từ vi sinh vật với chủng Azotobacter spp là chủng được

quan tâm nhiều nhất vì nhiều đặc điểm thuận lợi như khả năng cố định đạm tự do trong không khí, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3… làm hệ thống rễ phát triển vững chắc, hấp thu nước và chất dinh dưỡng tốt (Okon, 1985) góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [11]

Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển

chọn và xác định môi trường nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp

trong đất trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh”

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azotobacter cố định đạm cao

trong đất trồng

Xây dựng quy trình nhân sinh khối một số chủng Azotobacter có hoạt tính cố

định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây trồng

3 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học

- Xác định được một số chủng Azotobater spp có khả năng cố định đạm ứng

dụng trong sản xuất phân bón vi sinh

- Thiết lập quy trình nhân giống, nhân sinh khối

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter spp có

hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi sinh vật cố định Nitơ (N)

1.1.1 Chu trình Nitơ trong tự nhiên

Nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu đối với động vật, thực vật

và ngay cả đối với các loài vi sinh vật Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn trong không khí, nitơ chiếm 78,16% thể tích Người ta ước tính rằng, trong bầu không khí bao trùm lên một hecta đất đai chứa tới 8 triệu tấn nitơ Lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm (nếu như cây trồng có khả năng đồng hóa nó) Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 0,4 x 109 tấn nitơ Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4 x 1015 tỷ tấn nitơ

Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại vi sinh vật phân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng dễ tiêu (NH3 hoặc

NH4+), cung cấp nguồn dinh dưỡng nitơ cho cây trồng, quá trình này được gọi là quá trình amôn hóa

Tiếp nối quá trình amôn hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ NH3thành NO3- được gọi là quá trình nitrat hóa

Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ NOthành N2 để bù trả nitơ cho không khí được gọi là quá trình phản nitrat hóa

3-Dưới tác dụng của các loại vi sinh vật, nitơ không khí được chuyển vào các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được gọi là quá trình cố định nitơ phân tử

Tất cả các quá trình: cố định – phân hủy - chuyển hóa và phản nitrat hóa luôn xảy ra dưới tác dụng của các loài vi sinh vật và tạo được thế cân bằng nitơ Nhờ đó mà đã khép kín được vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

Hình 1.1 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

Hình 1.2 Tóm tắt qúa trình chuyển hóa nitơ của vi sinh vật (theo climategis.com)

Tế bào thực vật

Vi sinh vật thủy phân

Tế bào Nitơ hữu cơ

Phân hủy nội bào

Tạo sinh khối

Chất hữu cơ Carbon

NO-3

1.1.2 Các vi sinh vật cố định Nitơ phân tử

Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N2 và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định N BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240 x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con đường hóa học

Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N2 dồi dào trong khí quyển (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho cây Có 2 nhóm vi sinh vật cố định nitơ :1) nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh; 2) nhóm vi sinh sống cộng sinh

1)Nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh co một số loài điển hình sau:

 Vi khuẩn: Azotomonas insolita, Azotomonas fluorescens, Pseudomonas azotogenis,Klebsiella pneumonia,; Aerobacter aerogene, Rhodospirillum rubrum,Chromatium sp,Chlorobium sp, Rhodomicribium spp,Desulfovibrio desulfuricans; Methanobacterium spp…

 Xạ khuẩn : Một số loài thuộc giống: Actinomyces, Frankia, Nocardia,

 Actinopolyspora,…

 Tảo – Vi khuẩn lam: Plectonema, Anabaena azolla,; Anabaena

 Ambigua, Anabaena cylindrica, Calothrix elenkii

1.1.3 Quá trình cố định Nitơ phân tử

Trong suốt một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ vẫn là một bí

ẩn của tự nhiên Trong khi con người đang sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao

và tốn kém (400- 5000 C, 200-1000atm) để phá vỡ mối liên kết ba của phân tử nitơ

Phân tử N2 (có năng lượng 9,4.105J/mol) thì các vi sinh vật cố định đạm lại

có thể đồng hóa ngay trong các điều kiện bình thường về áp suất và nhiệt độ Những nghiên cứu trong những năm gần đây đã cho thấy rõ được một phần cơ chế của quá trình cố định nitơ là nhờ enzyme

Quá trình cố định nitơ là quá trình khử N2 thành NH3 nhờ enzyme nitrogenase với sự có mặt của ATP (andenozintriphotphat

N2+ AH2 + ATP -> NH3 + A + ADP + P (AH2 là chất cho e)

ADP: adenozin photphat

ATP cấu tạo thành 3 nhóm base nitro adenine, đường ribose và 3 nhóm phosphate

Bằng phương pháp sắc ký trên ICC ”120” BIP (Pháp) với cột sắc ký poropak, ta nhận được và xác định được cường độ cố định nito phân tử theo hoạt tính của nitrogenase

Sau một thời gian nghiên cứu các nhà khoa học dần hoàn thiện cơ chế cố định nito phân tử Theo cơ chế mới nhất (1992) thì quá trình cố định nitơ phân tử được chia theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con đường oxi hóa

Quá trình cố định nitơ được thể hiện bằng phương trình sau:

N2 → HN=NH → H2N - NH2 → NH3→ NH4OH

N2 + 8e- +16Mg.ATP + 8H + 16O nitrogenase, 2NH3 + 16Mg.ADP +16P + H 2O

Cơ chế của quá trình cố định nitơ này khá phức tạp và được làm sáng tỏ nhờ các công trình nghiên cứu nhiều năm gần đây (Hardy, Bun, 1968; Mortenson, 1966, 1968; Hardetal, 1970; Bulen, Lecomte, 1966; Begersen, 1969; Silop, 1971…) Nitrogenase là một phức gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (nitrogense,

MW 220000) liêm kết với 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 64000)

Fe phân tử có khối lượng phân tử khoảng 6.104

Mo-Fe protein có khối lượng phân tử khoảng 2,2.105

Mo-Fe protein chứa hai nguyên tử Mo (molipden) và 28-32 nguyên tử Fe và 25-30 nguyên tử sắt không bề với axit

Fe và Mo của protein Mo-Fe được chứa bên trong cột cofactor gọi là FeMo-co và

sự khử N2 diễn ra cofactor này

Quá trình khử:

Trước hết protein Fe được khử bởi ferredoxin sau đó liên kết với ATP làm thay đổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này ( từ 100mV- 400mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe ATP bị thủy phân khi diễn ra sự chuyển đổi electron này Cuối cùng protein Mo-Fe khử chuyển các electron tới nitrogen nguyên tử

Electron của các chất khử (ferredoxin, ditionit) đi vào trung tâm chứa Fe của thành phần II ( protein Fe) và tiếp tục chuyển thành phần enzyme (protein Mo-Fe)

Electron đã hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo, ở bên trong “hạt”,

Mo sẽ bị khử, nhờ đó có khả năng phản úng nhanh với N2.Phân tử N2 đi qua khe có kích thước khoảng 4-5 0A, tức tương đương với chiều dài phân tử N2 vào bên trong enzyme và được hoạt hóa ở đây

Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nitơ sẽ làm đứt hai dây nối trong số dây nối cực phân tử N2 năng lượng tiêu phí là 7,8.105j/mol Dây nối thứ basex bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydro đã được hoạt hóa nhờ các enzyme dihydrogenase và hệ thống hydrogenase Sau đó NH3 hoặc sản phẩm khử sinh ra sẽ liên kết axit để tạo thành axit amin

Con đường oxi hóa:

N2 → N2O → (HNO)2 → NH4OH Qua hai hướng đó người ta thu được kết quả sau:

Nếu nồng độ nitơ nhiều sẽ ức chế quá trình tạo nito phân tử Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn vi sinh vật hiếu khí.tìm thấy hợp chất loại khử khi nuôi các vi sinh vật cố định nitơ phân tử Qua đó cho ta thấy con đường khử có nhiều khả năng hơn

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử trong quá trình khử và oxi hóa N

Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất được nhà vi sinh vật Hà

Lan Beijerinckphân lập và nuôi cấy thuần khiết năm 1901

Theo Becking (1974), Azotobacter spp có 4 loài đặc trưng sau A.chroococcum

 Beijerinckii

 A.vinelandii

 A.agilis

Theo FAO (1982) Azotobacter sppcó các loài phổ biến sau :

Azotobacter spp là vi khuẩn hiếu khí nhưng có thể phát triển trong điều kiện

vi hiếu khí, Gram âm không sinh bào tử

Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo thường biểu hiện đặc tính đa hình Hình dạng tế bào và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện phát triển

Khi còn non tế bào có dạng que đầu tròn đứng riêng lẻ hay xếp thành từng đôi chồng chất, chất tế bào nhuộm màu đồng đều, sinh sản bằng cách phân cắt có khả năng di động nhờ tiên mao Kích thước: 2,0-7,0 × 10-25 µm

Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến

thành dạng hình cầu Khi già, tế bào thường được bao bọc lớp vỏ dày và tạo thàng nang xác Khi môi trường sống không thuận lợi như thay đổi nồng độ các chất dinh dưỡng hoặc bổ sung một số chất hữu cơ như ethanol, butanol-n hoặc β-hydroxybutyrate Khi gặp điều kiện thuận lợi, nang xác sẽ nứt ra và tạo thành các tế

bào mới Azotobacter spp ít hình thành nang trong môi trường lỏng

Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng nhày, đàn hồi, khá

lồi, có khi ở dạng nhăn nheo Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu nâu đen Màu sắc khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để phân loại các

loài Azotobacter

Trong đất, Azotobacter spp thường phổ biến các loài sau:

Azotobacter chrococcum (đồng danh: Az.acidum, Az.araxii, Az.nigricans, Az.galophilum, Az.unicapsulare, Az.woodswnii): Kích thước tế bào 2,0 x 3,1µm, có

khả năng tạo nang xác, có khả năng di động được, có tiêm mao Khuẩn lạc khi già

có màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, tinh bột

 Azotobacter beijerinskii : Kích thước tế bào 2,4 x 5,0µm, có khả năng tạo

nang xác, không có tiêm mao, không di động được Khi già có màu vàng hoặc màu nâu sáng Sắc tố không khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, không đồng hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri

 Azotobacter vinelandii (đồng danh: Az.smyrnii, Az.hilgardii, Az.vitreum,

Az.fluorescens): Kích thước 1,5 x 3,4µm, có khả năng tạo nang xác, có tiên

mao, có khả năng di động Sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannit, ramnose, benzoat natri

 Azotobacter agilis( đồng danh Az.agile- Azotobacter agile) : tế bào có kích

thước 2,8-3,3 µm, không tạo nang xác, có tiên mao có khả năng di động được Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường, không có khả năng đồng hóa benzoate natri, mannit, ramnose

1.2.3 Sự phân bố Azotobacter spp trong tự nhiên

Azotobacter spp chủ yếu phân bố ở trong đất và bao gồm 6 loài phổ biến

nhưng phân bố giữa các loài trong tự nhiên rất khác nhau chịu ảnh hưởng của nhiều

yếu tố Phổ biến nhất là Az Chroococum-đặc trưng trên đất đồng cỏ, một số loài phân bố trong nước ao hồ đặc trưng có Az Agilis và Az Vinelandii còn Az paspali

có thể được tìm thấy chỉ trong vùng rễ của cỏ

Ở trong đất, số lượng Azotobacter spp thường là 102- 103/ gam đất

(FAO,2007) Số lượng Azotobacter spp phân bố trong các loại đất khác nhau cũng

có sự khác nhau (Islam M Z., Sharif D I and Hossain M A, 2008) Azotobacter spp thường có ở đất trung tính hoặc kiềm, ở đất có pH <6,0 ít xuất hiện Azotobacter Đồng thời Azotobacter spp cũng rất mẫn cảm với pH, chúng có thể phát triển được

ở pH 4,5-9,0 nhưng thích hợp nhất đối với Azotobacter là 7,2-8,2 Môi trường acid rất bất lợi đối với sự phát triển và các hoạt động sống của Azotobacter và ảnh

hưởng xấu đến quá trình cố định nitơ của Azotobacter Vì vậy sự phân bố của

Azotobacter spp cũng phụ thuộc vào pH

Năm 1961, 148 mẫu đất được kiểm tra bởi Becking cho thấy tất cả các mẫu

đất có pH >7,5 đều có Azotobacter spp và trong khoảng pH 7-7,4; 6,5-6,9; 6,0-6,4 đều xuất hiện Azotobacter spp với tỷ lệ 89%, 57%, 32% pH thấp giới hạn sự phát triển của Azotobacter spp Jensen (1965) cho thấy Azotobacter spp được tìm thấy ở

PH >6,0

Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Minh Đức, Ngô Tự Thành

(2003), đã phân lập được 18 chủng Azotobacter từ 50 mẫu đất trồng , phần lớn ở

các mẫu có pH 5,15- 7,75 Các chủng thu nhận từ đất khô tồn tại tốt trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài

bảo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm lẫn với Azomonas.(một loại vi khuẩn cố định nitơ giống Azotobacter spp nhưng không hình thành bào nang)

Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như không gặp chúng ở đất chua Đối với đất chua, đặc trưng là loài Az Indicum có thể phát triển trong môi trường với pH 3 Azotobacter cần độ ẩm cao hơn so với

nhiều vi khuẩn khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô hạn[8]

Islam M Z., Sharif D I and Hossain M A.(2008) đã tiến hành phân lập

Azotobacter spp ở 7 loại đất khác nhau bao gồm đất trồng lúa, đất bỏ hoang, đồng

cỏ, đất rừng, đất mùn ở sông, đất trồng cây họ đậu, đất không trồng cây họ đậu cho

thấy số lượng Azotobacter spp ở các loại đất này là khác nhau Ngoài ra trong nghiên cứu này cũng cho thấy số lượng Azotobacter spp cũng phụ thuộc vào pH và

độ ẩm của đất ở những loại đất có độ ẩm cao không thích hợp cho sự phát triển của

Azotobacter spp

Bảng 1.1 Sự khác nhau của loại đất phân lập về pH, độ ẩm và số lượng Azotobacter

Nguồn (Islam M Z., Sharif D I and Hossain M A, 2008)

1.2.4 Hiệu quả sử dụng chế phẩm phân bón chứa Azotobacter

Azotobacter spp có tác dụng tăng cường nguồn thức ăn N cho cây trồng,

trung bình khi tiêu thụ 1g các chất sinh năng lượng Azotobacter có khả năng đồng

hóa được khoảng 10-15g N phân tử Bón rơm rạ hay phân xanh vào ruộng là cung

cấp nguồn năng lượng cho Azotobacter và hoạt động của Azotobacter sẽ làm giàu N

cho đất Các biện pháp kỹ thuật như bón vôi để trung hòa đất, bón lân tưới nước làm tươi xốp đất, phơi đất… đều làm tăng cường rõ rệt sự phát triển và cố định N của

Azotobacter trong đất

Malik et al., (1994) đã sử dụng các vi khuẩn Azotobacter, Azospirilium,

Acetobacter, Bacillus và Pseudomonas để giúp cây lúa nước phát triển tốt và gia

tăng năng suất so với đối chứng và sự tổng hợp IAA của những vi khuẩn này giúp

rễ lúa phát triển nhiều hơn để hấp thu nhiều nước và dưỡng chất hơn

Ngoài được sử dụng làm phân bón hữu cơ vi sinh thì mới đây có nghiên cứu của Markus Ribbe, một nhà nghiên cứu của Đại học California tại Mỹ (2010), cho

thấy Azotobacter vinelandii có khả năng sinh ra một loại enzyme vanadium

nitrogenase Enzyme này có thể tự động tạo ra những chuỗi phân tử carbon ngắn

gồm hai hoặc ba nguyên tử Vì thế ông khẳng định các nhà khoa học có thể tác động vào vanadium nitrogenase để enzyme này tạo ra dầu mỏ Và có thế sử dụng vi khuẩn này để chế tạo ra nhiên liệu dành cho động cơ

Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm Azotobacterin chỉ đặt ra

trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và

bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất Phần lớn các nghiên cứu

chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát chưa được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp

Sau nhiều năm nghiên cứu, thử nghiệm và áp dụng trong sản xuất rau màu ở nhiều địa phương cho kết quả tốt, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu

hoạch cho biết phân bón có chứa Azotobacter spp khi bón làm giảm từ 30 đến 50%

lượng đạm urê, làm cho đất tơi xốp Qua các mô hình thử nghiệm và thực tế sản xuất ở nhiều địa phương cho thấy phân có tác dụng làm tăng năng suất lúa, ngô và các loại rau màu, cây ăn quả từ 18 đến 35% Loại phân vi sinh này có khả năng phòng chống một số bệnh cho cây trồng như bệnh héo xanh khoai tây và các loại rau xanh; bệnh khô vằn trên ngô, lúa; giảm các loại sâu hại như sâu cuốn lá, sâu đục thân trên lúa và sâu tơ, sâu xanh trên các loại rau xanh [10]

Sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm

Azotobacter và gọi là Azotobacterin Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được

hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung thêm một ít phospho, kali…

1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn, nhân

giống và nhân sinh khối vi khuẩn Azotobacter

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Islam M Z., Sharif D I and Hossain M A.(2008) đã phân lập các chủng

Azotobacter spp từ các mẫu đất khác nhau Trong đó mẫu đất trồng cây họ đậu mật

độ tế bào (CFU) Azotobacter spp xuất hiện nhiều nhất 11.105/g đất và đất trồng lúa

xuất hiện ít Azotobacter spp nhất 3.105/g đất

Ridvan Kizilkaya (2008) đã đánh giá khả năng cố định nitơ của Azotobacter

spp trong môi trường nuôi cấy Ashby và trong các môi trường đất khác như đất

mùn, đất khô hạn, đất sét trong đó khả năng cố định của Azotobacter spp trên môi

trường Ashby trong 3 ngày nuôi cấy là từ 3,50- 29,35microgam N/ml trung bình là 10.24 cao hơn các môi trường đất khác

Đánh giá hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter spp cho đất và hạt

giống, cây con đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng qua các nghiên cứu như:

 Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của

hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối chứng [29]

 Các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy

sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-60 kg

N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể đạt

đến 240 triệu tấn/năm Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả

năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [30]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Một số đề tài công trình nghiên cứu trong nước có liên quan đến đề tài :

 Đỗ Thu Hà (2008), đã phân lập được 8 chủng Azotobacter có khả năng cố

định đạm và 2 chủng có khả năng sinh IAA từ 30 mẫu đất trồng lúa, rau và

bỏ hoang ở thôn Bình Kỳ- Hòa Qúy-Ngũ Hành Sơn-TP.Đà Nẵng Trong đó tuyển chọn 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất có thể ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh [3]

 Nguyễn Thu Hà, Vũ Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Ngô Tự Thành

(2003), đã phân lập được 18 chủng Azotobacter từ 50 mẫu đất trồng Trong

đó tuyển chọn được 3 chủng Azotobacter spp có hoạt tính ARA và tổng hợp

IAA, kích thích sự nảy mầm của hạt ngô lai DK.888 và ngô tẻ P.11[4]

 Nguyễn Thị Luyện (2011), đã phân lập được 10 chủng Azotobacter spp từ

30 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh và lúa tại huyện Long Khánh - Đồng Nai

Trong đó tuyển chọn được 4 chủng Azotobacter spp có hoạt tính có định Nito

mạnh và 2 chủng có khả năng kích thích nảy mầm tốt [8]

 Châu Ngọc Anh (2012), đã phân lập được 16 chủng Azotobacter spp từ 36

mẫu đất trồng bắp, lúa và cây ăn quả tại huyện Trảng Bom – Đồng Nai, huyện Tam Nông – Đồng Tháp và huyện Bình Minh – Vĩnh Long Trong đó

tuyển chọn được 2 chủng Azotobacter spp có hoạt tính cố định Nitơ mạnh và

có khả năng sinh IAA kích thích nảy mầm tốt [2]

 Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của

Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiệt độ thích hợp của các chủng này là 25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [5]

 Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất gò

đồi vùng Thừa Thiên - Huế Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai chủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8) Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối chứng [11]

 Thái Sơn Nam (2010) đã khái quát quy trình sản xuất các vi sinh vật có khả

năng cố định đạm trong tự nhiên như vi khuẩn cộng sinh Rhizobium, vi khuẩn Azotobacter, vi khuẩn Azospirillum [13]

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

- Phân lập và mô tả đặc điểm sinh học một số chủng Azotobacter spp

- Tuyển chọn các chủng Azotobacter spp có khả năng cố định đạm mạnh

- Đánh giá khả năng kích thích của các chủng vi khuẩn Azotobacter spp lên sự nẩy

mầm của hạt đậu đen

- Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azotobacter spp

được tuyển chọn

2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

* Vật liệu: mẫu đất lấy từ đất trồng bắp và đậu xanh và mẫu Azotobacter nhập nội

 Dao, bịch nilon 0,5kg, giấy dán, bút

 Ống nghiệm có nắp, ống nghiệm không nắp

 Đĩa pertri

 Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml

 Erlen 100ml, 250ml, 500ml,1000ml

 Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml

 Bông thấm nước, bông không thấm nước

 Bao nilon hấp, dây thun, báo, bút lông dầu

Thiết bị

 Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

 Tủ ủ (Memmert Germany)

 Tủ lạnh Toshiba

 Autolave (Huxky Đài Loan)

 Máy đo PH (Hach-Germany)

 Cân phân tích (Orbital Germany)

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm thí nghiệm: Đồ án được thực hiện tại hệ thống phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 05/2012 tới tháng 07/2012

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập các chủng Azotobacter spp ở các loại đất trồng (theo FAO,

2007)

Sau khi mẫu đất đem về phòng thí nghiệm được tách riêng ra cho vào từng đĩa nhỏ có đánh số thứ tự, tên mẫu, quan sát và ghi nhận màu sắc của các mẫu đất Sau đó đo pH các mẫu đất, ở từng loại đất trồng mỗi mẫu đất lấy 25g đất cho vào cốc thêm 50ml nước cất vào khuấy đều sau đó để lắng và dùng máy đó pH đo giá trị

pH cho từng mẫu đất (theo Islam M Z., Sharif D I and Hossain M A 2008) Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên sinh viên tiến hành gộp các mẫu đất có giá trị

pH gần bằng nhau trong cùng một loại đất trồng

Tiếp đó cho các mẫu đất ra đĩa để hong khô trong điều kiện nhiệt độ phòng rồi nghiền mịn Việc hong khô mẫu đất giúp cho việc phân lập chính xác hơn Ở từng mẫu đất đất trồng, cân 1g đất cho vào erlen chứa 50ml môi trường Ashby lỏng

đã hấp khử trùng ở 1210c, 1atm (không có agar), đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng

3 ngày trong điều kiện lắc liên tục

Sau đó tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lí 0,85%(hệ số pha loãng

10-6) Lấy 0,1ml dịch pha loãng ở lần pha loãng cuối, cấy trên môi trường phân lập

là môi trường Ashby Cấy bằng phương pháp trải đĩa trang cho đến khi khô mặt thạch hoàn toàn và đặt các đĩa cấy ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 đến 2 ngày Mỗi mẫu cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa pertri

Từ đĩa cấy ban đầu tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc rời rạc có hình dạng, màu sắc khác nhau, sau đó cấy sang đĩa pertri khác chứa môi trường Ashby bằng phương pháp cấy ria để phân lập từng chủng vi khuẩn Tiến hành phân lập cho đến khi các khuẩn lạc tạo ra có dạng đồng nhất, khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ có một dạng vi khuẩn thì lấy các khuẩn lạc rời rạc đó để trữ trong ống thạch nghiêng chứa môi trường trên Các chủng vi khuẩn thu được và trữ trong từng ống nghiệm tạm xem như một dòng, được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50c để bảo quản

Sau đó theo dõi các chỉ tiêu sau:

 Tỷ lệ số mẫu đất có xuất hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp

 Số chủng Azotobacter spp phân lập được

2.3.2 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các

chủng Azotobacter spp

Sau khi phân lập thuần khiết các chủng ta tiến hành quan sát:

Hình thái khuẩn lạc: quan sát hình thái khuẩn lạc riêng rẽ ngay sau khi mọc và sau khi già đi tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, độ lồi lõm, độ trong, diễn biến màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không , lúc non cho đến lúc già )

Phương pháp nhuộm Gram: ( Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhựt, 2008): Dùng que cấy tròn chấm một ít nước cất lên lame rồi dùng que cấy tròn chấm vào khuẩn lạc làm vết bôi, hơ lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản trên lame

 Bước 1 –Nhuộm tím crysal violet để ổn định 1 phút, rửa bằng nướccất(dùng bình tia phun ở mép vết bôi đã nhuộm không phun trực tiếp vào giữa vết có thể làm trôi mẫu ), thấm khô bằng giấy thấm

 Bước 2: Nhuộm bằng Glucol , ổn định sau 1 phút, tương tự rửa bằng nước cất

 Bước 3: Dùng etanol 960 rửa tẩy màu 30 giây, dùng giấy thấm lau khô

 Bước 4: Nhuộm bổ sung fucshin 2-3 phút, rửa lại bằng nước cất, để khô

 Bước 5: Soi kính hiển vi ở X100 Quan sát dưới kính hiển vi ghi nhận Gram của vi khuẩn Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crytal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram

âm

Khả năng di động trên thạch mềm: chuẩn bị các ống thạch bán lỏng môi trường Ashby chứa 0,5% agar, dùng que cấy thẳng cấy xuyên qua thạch, đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 đến 4 ngày rồi quan sát xung quanh vết cấy

2.3.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azotobacter spp có khả năng cố

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường Ashby đã hấp khử trùng (ở 1210c, 1atm)

mỗi ống nghiệm chứa 10ml môi trường Cấy các chủng Azotobacter.spp đã phân lập

được vào các ống nghiệm, mẫu đối chứng không cấy vi khuẩn chỉ chứa môi trường Ashby Và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 ngày Sau đó đem dịch nuôi cấy lọc bằng giấy lọc rồi cho thuốc thử Nessler (lượng thuốc thử bằng nhau ở các mẫu) vào dịch lọc Quan sát sự thay đổi màu của dịch lọc và so màu với mẫu đối chứng Mỗi mẫu lặp lại 2 lần

Định lượng N tổng trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Kjeldahl:

Chuẩn bị các erlen chứa 50ml môi trường Ashby đã hấp khử trùng( ở 1210c, 1atm),

sau đó cấy các chủng Azotobacter spp đã phân lập được vào erlen, mẫu đối chứng là

erlen không cấy vi khuẩn Sau đó lắc liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng

Sau khi lắc xong tiến hành định lượng hàm lượng NH4+ bằng phương pháp Kjeldahl: dùng pipet hút 2ml dịch nuôi cấy cho vào bình Kjeldahl thêm 0,2g xúc tác ( K2SO4: CuSO4 tỉ lệ 3:1) lắc nhẹ, đậy kín trong 3 phút Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh cho 5ml dung dịch H 2SO4 đậm đặc 98% Giai đoạn này thực hiện trong tủ hote đặt bình hơi nghiêng trên bếp tránh trường hợp khi sô mạnh hóa chất bắn ra ngoài và không bị bay mất ammoniac Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức

50ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức tới vạch Sau đó cất đạm, chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ)

Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1 N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng) đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn Bật công tắc cất đạm

Sau khi cất 10- 12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn Nếu giấy quỳ không đổi sang màu xanh là được Sau

đó đem chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng Tính kết quả hàm lượng nitơ tổng được tính theo công thức (dựa theo Nguyễn Hoài Hương, 2008):

N (mg) = (1,42 * (V1- V2)/a)

Với: V1- số ml H2SO4 cho vào bình hứng

V2- số ml NaOH 0,1 N đã chuẩn độ a- số ml nguyên liệu sử dụng

1,42 hệ số; cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg N

2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter

spp

Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azotobacter dựa trên nồng độ IAA có

trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Nồng độ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh Nồng độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm [5]

* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số

OD530nm và nồng độ IAA

- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat (200ml)

A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất;

B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất;

Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử Salkowski

- Chuẩn bị đường chuẩn IAA

Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat được nồng độ

là 160mg/l Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích

Bảng 2.1 Nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn

Biểu đồ 2.1 Phương trình đường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ số

OD530nm và nồng độ IAA (mg/ml)

Thực hiện nuôi cấy các chủng Azotobacter phân lập được trên môi trường Ashby

Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi

trường, hấp khử trùng, để nguội Tiến hành cấy các chủng Azotobacter vào các bình

tam giác chứa môi trường đã khử trùng Nuôi ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau 5 ngày thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm

15 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Azotobacter spp

lên sự nảy mầm của hạt đậu đen [8]

Chuẩn bị các erlen chứa 50ml môi trường Burk hấp khử trùng (ở 1210c,1atm), sau

đó cấy các chủng Azotobacter vào erlen rồi lắc liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ

phòng Sau 5 ngày tiến hành dùng giấy lọc lọc dịch nuôi cấy

Đậu đen tiến hành chọn những hạt khô, trơn bóng, đen đều các hạt đồng nhất, không bị sâu mọt, không bị vỡ, bị lép Đem đậu rửa sạch và đem ngâm với nước cất trong vòng 1giờ

Chuẩn bị các đĩa pertri sạch, dùng một miếng bông thấm nước lót bên dưới đĩa pertri cho 5ml dịch nuôi cấy thấm đều lên miếng bông thấm nước rồi trải đều 10 hạt đậu đen đã ngâm nước lên miếng bông thấm nước, sau đó đặt lên trên hạt một miếng bông thấm có cùng kích thước với miếng bông lót bên dưới đã thấm 3ml dịch nuôi cấy rồi đậy nắp pertri đem ủ ở nhiệt độ phòng Mẫu đối chứng được làm tương

tự nhưng không có dịch nuôi cấy vi sinh vật Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu đen ở các đĩa pertri sau 8h, 16h, 24h ủ

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các

chủng Azotobacter spp được tuyển chọn

2.3.6.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến

sinh khối của các chủng Azotobacter spp (Thực hành công nghệ lên men hướng môi trường và nông nghiệp – Ts Nguyễn Hoài Hương)

Các chủng Azotobacter spp được tuyển chọn được nhân giống trên môi trường có

thành phần như sau

Bảng 2.2 Thành phần môi trường nhân giống

Thành phần Môi trường nhân giống (g/l)

Sau thời gian nhân giống, cấy các chủng Azotobacter spp vào 4 loại môi trường

MT1, MT2, MT3 và MT Ashby để khảo sát khả năng sinh khối Sau 72h tiến hành

đo OD600 để xác định sinh khối tế bào [26] Chọn môi trường thuận lợi nhất cho

sinh trưởng của vi khuẩn Azotobacter để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo

Bảng 2.3 Thành phần môi trường 1

Thành phần Môi trường nhân giống (g/l)

 Dung dịch khoáng đa lượng

 Dung dịch khoáng vi lượng

 Nước cất

Bảng 2.6 Thành phần môi trường Ashby

Thành phần Môi trường nhân giống (g/l)

2.3.6.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến

sinh khối của các chủng Azotobacter spp

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azotobacter spp trên môi trường thuận lợi nhất chọn

ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút Sau 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h và đo OD600nm để xác định sinh khối tế bào

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình và

so sánh sự khác biệt của các nghiệm thức

Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD với sinh khối tế bào, nồng độ IAA được xử lý trên phần mềm EXCELL 2007 của Microsoft Các biểu đồ khác cũng được xử lý trên phần mềm này

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azotobacter spp trong đất trồng

Từ 10 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh, sau khi đo pH và tiến hành gộp mẫu thì phân thành 06 mẫu lớn dựa vào giá trị pH đất của các mẫu (bảng 3.1) để tiến hành phân

lập các chủng Azotobacter spp Trong đó mẫu đất trồng bắp gộp lại thành 4 mẫu, đất trồng đậu xanh 2 mẫu và 1 chủng Azotobacter nhập nội từ Thái Lan

Bảng 3.1 Đặc điểm các mẫu đất trồng dùng phân lập vi khuẩn Azotobacter

Số thứ

tự Mẫu đất Khoảng pH Màu sắc mẫu đất

Chủng

Azotobacter spp phân lập

1 A1 – Chủng Aztobacter nhập nội từ Thái Lan

Theo số liệu ở bảng 3.1 cho thấy đất trồng bắp khá đa dạng về màu sắc bao gồm màu màu xám đen, nâu đỏ Đất trồng đậu xanh chủ yếu là đất nâu đỏ

Kết quả phân lập từ 06 mẫu đất trồng bắp, đậu xanh có 5/6 mẫu đất trồng trên xuất

hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp Trong đó mẫu đất trồng B4 không thấy xuất hiện khuẩn lạc của Azotobacter spp và các mẫu còn lại đều xuất hiện 1-3 dạng

khuẩn lạc Trong 2 loại đất trồng thì đất trồng bắp xuất hiện nhiều chủng

Azotobacter spp (6 chủng) hơn so với, đất trồng đậu xanh (xuất hiện 3 chủng)

Bảng 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của 8 chủng Azotobacter spp được phân lập và chủng

Azotobacter nhập nội