D a trên phân tích k t qu Annhyb, nhóm chúng tơi th y đ c v trí b t c p
c a m i xuôi LR0R, m i ng c LR5 trên trình t gen nrLSU c a Cordyceps militaris
v i kích th c s n ph m khu ch đ i kho ng 928 bp phù h p v i chi u dài s n ph m
khu ch đ i 954 bp mà Sung và c ng s đƣ nghiên c u tr c đó [39]. Do đó, chúng tơi
ti n hành s d ng c p m i LR0R/LR5 cho các th c nghi m ti p theo.
XỂY D NG QUY TRỊNH TH C NGHI M NH M KHU CH I VỐNG
3.2.
GEN LSU CHO CỄC M U N M Kụ SINH CƠN TRÙNG
Chúng tơi ti n hành th c nghi m tách chi t DNA t h s i c a 3 m u n m ký sinh côn trùng ký hi u là DL0038, DL0067, DL0075 do H i Sinh H c Tp.HCM cung
c p. Quy trình tách chi t phenol:chloroform đ c kh o sát đ u tiên. D i đơy lƠ k t
k t qu đo m t đ quang OD vƠ đi n di c a 3 m u DL0038B, DL0067, DL0075 sau
SVTH: Nguy n Th H i Ng c 30
B ng 3.2. K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát trên 3 m u n m ký
sinh côn trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform. M u Không b sung -mercaptoethanol
A260 A260/280 C (µg/ml) DL0038B 0,261 1,3751 13,0612
DL0067 0,122 1,0703 6,1084
DL0075 0,117 1,2030 5,8506
Theo b ng trên hi u qu tách chi t theo quy trình phenol:chloroform ch a t t,
các m u còn l n protein do t s OD 260/280 th p h n 1,8 vƠ n ng đ DNA khá th p.
Hình 3.5. K t qu đi n di s n ph m c p m i LR0R/LR5 tách chi t theo ph ng
pháp phenol: chloroform.
Trong hình 3.5 ch có m u DL0075 cho k t qu khu ch đ i vùng gen nrLSU.
Các m u DL0038B, DL0067 không xu t hi n b ng s n ph m nƠo. i u này ch ng t
hi u qu tách chi t DNA ch a t t. Vì Cordyceps là chi n m có thành t bào dày v i
c u t o g m kitin và m t s polysaccharide gơy khó kh n cho vi c tách chi t DNA. Do
v y, đ t i u hố quy trình tách chi t DNA chúng tôi ti n hành th c nghi m v i quy
trình tách chi t DNA b ng phenol : chloroform có b sung -mercaptoethanol.
-mercaptoethanol là m t ch t hóa h c CH2-OH-CH2-CS giúp kh c u n i didulfide
SVTH: Nguy n Th H i Ng c 31
l ng l o, k t h p v i SDS và proteinase K trong dung d ch ly gi i s lƠm t ng hi u qu
tách chi t DNA. K t qu này s đ c th hi n qua k t qu đo OD (b ng 3.3) vƠ đi n di
(hình 3.6)
B ng 3.3. K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph các m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol. có b sung -mercaptoethanol. M u B sung -mercaptoethanol A260 A260/280 C (µg/ml) DL0038B 0,028 1,6347 1,3940 DL0067 0,066 1,5935 3,2862 DL0075 0,029 1,9832 1,4675
T t c các giá tr OD260/280 c a ph ng pháp tách chi t b ng
phenol:chloroform có b sung -mercaptoethanol đ u cao h n ph ng pháp không b
sung -mercaptoethanol, ch ng t quy trình tách chi t có b sung beta-
mercaptoethanol có hi u qu tách chi t DNA cao h n. NgoƠi ra, khi so sánh v n ng
đ thì b sung -mercaptoethanol l i cho n ng đ th p h n. Vì khi th c hi n l y m u
thí nghi m 1 (khơng b sung -mercaptoethanol) là l y khu n ty và c ph n gel, còn
đ i v i l n hai (b sung -mercaptoethanol) là ch l y ph n khu n ty bên trên.
Hình 3.6. K t qu đi n di s n ph m v i c p m i LR0R/LR5 tách chi t theo
SVTH: Nguy n Th H i Ng c 32
K t qu đi n di cho th y l ng DNA đ c khu ch đ i nhi u h n. M u 75 cho
v ch sáng vƠ rõ h n. NgoƠi ra, k t qu cịn có thêm v ch s n ph m m u DL0038B. Tuy nhiên, trong quy trình có b sung -mercaptoethanol này v n còn m u DL0067 ch a khu ch đ i thành công ph n ng PCR. Do v y chúng tôi ti p t c ti n hành t i
u chu trình PCR nh m khu ch đ i vùng gen nrLSU c a các m u n m này.
Trong quá trình t i u nhi t đ chu trình PCR, chúng tơi ti n hành th c nghi m
trên 7 m u DL006, DL0015, DL0075, DL0038B, DL0067, DL0069, DL0077. D i
đơy lƠ k t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang vƠ đi n di 7 m u n m này v i thi t đ t nhi t đ b t c p c a m i trong PCR là 55oC.
B ng 3.4. K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k các m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol. tách chi t có b sung -mercaptoethanol.
M u A260 260/280 N ng đ (µg/ml) DL006 0,017 1,3509 0,828 DL0015 0,023 1,0388 1,1519 DL0075 0,029 1,9832 1,4675 DL0038B 0,028 1,6347 1,3940 DL0067 0,066 1,5935 3,2862 DL0069 0,018 1,6250 0,0950 DL0077 0.033 1,4547 1,6748
Hình 3.7. K t qu đi n di 7 m u v i c p m i LR0R/LR5 trong quy trình b sung -mercaptoethanol và t i u hóa nhi t đ .
SVTH: Nguy n Th H i Ng c 33 Qua t s OD (b ng 3.4), m t l n n a ta th y quy trình tách chi t DNA có b sung -mercaptoethanol giúp thu đ c DNA có đ tinh s ch cao h n. ng th i, trong
hình t đ t c p c a m i LR0R/LR5 là 55oC trong ph n
u h t các m u đ u cho s n ph m đúng kích th c nrLSU
kho ng 950 bp theo Sung et al., 2007 [39
y, chúng tôi đƣ t i u hố quy trình th c nghi m đ khu ch đ i DNA cho m u n m ký sinh côn
trùng (s d ng ph ng pháp phenol: chloroform có b sung -mercaptoethanol và t i
u hóa nhi t đ PCR).
B ng 3.5 ng h p thi t l p chu k nhi t PCR khu ch đ i các vùng gen nrLSU c a các m u n m ký sinh côn trùng
Giai đo n Bi n tính Bi n tính M i b t
c p Kéo dài
Kéo dài cu i cùng Nhi t đ (oC) 95 95 X=55oC 72 72
Th i gian 5 phút 30 giây 30 giây 2 phút 5 phút
Chu k 1 35 1
Sau khi t i u hố quy trình tách chi t DNA và quy trình PCR chúng tôi ti n
hành th c nghi m khu ch đ i vùng gen m c tiêu nrLSU c a 6 m u n m ký sinh côn
trùng DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077, sau đó g i gi i trình t
các m u n m này t i công ty Nam Khoa.
K T QU HI U CH NH TRỊNH T
3.3.
M c dù nh ng c i ti n v m t k thu t và thu t toán nh m c i thi n đ chính
xác trong vi c đ c các base c a máy đang đ c nghiên c u tích c c, tuy nhiên t l sai
sót v n có th x y ra và khó có th đ c chính xác tuy t đ i b ng ph ng pháp t đ ng.
Khi m t base b đ c sai có th d n đ n nhi u sai l m nghiêm tr ng trong vi c phân tích
SVTH: Nguy n Th H i Ng c 34
tr c ti p th c hi n nh m kh c ph c t i đa vi c xác đ
nrLSU
nrLSU