0355HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHẢ HỆ VÙNG GEN NRLSU

B TR NG GIÁO D C VÀ ÀO T O IH CM TP H CHÍ MINH KHOA CƠNG NGH SINH H C BÁO CÁO KHOÁ LU N T T NGHI P H TR A TRÊN PHÂN TÍCH PH H VÙNG GEN nrLSU KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T GVHD: PGS TS LÊ HUY N ÁI THÚY ThS LAO C THU N SVTH: NGUY N TH H I NG C MSSV: 1053010498 NIÊN KHĨA: 2010-2014 Tp H Chí Minh, tháng n m 2014 L IC M N hồn thành khố lu n t t nghi p này, l i đ u tiên, em xin t lòng bi t n sơu s c đ n th y ThS Lao c Thu n, đƣ t n tình h ng d n, ch b o vƠ giúp đ em su t trình nghiên c u th c hi n đ tài Em xin chân thành g i l i c m ThS Lao c Thu n, ThS Tr Công Ngh Sinh H c, Tr ng n đ n cô PGS TS Lê Huy n Ái Thúy, ng Kim Ph ng t t c Th y, Cô khoa i H c M Tp H Chí Minh đƣ t n tình h ng d n, giúp đ truy n đ t cho em v n ki n th c quý giá su t n m h c t p t i tr ng Nh ng ki n th c, kinh nghi m ni m đam mê nghiên c u khoa h c mà em nh n đ c t quý Th y, Cô s lƠ hƠnh trang đ em v ng b c t ng lai C m n t t c b n bè phịng thí nghi m Sinh h c phân t đƣ nhi t tình giúp đ , đ ng viên nh ng lúc khó kh n th i gian th c hi n đ tài Cu i em xin g i l i c m n chơn thƠnh đ n t t c b n bè vƠ gia đình, đ c bi t cha m nh ng ng đ ng viên em v i thân yêu, nh ng ng i đƣ t o u ki n, ng h t qua nh ng khó kh n cu c s ng Em xin chân thành c m n! Bình D ng, ngƠy 22 tháng 05 n m 2014 SINH VIÊN TH C HI N Nguy n Th H i Ng c Danh m c b ng bi u B nrLSU 23 B ng 3.1 B ng đánh giá m i khu ch đ i vùng gen nrLSU n m ký sinh côn trùng 26 B ng 3.2 K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát m u n m ký sinh côn trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform 30 B ng 3.3 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol 31 B ng 3.4 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol 32 B ng h p thi t l p chu k nhi t PCR khu ch đ i vùng gen nrLSU c a m u n m ký sinh côn trùng 33 B ng 3.6 B ng hi u ch nh nucleotide t i v trí (i) đ n (vi) 35 B ng 3.7 T ng h p k t qu hi u ch nh trình t m u n m ký sinh trùng 38 B ng 3.8 K t qu chi u dài trình t tr B ng 3.9 c sau hi u ch nh 39 nrLSU 40 B [38] 41 B 59 Danh m c hình nh Hình 1.1 Cordyceps sinensis Hình 1.3 C u trúc c a rDNA .9 Hình 1.4 S đ v trí vùng domain thu c trình t nrLSU .10 Hình 3.1 K t qu ki m tra m i b ng BLAST GenBank .27 Hình 3.2 V trí m i xi LR0R đ c s p gióng c t v i trình t d li u 28 Hình 3.3 V trí m i ng c s p gióng c t v i trình t d li u 28 c LR5 đ Hình 3.4 K t qu Annhyb c p m i LR05/LR5 v i trình t gen nrLSU 29 Hình 3.5 K t qu n di s n ph m c p m i LR0R/LR5 tách chi t theo ph ng pháp phenol: chloroform 30 Hình 3.6 K t qu n di s n ph m v i c p m i LR0R/LR5 tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform b sung -mercaptoethanol .31 Hình 3.7 K t qu n di m u v i c p m i LR0R/LR5 quy trình b sung -mercaptoethanol t i u hóa nhi t đ 32 Hình 3.8 Hi u ch nh tín hi u nhi u đ u m ch xuôi c a nrLSU m u DL0015 .34 Hình 3.9 V trí sai l ch c a hai k t qu gi i trình t Hình 3.10 Hi u ch nh đ u m ch xuôi c a LSU .35 vùng gi a m ch nrLSU 36 Hình 3.11 Hi u ch nh vùng 3, vùng m ch xuôi c a gen nrLSU 36 Hình 3.12 Hi u ch nh vùng cu i m ch xuôi (5‟-3‟) c a gen LSU 37 Hình 3.13 Hi u ch nh vùng cu i m ch xuôi c a gen nrLSU 37 Hình 3.14 Hình k t qu BLAST trình t nrLSU m ch xuôi sau hi u ch nh 37 Hình 3.15 Ki m tra m c đ t ng đ ng b ng công c Dot plot .38 Hình 3.16 Cơy NJ đ c d ng v i b d li u 155 trình t c a gen nrLSU 47 Hình 3.17 Cơy ML đ c d ng v i b d li u 155 trình t c a gen nrLSU 48 Hình 3.18 Cơy MP đ c d ng v i b d li u 155 trình t c a gen nrLSU 49 Hình 3.19 Cây ph h phân t NJ c a gen nrLSU nh m đ nh danh m u n m 54 Hình 3.20 Cây ph h phân t ML c a gen nrLSU nh m đ nh danh m u n m 55 Hình 3.21 Cây ph h phân t MP c a gen nrLSU nh m đ nh danh m u n m 56 M CL C TV N CH NG T NG QUAN 1.1 N M KÝ SINH CÔN TRÙNG .2 1.1.1 c m chung thành ph n loài 1.1.2 Ti m n ng ng d ng .4 1.2 NGHIÊN C U NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI 1.2.1 c m nh n d ng vƠ đ nh danh 1.2.2 nh danh phân t 1.2.3 DNA ribosome trình t nrLSU đ nh danh phân t n m 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U TRONG N C 10 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U TRÊN TH GI I 11 1.5 PH H PHÂN T 12 1.5.1 Ph h phân t nghiên c u phát sinh loài 12 1.5.2 Nh ng b c c b n nghiên c u phát sinh ch ng loài .12 1.6 K THU T PCR VÀ GI I TRÌNH T T NG 17 1.6.1 K thu t PCR 17 1.6.2 Gi i trình t t đ ng 18 CH NG V T LI U ậ PH 2.1 TH I GIAN VÀ 2.2 V T LI U VÀ PH NG PHỄP A I M NGHIÊN C U .19 NG PHÁP NGHIểN C U 19 2.2.1 B m u n m ký sinh côn trùng 19 2.2.2 D ng c - thi t b - hoá ch t .19 2.2.3 Danh m c ph n m m s d ng 20 2.3 TI N TRÌNH NGHIÊN C U 21 2.3.1 Tách chi t DNA t ng s t h s i n m ký sinh côn trùng 22 2.3.2 Ki m tra s n ph m DNA đƣ tách chi t .22 2.3.3 PCR .23 2.3.4 i n di .23 2.3.5 Gi i trình t 23 2.3.6 Hi u ch nh trình t 24 2.3.7 So sánh v i c s d li u Genbank 25 2.3.8 Xây d ng b c s d li u DNA 25 2.3.9 Dị tìm mơ hình ti n hoá .25 2.3.10 Xây d ng phát sinh loài .25 CH NG K T QU VÀ TH O LU N 3.1 K T QU ÁNH GIÁ M I 26 3.1.1 Ki m tra c p m i v i thông s v t lý IDT 26 3.1.2 Ki m tra m i b ng BLAST NCBI .27 3.1.3 Ki m tra m i b ng s p gióng c t v i Clustal2w 28 3.1.4 K t qu Annhyb c p m i LR0R/LR5 v i trình t gen nrLSU 29 3.2 XÂY D NG QUY TRÌNH TH C NGHI M NH M KHU CH I VÙNG GEN LSU CHO CÁC M U N M KÝ SINH CÔN TRÙNG 29 3.3 K T QU HI U CH NH TRÌNH T 33 3.4 .K T QU SO SÁNH V I C S D LI U TRÊN GENBANK 40 3.5 XÂY D NG B D GEN LSU 41 LI U TRÌNH T 3.6 K T QU XÂY D NG CÂY PHÁT SINH LOÀI 46 CH NG K T LU N VÀ NGH 4.1 K T LU N 60 4.1.1 V lý thuy t 60 4.1.2 V th c nghi m 60 4.2 NGH 61 TÀI LI U THAM KH O .62 Danh m c nh ng ch vi t t t ATP : Adenosine triphosphate BLAST : Basic Local Alignment Search Tool Bp : base-pair DNA : deoxyribonucleotide triphosphate ETS : external transcribed spacer IGS : intergenic spacer ITS : internal transcribed spacer LSU : large subunit ML : maximum likelihood MP : maximum parsimony NJ : neighbor-joining Nu : nucleotide rDNA : ribosomal DNA rRNA : ribosomal RNA OTUs : operational taxanomic unit Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 TV N Cordyceps sinensis Cordyceps sinensis có ho t tính ch ng phát tri n t bào kh i u, ch ng oxi hóa kích thích s đáp ng mi n d ch c a c th , nh ch a tr đ c nhi u b nh liên quan đ n th n, huy t áp, tim m ch, mi n d ch, n i ti t t , ung th … G n đơy, nhi u nghiên c u cho th y khơng ch có Cordyceps sinensis mà nhi u loài khác chi Cordyceps chi h hƠng (Isaria, Metarcordyceps) c ng mang l i nh ng ti m n ng ng d ng cao y d Tr c c đơy, vi c đ nh danh xây d ng h th c loài n m ch y u d a phân tích hình thái gi i ph phát tri n m nh c a sinh h c phân t đƣ cho phép cơng tác đ nh danh xác h n d a vào vi c xây d ng ph h trình t có tính đ c tr ng cho chi vƠ loài n m M t trình t đ c s d ng r t ph bi n đ nh danh n m vùng trình t nrLSU (trình t DNA mã hoá ti u ph n l n ribosome), đơy lƠ vùng trình t thu c rDNA, có nhi u b n b gen, d dàng khu ch đ i b ng m i ph quát nên th ng đ c s d ng đ thi t l p m i quan h v ngu n g c c a n m Trong gi i h n c a đ tài s xây d ng quy trình h tr đ nh danh lồi n m ký sinh trùng d a phân tích vùng gen nrLSU b ng ph ng pháp sinh h c phân t k t h p v i sinh tin h c SVTH: Nguy n Th H i Ng c Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 Hình 3.19 Cây ph h phân t NJ c a gen nrLSU nh m đ nh danh m u n m SVTH: Nguy n Th H i Ng c 54 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 Hình 3.20 Cây ph h phân t ML c a gen nrLSU nh m đ nh danh m u n m SVTH: Nguy n Th H i Ng c 55 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 Hình 3.21 Cây ph h phân t MP c a gen nrLSU nh m đ nh danh m u n m SVTH: Nguy n Th H i Ng c 56 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 K t qu đ a hình h c c a ba ph h xây d ng b ng ba ph ng pháp Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likehood (ML) kh o sát vùng gen nrLSU đ u r t t ng t Các giá tr bootstrap t t c ph h đ u có ý ngh a (l n h n 50) Phân tích m t cách chi ti t, s phân nhóm c a t t c m u n m đ u r t đ ng nh t c ba ph h Neighbor Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood Chúng k t h p phân tích k t qu d a ph h phân t vùng gen nrLSU truy v n trình t t ng đ ng Genbank (NCBI) đ đ nh danh m u DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077 Chi ti t phơn tích nƠy đ hóa cho t ng tr c c th ng h p m u nh sau: M u DL006 cho k t qu phơn nhóm đ c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likehood (ML) v i Cordyceps cf takaomontana (EF468838) t ngân hàng gi ng NHJ 12623, v i giá tr bootstrap đáng tin c y (83% đ i v i NJ, 81% đ i v i ML, 73% đ i v i MP) K t qu so sánh v i Genbank NCBI ph h phân t nrLSU ng h DL006 loài r t g n Cordyceps cf takaomontana M u DL0015 cho k t qu phơn nhóm đ c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likehood (ML) v i Cordyceps pruinosa (AY184968) t ngân hàng gi ng ARSEF 5413 K t qu kh o sát Genbank (NCBI) ph h phân t nrLSU ng h DL0015 loài r t g n ho c Cordyceps pruinosa M u DL0038B cho k t qu phơn nhóm đ c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likehood (ML) v i Isaria tenuipes (DQ518774) t ngân hàng gi ng OSC 111007, v i giá tr bootstrap đáng tin c y (96% đ i v i NJ, 96% đ i v i ML, 63% đ i v i MP) K t qu so sánh v i Genbank NCBI ph h phân t nrLSU ng h DL0038B loài r t g n ho c Isaria tenuipes SVTH: Nguy n Th H i Ng c 57 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 M u DL0075 cho k t qu phơn nhóm đ c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likehood (ML) v i Cordyceps staphylinidicola (EF468836) t ngân hàng gi ng ARSEF 5718, v i giá tr bootstrap đáng tin c y (99% đ i v i NJ, 98% đ i v i ML, 99% đ i v i MP) M u DL0069, DL0077 cho k t qu phơn nhóm đ c xác l p c ba Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) Maximum Likehood (ML) v i Simplisillium sp., v i giá tr bootstrap phân nhóm đáng tin c y (94% đ i v i NJ, 93% đ i v i ML, 79% đ i v i MP) K t qu so sánh v i Genbank NCBI ph h phân t nrLSU ng h DL0069, DL0077 loài r t g n Simplisillium sp SVTH: Nguy n Th H i Ng c 58 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 B ng 3.11 Gen M u Genbank nrLSU DL006 Cordyceps cf takaomontana Cordyceps cf takaomontana Cordyceps cf takaomontana Cordyceps cf takaomontana Cordyceps cf takaomontana DL0015 Cordyceps pruinosa Cordyceps pruinosa Cordyceps pruinosa Cordyceps pruinosa Cordyceps pruinosa DL0038B Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes Isaria tenuipes DL0069 Simplicillium chinense Simplicillium sp Simplicillium sp Simplicillium sp Simplicillium sp DL0075 Beauveria bassiana Cordyceps staphylinidicola Cordyceps staphylinidicola Cordyceps staphylinidicola Cordyceps staphylinidicola DL0077 Simplicillium chinense Simplicillium sp Simplicillium sp Simplicillium sp Simplicillium sp SVTH: Nguy n Th H i Ng c 59 CH NG K T LU N VÀ NGH Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 4.1 K T LU N 4.1.1 V lý thuy t Chúng đƣ xơy d ng đ c c s lý lu n cho vi c h tr đ nh danh lồi n m ký sinh trùng g m b c kh o sát in silico đ đánh giá h m i, thu th p xây d ng c s d li u c c b c a vùng gen m c tiêu nrLSU Xây d ng quy trình th c nghi m nh m thu đ c vùng gen m c tiêu, gi i trình t hi u ch nh trình t đ xu t nh ng trình t xác nh t Xây d ng thành công ph h phân t d a 155 trình t tham kh o t Sung c ng s Xây d ng ph h phân t đ nh danh m u n m ký sinh côn trùng v i ph ng pháp: Neighbor Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood 4.1.2 V th c nghi m Xây d ng đ c ph ng pháp tách chi t h tr đ nh danh lồi n m ký sinh trùng v i th t nh sau: Chúng đƣ xơy d ng thành cơng quy trình th c nghi m tách chi t DNA t h s i n m b ng ph ng pháp phenol-chloroform có b sung -mercaptoethanol Xây d ng thƠnh cơng quy trình PCR đ khu ch đ i vùng gen m c tiêu nrLSU Gi i trình t hi u ch nh đ c trình t c a m u n m ký sinh côn trùng DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077 v i c p m i khu ch đ i nrLSU xu t đ c nh ng trình t xác Xây d ng thành cơng ph h phân t nh m đ nh danh m u n m DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077, cơy ph h phân t NJ, ML, MP c a gen nrLSU đ u ng h DL006 loài r t g n v i Cordyceps cf takaomontana, DL0015 loài r t g n ho c Cordyceps pruinosa, DL0038B lồi r t g n v i Isaria tenuipes, m u DL0075 loài r t g n ho c Cordyceps staphylinidicola, m u DL0069, DL0077 loài r t g n v i Simplicillium sp SVTH: Nguy n Th H i Ng c 60 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 4.2 NGH N u có th i gian, chúng tơi mong mu n ti p t c ti n hành tách chi t, khu ch đ i, gi i trình t , xây d ng ph h phân t đ nh danh thêm m u n m ký sinh trùng cịn l i b s u t p m u n m t i phịng thí nghi m K t h p k t qu xây d ng ph h phân t d a vào nh ng vùng gen nrLSU k t qu t d li u đ nh danh hình thái nh m h tr đ nh danh m t s lồi n m ký sinh trùng th c nghi m SVTH: Nguy n Th H i Ng c 61 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 TÀI LI U THAM KH O TI NG VI T [1] Duy Ban, L u Tham M u, 2009, “ ông Trùng H Th o D h tr u tr b nh virus, ung th , HIV/AIDS, đái tháo đ c li u quý ng, suy gi m tình d c nghiên c u phát hi n loài đông trùng h th o m i Vi t Nam” Nhà xu t b n Y h c HƠ N i 103 tr [2] Lê T n H ng, Võ Th H nh, Lê Th Bích Ph Tr ng, Tr n Th nh Phong, ng Th H ng Vơn, Somsak Sivichai (2010), ắN m côn trùng t i v n qu c gia Cát Tiên: Ngu n tƠi nguyên quý cho ng d ng sinh h cẰ, H i ngh Khoa h c k ni m 35 n m Vi n Khoa h c Công ngh Vi t Nam-Hà N i, tr 1-10 [3] Nguy n D ng Khuê (2005), ắS d ng n m Metarhizium anisopliae Sorok Phòng tr m i nhƠ (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo ph ng pháp lơy nhi mẰ, H i ngh côn trùng h c toƠn qu c l n th 5, HƠ N i, tr 409-414 [4] Nguy n Th L c, Võ Th Bích Chi, Nguy n Th NhƠn, Ph m Quang H ng, Hu nh V n Nghi p, V Ti n Khang vƠ Nguy n c ThƠnh (2002), ắNghiên c u, s n xu t vƠ ng d ng hai ch ph m sinh h c đ qu n lý loƠi sơu h i lúaẰ, Vi n lúa BSCL, tr 274-295 [5] Ph m Quang Thu (2009), ắ i u tra phát hi n n m Nh ng trùng h th o Cordyceps nutans pat phơn b khu b o t n thiên nhiên Tơy Yên T - S n ng - B c GiangẰ, T p trí nông nghi p phát tri n nông thôn, s - tháng 4/2009 [6] Ph m Quang Thu (2009), ắPhát hi n n m đông trùng h th o Cordyceps gunnii (Berk.) t i v n qu c gia Tam o, t nh V nh PhúcẰ, T p chí Nông nghi p Phát tri n Nông thôn, 135, tr 96-99 [7] Ph m Quang Thu (2013), ắ ông trùng h th o vƠ nghiên c u nuôi tr ng th qu Vi n Khoa H c Lơm Nghi p Vi t NamẰ, H i th o qu c t Khoa h c công ngh ph c v s n xu t nông nghi p công ngh cao t nh Lơm [8] ng Ph m Th Thùy (2010), ắNghiên c u phát tri n ngu n n m Beauveria vƠ SVTH: Nguy n Th H i Ng c 62 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 Metarhizum đ ng d ng phòng tr sơu h i cơy tr ng, cơy r ng vƠ phát tri n n m Cordyceps lƠm th c ph m ch c n ng cho ng iẰ, Báo cáo t i H i th o Qu c gia b nh h i th c v t Vi t Nam, NhƠ xu t b n Nông nghi p, 224 -231 [9] Tr n V n Hai, Tr nh Th Xuơn, Ph m Kim S n (2006), ắT o sinh kh i vƠ th nghi m hi u l c c a m t s lo i n m ký sinh sơu n t p vƠ r y m m h i rau c i t i TP C n Th Ằ, T p chí nghiên c u khoa h c, tr [10] ng HCT Tr nh Tam Ki t (2001), ắDanh l c loƠi th c v t Vi t Nam (ph n N m)Ằ, NhƠ xu t b n Nông nghi p, HƠ N i [11] Võ Th Thu Oanh, Lê ình ơn, Bùi Cách Tuy n (2007), ắ c m sinh h c vƠ kh n ng gơy b nh c a n m Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đ i v i sơu khoang (Spodoptera litura F.) h i rau c i xanh (Brassica juncea L.)Ằ, T p chí KHKT Nơng Lâm nghi p, s 1&2, i h c Nông Lơm Tp HCM, 58-63 TI NG ANH [12] Bok J W., Lermer L., Chilton J., Klingeman H.G., Tower G.H N (1999), ắAntitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensisẰ Phytochemistry, 51(7), pp 891-898 13] Dentinger B T M., McLaughlin D J., (2006), ắReconstructing the Clavariaceae using nuclear large subunit rDNA sequences and a new genus segregated from ClavariaẰ, Mycologia, 98(5):746ậ762 [14] Dowell K (2008), ắMolecular phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationshipẰ, Math 500, 1-16 [15] Fell J W., Boekhout T., Fonseca A., Scorzetti G., Statzell-Tallman A (2000), ắBiodiversity and systematics of Basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysisẰ, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, 1351-1371 [16] Felsenstein J (1985), ắConfidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrapẰ, Evolution, 39(4), 783-791 SVTH: Nguy n Th H i Ng c 63 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 [17] Gue-ho E., Improvisi L., Christen R., Hoog G S (1993), ắPhylogenetic relationships of Cryptococcus neoformans and some related Basidiomycetous yeasts determined from partial large subunit rRNA sequencesẰ, Antonie van Leeuwenhoek, 63, 175-189 [18] Hall B.G (2001), ắPhylogenetic trees made easy: A how-to manual for molecular biologistsẰ, Sinauer Association Inc 179 tr [19] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), ắToiypocladium injatum is the anamorph of Cordyceps subsessilisẰ, Mycologia, 88(5), 715-719 [20] Holliday J C., Cleaver P., Loomis-Powers M., Patel D., (2004), ắAnalysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc (Ascomycetes)Ằ, International Journal of Medicinal Mushrooms, 6, 151-164 [21] Holliday J., Cleaver M (2008), ắMedicinal value of the Caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A Review”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 10 (3), 219-234 [22] Jeewon R., Liew E.C.Y., Hyde K.D., (2003), ắMolecular systematics of the Amphisphaeriaceae based on cladistics analyses of partial LSU rDNA gene sequencesẰ, Mycol Res, 107 (12), 1392-1402 [23] Josep Guarro, Josepa Gené, and Alberto M Stchigel (1999), ắDevelopments in fungal taxonomyẰ, Clinical Microbiology Reviews, 454-500 [24] Kiho T., Kobayashi T., Morimoto H (2000), ắStructural features of an antidiabetic polysaccharide (TAP) from Tremella aurantiaẰ, Chem Pharm Bull (Tokyo), 48, 1793-1795 [25] Kobayasi Y (1982), ắKeys to the taxa of the genera Cordyceps and TorrubiellaẰ, Transactions of the Mycological Society of Japan, 23, 329-364 [26] Kurtzman C.P., Robnett C J (1998), ắIdentification and phylogeny of ascomycetous yests from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequencesẰ, Antonie Van Keeuwenhoek, 73, 331-371 SVTH: Nguy n Th H i Ng c 64 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 [27] Lee J S., Lim M O., (2006), ắIdentification of medicinal mushroom species based on nuclear large subunit rDNA sequencesẰ, The Journal of Microbiology, 44(1), 29-34 [28] Lemey P., Salemi M., Vandamme A M (2009), ắThe phylogenetic handbook: A practical approach to phylogenetic analysis and hypothesis testing, Cambridge University Press, 709 tr [29] Lo Hui-Chen., Hsieh C., (2013), ắA systematic review of the mysterious Caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-Chong XiaCao and related bioactive ingredientsẰ, J Tradit Complement Med, (1): 16-32 [30] Liu Y J., Whelen S., Hall B D (1999), ắPhylogenetic Relationships Among Ascomycetes: Evidence from an RNA Polymerse II SubunitẰ, Molecular Biology and Evolution, 16 (2), 1799-1808 [31] McCoy C W (1990), ắEntomogenous fungi as microbial pesticidesẰ, tr 139159 [32] Pagel M., (1999), ắInferring the historical patterns of biological evolutionẰ Nature, 401, 877-884 [33] Rehner S.A., Samuels G.J., (1995), ắMolecular systematics of the Hypocreales: a teleomorph gene phylogeny and the status of their anamorphsẰ Can J Bot, 73: 816-823 [34] Sonnenberg R., Nolte A.W., Tautz D (2007), ắAn evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identificationẰ, Frontiers in Zoology, tr 4-6 [35] Spatafora J W., Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., White J F Jr (2007), ắPhylogenetic evidence for an animal pathogen origin for ergot and the grass endophytesẰ, Molecular Ecology 16: 1701-1711 [36] Siev M., Weinberg R., Penman S., (1969), ắThe selective interruption of nucleolar rna synthesis in HELA cells by cordycepinẰ The Journal of Cell Biology, 41 (2), 510- 526 SVTH: Nguy n Th H i Ng c 65 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 [37] Sun Y J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H X., Chen C., Zhang C.K (2003), ắNucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different partsẰ, Yao Xue Xue Bao, 38(9), 690-694 [38] Sung G H., Hywel-Jones N L., Sung J M., Luangsa-ard J J., Shrestha B., Spatafora J W (2007), ắPhylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungiẰ, Studies in Mycology, 57(1), 5-59 [39] Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., Spatafora J W (2007), ắA multigene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approachẰ, Molecular Phylogenetics and Evolution [40] Taborsky V (1992), ắSmall-scale processing of microbial pestcidesẰ FAO Agric 90 tr [41] Vilgalys R., Hester M (1990), ắRapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus speciesẰ, Journal of Bacteriology, 172, 4239-4246 [42] Wang S Y., Shiao M S (2000), ắPharmacological Functions of Chinese Medicinal fungus Cordyceps sinensis and related speciesẰ, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4), 248-257 [43] Wasser S P (2002), ắMedicinal mushrooms as a source of anti-tumor and immunomodulating polysaccharidesẰ, Appl Microbiol Biotechnol, 60, 258274 [44] Wenger R M (1984), ắSynthesis of cyclosporine Total syntheses of ằcyclosporin A‟ and ằcyclosporin H‟, two fungal metabolites isolated from the species Tolypocladium inflatum GAMSẰ, HCA, 67, 502-525 [45] Wong Y Y., Moon A., (2010), ắCordycepin inhibits protein synthesis and cell adhesion through effects on signal transductionẰ, Journal of Biological Chemistry, 285, 2610-2621 [46] Zhou J., Tang K (2009), ắCordyceps fungi: natural products, pharmacological SVTH: Nguy n Th H i Ng c 66 Khoá lu n t t nghi p n m h c 2013-2014 functions and developmental productsẰ, Journnal of Pharmacy and Pharmacology, 61, 279-291 WEBSITE [47] http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm [48] http://cordyceps.us/pages/systematics [59] http://medicinalmushroominfo.com [50] http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/Protocols_Folder/Primers/Primers.htm [51] http://www.icp.ucl.ac.be/~opperd/private/bootstrap.html SVTH: Nguy n Th H i Ng c 67