Xây dựng mô hình đánh giá sự kích thích tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc thần kinh của một số dược liệu việt nam

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Nghiên cứu thu nhận các phân đoạn dịch chiết của cây dược thảo ứng viên (Sâm Ngọc Linh, Nấm Linh Chi đỏ và Rau đắng biển)

thảo ứng viên (Sâm Ngọc Linh, Nấm Linh Chi đỏ và Rau đắng biển)

Thu thập dữ liệu và nghiên cứu các loại thảo dược trong và ngoài nước liên quan đến đề tài, bao gồm cả bài thuốc dân gian Tiến hành thu nhận và xử lý mẫu dược thảo nhằm phục vụ cho việc tách chiết dịch thô và dược liệu.

- Thu nhận cao chiết thô và các phân đoạn dược liệu ứng viên

2.1 1 Quy trình chi ế t Sâm Ng ọ c Linh a Nguyên tắc:

Chiết xuất được thực hiện bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 96%, áp dụng phương pháp chiết lỏng lỏng để thu được các cao phân đoạn theo phương pháp Namba Quy trình chiết xuất này đảm bảo hiệu quả tối ưu trong việc tách biệt các thành phần hoạt chất.

Sơ đồ 2 1 Quy trình chiết cao Sâm Ngọc Linh

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

CAO$CỒN$TỔNG$SÂM$NGỌC$LINH$$

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

CAO$PHÂN$ĐOẠN$ETHER$ETHYLIC$$

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

Cân 0,6kg dược liệu và làm ẩm với 600ml cồn 96%, sau đó cho vào bình ngấm kiệt Tiếp theo, từ từ thêm khoảng 2 lít cồn 96% vào bình, mở khóa phía dưới cho đến khi khoảng 100ml dịch chiết chảy ra, rồi đóng khóa lại Đảm bảo rằng dịch cồn luôn cách mặt dược liệu khoảng 10cm, sau đó đậy kín và để yên trong 24 giờ.

+ Sau 24 giờ, rút dịch chiết từ từ , tốc độ khoảng 23ml/1phút , chiết cho đến khi thu được khoảng 9 lít dịch chiết cồn 96 %

+ Tập trung dịch chiết cồn 96 %, cô thu hồi cồn ở máy cô chân không thành cao toàn phần 200 (g) đặt tên là CAO CỒN TỔNG SÂM NGỌC LINH

Để tạo ra cao phân đoạn ether ethylic Sâm Ngọc Linh, bạn cần hòa 180g cao Sâm Ngọc Linh với 1,8 lít nước, sau đó lắc với ether ethylic cho đến khi dịch chiết ether ethylic không còn màu Tiếp theo, tập trung dịch chiết này và cô quay chân không để thu được 20g cao ether ethylic.

Dịch nước Sâm Ngọc Linh được lắc với n-butanol cho đến khi không còn màu, sau đó dịch chiết n-butanol được cô quay chân không để thu được cao n-butanol, với khối lượng 120g, và được đặt tên là CAO PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL SÂM NGỌC LINH.

+ Dịch nước Sâm Ngọc Linh cô đến cắn thành cao nước (40g) đặt tên CAO PHÂN ĐOẠN NƯỚC SÂM NGỌC LINH

2.1 2 Quy trình chi ế t Rau đắ ng bi ể n a Nguyên tắc:

+ Chiết theo phương pháp ngấm kiệt, dung môi là ethanol 96 %

+ Chiết theo phương pháp chiết lỏng lỏng để thu được các cao phân đoạn (Phương pháp Namba) b Quy trình chiết xuất:

Hình 2 1 Quy trình chiết cao Rau đắng

+ Cân 1,2 kg dược liệu, làm ẩm với 1200 ml cồn 96 %, cho vào bình ngấm kiệt

Để thực hiện quá trình ngâm dược liệu, bạn cần thêm từ từ khoảng 4 lít cồn 96% vào bình Mở khóa dưới bình cho đến khi có khoảng 100 ml dịch chiết chảy ra, sau đó đóng khóa lại Đảm bảo rằng dịch cồn luôn cách mặt dược liệu khoảng 10 cm, sau đó đậy kín và để yên trong 24 giờ.

+ Sau 24 giờ, rút dịch chiết từ từ, tốc độ khoảng 23 ml/1phút, chiết cho đến khi thu được khoảng 18 lít dịch chiết cồn 96 %

+ Tập trung dịch chiết cồn 96 %, cô thu hồi cồn ở máy cô chân không thành cao toàn phần 210(g) đặt tên là CAO CỒN TỔNG RAU ĐẮNG

Để tạo ra cao phân đoạn ether, hòa 180g cao rau đắng với 1,8 lít nước và lắc với ether ethylic cho đến khi dịch chiết ether ethylic không còn màu Sau đó, tập trung dịch chiết này và cô quay chân không để thu được 80g cao ether ethylic.

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

CAO$CỒN$TỔNG$RAU$ĐẮNG$$$

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

CAO$PHÂN$ĐOẠN$ETHER$ETHYLIC$$

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

Cô!thu!hổi!dung!môi!!

Dịch nước rau đắng được lắc liên tục với n-butanol cho đến khi dịch chiết n-butanol mất màu Sau đó, dịch chiết n-butanol được cô quay chân không để thu được cao n-butanol, với khối lượng 40g, được đặt tên là CAO PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL RAU ĐẮNG.

Dịch nước rau đắng cô đến cắn thành cao nước (60g) đặt tên CAO PHÂN ĐOẠN NƯỚC RAU ĐẮNG

2.1 3 Quy trình chi ế t N ấ m Linh chi

Ngâm dược liệu Linh chi trong ethanol 80% để thu được dịch chiết, sau đó cô quay dịch chiết để tạo ra cao đặc Tiếp theo, phân tán cao toàn phần bằng lượng nước phù hợp và chiết xuất với cloroform cho đến khi không còn vết trên bản mỏng, cuối cùng thu được dịch chiết và cô đặc lại thành cao đặc.

Hình 2 2 Quy trình chiết cao Linh chi toàn phần

Hình 2 3 Quy trình chiết cao cloroform Linh chi

Cao!Linh!Chi!toàn! phần!

Cao!Linh!Chi! toàn!phần! toàn!phần!

Cao!Linh!chi!phân!tán! trong!nước!

2.1 4 X ử l ý m ẫ u b ằ ng k ỹ thu ậ t chi ế t pha r ắ n (SPE)

Mục đích của việc sử dụng cột SPE là loại bỏ tạp chất và làm giàu các triterpenoid thông qua quá trình rửa giải, đồng thời bảo vệ cột HPLC trong quá trình phân tích Điều kiện xử lý mẫu bằng kỹ thuật SPE rất quan trọng để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc tách chiết và phân tích các hợp chất này.

- Tên thương mại: Varian Bond Elut C18

- Dung tích cột 3 mL, lượng Silica-gel nhồi trong cột là 500 mg

- Mẫu: Lượng mẫu nạp vào cột khoảng 30 mg

- Dung môi sử dụng: MeOH, H2O

Tiến hành: Thăm dò thể tích dung môi để loại tạp và rửa giải triterpenoid

2.1 5 Ph ươ ng pháp HPLC đị nh l ượ ng ganoderic acid A

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác 1mg acid ganoderic A và cho vào bình định mức 2 mL Sau đó, hòa tan trong MeOH, siêu âm và thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều rồi lọc qua màng lọc 0,45µm Cuối cùng, pha loãng để có dung dịch chuẩn đối chiếu với nồng độ mong muốn.

Dung dịch thử: Cao triterpenoid được xử lý bằng kỹ thuật SPE trước khi bơm vào hệ thống HPLC Điều kiện sắc ký

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-10AD Shimadzu (Nhật Bản)

- Cột Shiseido 150 x 4,6 mm, kớch thước hạt 5 àm

- Pha động acetonitril-nước (29:71) + 3 giọt acid phosphoric

- Phát hiện bằng UV 254nm

- Tốc độ dòng 0,76 ml/phút

- Thể tớch tiờm mẫu 20àl

- Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng

2.1 6 Ph ươ ng pháp s ắ c kí l ớ p m ỏ ng Điều kiện sắc kí:

- Hệ dung môi khai triển :

# Chloroform : methanol : nước (65:35:10, lớp dưới)

- Thể tớch chấm: 10 àl cỏc dung dịch thử và 2 àl cỏc dung dịch chuẩn

- Phát hiện: Phun thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol 96%, sấy ở 105 0 C đến khi xuất hiện vết và quan sát dưới ánh sáng thường

• Cao tổng cồn 96%: Cân 0,2g cao tổng hòa với 10ml cồn 96%, siêu âm nóng cho tan hết cắn Dịch chiết được dùng làm dung dịch chấm sắc kí

• Cao ether ethylic: Cân 0,5g cao ether ethylic hòa với 20ml cồn 96%, siêu âm nóng 10 phút, lọc Dịch lọc được dùng làm dung dịch chấm sắc kí

• Cao n-butanol: Cân 0,5g cao n-butanol hòa với 20ml cồn 96%, siêu âm nóng 10 phút, lọc Dịch lọc được dùng làm dung dịch chấm sắc kí

• Cao nước: Cân 0,5g cao nước hòa với 20ml cồn 96%, siêu âm nóng

10 phút, lọc Dịch lọc được dùng làm dung dịch chấm sắc kí

# Chuẩn M-R2: Hòa 1mg chuẩn M-R2 vào 10 ml ethanol 96%

# Chuẩn G-Rg1: Hòa 1mg chuẩn G-Rg1 vào 10 ml ethanol 96%

# Chuẩn G-Rb1: Hòa 1mg chuẩn G-Rb1 vào 10 ml ethanol 96%

# Chuẩn G-Rd: Hòa 1mg chuẩn G-Rd vào 10 ml ethanol 96%.

Nội dung 2: Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh

Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não chuột

Giải đông và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh người (dòng tế bào thương mại) là bước quan trọng để đánh giá khả năng tăng sinh và tính gốc của tế bào trước khi tiến hành các thí nghiệm cảm ứng dược liệu Việc đánh giá này được thực hiện thông qua khả năng tự làm mới, các marker bề mặt, và khả năng biệt hóa thành các loại tế bào chức năng.

2.2.1 Phương pháp thu nhận não thai chuột

(1) Thực hiện thao tác giết chuột mang thai (khoảng 14 ngày tuổi) bằng cách kéo giãn đốt sống cổ

(2) Mở màng bụng bằng kéo và kẹp, xác định hai nhánh tử cung chuột

(3) Cắt hai nhánh tử cung và chuyển vào hai falcon 15ml có chứa PBSA 10X, chuyển sang tủ vô trùng chuyên dùng nuôi cấy tế bào

(4) Dùng kẹp chuyển các thai chuột sang dĩa petri

(5) Tách các lớp nhau thai và màng ối bằng kéo và kẹp, chuyển các chuột thai sang becher mới

(6) Rửa các thai chuột bằng PBSA 5X

(7) Chuyển các thai sang dĩa petri mới, dùng kéo và kẹp tách phần đầu ra khỏi cơ thể chuột

(8) Chuyển phần đầu thai chuột sang petri mới và rửa với PBSA 1X

(9) Dùng kéo và kẹp bóc phần vỏ não chuột để thu nhận toàn mô não chuột

Quy trình phân lập tế bào đơn từ não thai bao gồm các bước sau: (a) thực hiện thao tác giết chuột bằng cách kéo giãn cột sống; (b) thu nhận hai nhánh tử cung của chuột; (c) thu nhận chuột thai; (d) tách mô từ não chuột; (e) lọc để thu nhận tế bào đơn; và (f) ly tâm dung dịch chứa tế bào đơn.

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột

(1) Dùng kéo nhỏ cắt nhuyễn mảnh mô

(2) Hút toàn bộ mô não chuột thu nhận vào falcon 15ml

(3) Rửa becher bằng 1ml PBS rồi chuyển vào falcon ở trên

(4) Huyền phù mạnh dung dịch trong falcon bằng pipet Pasteur

(5) Lọc dịch huyền phự tế bào bằng màng lọc 70àm

(6) Hút huyền phù chứa tế bào vào ống ly tâm 15 ml

(7) Ly tâm với tốc độ 2500 rpm (500g) trong 5 phút

(8) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(9) Tái huyền phù cặn tế bào nhẹ nhàng với 2 ml SFM

(10) Hút toàn bộ dịch tế bào chuyển vào bình Roux 25cm 2 có tráng gel agarose

(11) Đặt bình nuôi trong tủ nuôi ở 37 o C, 5% CO2

2.2.3 Ph ươ ng pháp c ấ y chuy ề n t ế bào g ố c th ầ n kinh

Cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào để chúng tiếp tục tăng sinh và phát triển hiệu quả

(1) Hút toàn bộ môi trường trong bình Roux vào ống falcon 15ml

(2) Hút rửa bề mặt Roux bằng PBS và chuyển dịch rửa vào falcon trên

(3) Ly tâm 5 phút với tốc độ 2000 RPM

(4) Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(5) Tái huyền phù nhẹ nhàng cặn tế bào trong 2 – 3 ml môi trường

(6) Chia đều huyền phù tế bào sang bình Roux mới

(8) Thay môi trường sau 3 – 4 ngày nuôi cấy

2.2.4 Ph ươ ng pháp gi ả i đ ông, ho ạ t hóa t ă ng sinh t ế bào th ầ n kinh ng ườ i (mua t ừ Lonza)

1 Lấy tế bào từ nitơ lỏng và cho vào bể ổn nhiệt 37 0 C ngay lập tức, ngăn ngừa sự hình thành các tinh thể

2 Nhanh chóng làm tan dịch tế bào trong ống đông lạnh bằng cách đảo đều vial trong bể ổn nhiệt 37 0 C và chuyển vào tủ cấy khi hạt tinh thể đá cuối cùng tan ra, trung bình đưới 2 phút Không nên dìm ống đông lạnh hoàn toàn trong nước Không được để tan tế bào quá 2 phút

3 Khi đã rã đông, chuyển ngay tế bào vào tube 50 ml vô trùng và cẩn thận bổ sung 4 ml môi trường SFM đã làm ấm (từng giọt, trung bình 1 giọt/giây) và đồng thời đảo đều tube

4 Bổ sung 5 ml môi trường SFM đã làm ấm vào 1 tube khác

5 Để loại bỏ chất bảo quản, ly tâm tube ở 200g, 4 phút và hút bỏ dịch nổi

6 Tái huyền phù tế bào trong 2 ml môi trường SFM

7 Xác định tế bào sống bằng cách nhuộm đếm với Trypan Blue Số lượng tế bào sống phải trên 1x10 6 tế bào

8 Chuyển dịch huyền phù tế bào vào đĩa nuôi cấy với mật độ (1,0x10 5 tế bào/cm 2 )

9 Chuyển đĩa nuôi vào tủ nuôi 37 0 C, 5% CO2 để tế bào bám dính sau 24 giờ

10 Qua ngày kế tiếp, thay môi trường mới cho tế bào

11 Từ ngày 4 đến ngày 7, khi tế bào đã tăng sinh đạt mật độ khoảng 90%, có thể cấy truyền đến thế hệ cần thiết

2.2.5 Ph ươ ng pháp đ ánh giá kh ả n ă ng t ự làm m ớ i c ủ a t ế bào g ố c ứ ng viên

Dựa trên khả năng tự làm mới của tế bào gốc thần kinh, phương pháp đánh giá hình thành neurosphere của các tế bào ứng viên được thực hiện trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh.

(1) Chọn bình Roux có chất lượng neurosphere tốt

(2) Hút môi trường chứa neurosphere sang falcon 15ml

(3) Ly tâm ở tốc độ 2000 RPM trong 5 phút

(4) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(5) Thêm vào falcon 0,5ml dung dịch Trypsin/EDTA

(6) Ủ falcon trong bể ổn nhiệt ở 37 o C, trong 3 phút

(7) Thêm vào falcon 1 ml Trypsin Inhibitor, huyền phù nhẹ nhàng dịch tế bào

(8) Ly tâm với tốc độ 2500 rpm

(9) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(10) Tái huyền phù cặn tế bào với 4 ml môi trường nuôi cấy

(11) Thu 100àl dịch huyền phự, xỏc định mật độ tế bào trong dung dịch

(12) Chuyển huyền phù tế bào sang đĩa nuôi tế bào 35mm với mật độ 5x10 3 tế bào/ giếng

(13) Quan sỏt đỏnh giỏ sự hỡnh thành sphere mới cú kớch thước từ 50-100 àm

2.2.6 Ph ươ ng pháp ch ứ ng minh t ế bào ứ ng viên có bi ể u hi ệ n marker chuyên bi ệ t c ủ a t ế bào g ố c th ầ n kinh

Marker chuyên biệt được sử dụng trong nghiên cứu tế bào gốc thần kinh là nestin, một biểu hiện chủ yếu trong các quần thể tế bào gốc hoặc tiền thân của hệ thần kinh trung ương Tế bào ứng viên được nhuộm bằng kháng thể anti-nestin gắn rhodamine và Hoechst 33342 theo quy trình của Santa Cruz Biotechnology, Inc, Hoa Kỳ, và được quan sát dưới dạng neurosphere.

(1) Thu nhận neurosphere vào ống ly tâm 15 ml

(2) Bổ sung 1 ml dung dịch BSA 1% vào ống falcon có chứa neurosphere

(3) Ủ falcon trên máy lắc trong 10 phút

(4) Bổ sung 2 ml PBS rửa tế bào

(5) Bổ sung 100 àl dung dịch chạy Flow, bổ sung 900 àl PBS Tỏi huyền phù tế bào nhẹ nhàng

(6) Lắc nhẹ trong 30 phút trên máy lắc ở nhiệt độ phòng

(7) Bổ sung 2 ml PBS rửa tế bào

(8) Ly tâm dịch tế bào với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút

(9) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(10) Bổ sung 1ml dung dịch làm thấm dung dịch chạy Flow vào ống ly tâm

(11) Vortex nhẹ và lắc trên máy lắc trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

(12) Ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút

(13) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(14) Bổ sung kháng thể FITC-anti-nestin và Hoechst 33342 theo hướng dẫn của nhà sản xuất Vortex trong vài phút

(15) Lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, bọc giấy bạc tránh ánh sáng

(16) Bổ sung 2 ml PBS rửa tế bào Tiến hành rửa 2 lần

(17) Ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút

(18) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(19) Phân tích bằng máy Facs Calibur

2.2.7 Ph ươ ng pháp ch ứ ng minh t ế bào ứ ng viên có bi ể u hi ệ n các gene chuyên bi ệ t c ủ a t ế bào g ố c th ầ n kinh

Tách chiết RNA (Theo quy trình của easy-BLUE Total RNA Extraction Kit, Cat No

(1) Ly tâm thu nhận neurosphere cho trong eppendorf 2 ml

(2) Cho 1ml Easy-BLUE vào epp, vortex mạnh trong 1 phút, ủ ở 4 o C trong

(3) Thờm vào 550 àl chloroform và vortex, ủ ở 4 o C trong 30 phỳt

(4) Ly tõm 13000 vũng/phỳt 4 o C 15p Thu 500 àl lớp dung dịch ở trờn cho vào 1 epp 1,5ml mới

(5) Thêm isopropanol lạnh vào epp với tỉ lệ 1:1 và đảo 2-3 lần Ủ ở -20 o C trong 40 phút

(6) Ly tâm 13000 vòng/phút 4 o C 30 phút Đổ bỏ dịch nổi thu tủa

(7) Cho vào ống ly tâm 1 ml Ethanol 70 %, đảo 2-3 lần

(8) Ly tâm 13000 vòng/phút 4 o C 15 phút Bỏ dịch nổi, thu tủa

(10) Cho vào epp đó khụ 20 àl nước cất 2 lần

QRT-PCR (Brilliant II Ultra-Fast SYBR Green)

(1) Cho các thành phần sau vào eppendort QRT-PCR: o DTT 0,2 àl o RNase block 1 àl o Mồi 1 àl o RNA 1 àl o Mix Brilliant 7,5 àl o H2O 4,5 àl

(2) Đặt phản ứng theo chu trình nhiệt:

- PCR 40 chu kì: o 95 o C 15 giây o 57 o C 30 giây o 72 o C 30 giây

(4) Cách tính biểu hiện gene theo công thức Livak 2^-ΔΔCt ΔCt (gen) = Ct (gen) – Ct (gadph) ΔΔCt = ΔCt (gen nhóm thí nghiệm) - ΔCt (gen nhóm đối chứng)

2.2.8 Ph ươ ng pháp ch ứ ng minh t ế bào ứ ng viên có kh ả n ă ng bi ệ t hóa thành t ế bào astrocyte

Biệt hóa tế bào ứng viên thành tế bào astrocyte

Tế bào gốc thần kinh được nuôi trong môi trường không huyết thanh đặc biệt nhằm ngăn chặn sự biệt hóa của tế bào Đề tài này sử dụng phương pháp biệt hóa không định hướng thông qua việc bổ sung huyết thanh bò (FBS) vào môi trường nuôi cấy.

(1) Hút môi trường từ bình Roux chứa neurosphere có chất lượng tốt vào ống ly tâm 15 ml

(2) Sử dụng mircopipet 100 àl huyền phự nhẹ nhàng dịch tế bào để thu huyền phù tế bào đơn

(3) Ly tâm dịch tế bào với tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút

(4) Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

(5) Thêm 2 ml môi trường biệt hóa vào ống ly tâm, huyền phù nhẹ nhàng tạo thành dung dịch tế bào đơn

(6) Chuyển dịch tế bào vào bình Roux có phủ Poly-L-Lysine

(7) Quan sát hình thái tế bào sau 7-10 ngày nuôi cấy

Nhuộm tế bào bằng marker GFAP:

Sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường biệt hóa, chúng được nhuộm hóa miễn dịch bằng kháng thể anti-GFAP gắn rhodamine và Hoechst 33342 Quy trình nhuộm được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ Kit.

(1) Loại bỏ toàn bộ môi trường trong bình Roux

(2) Tráng đều bề mặt Roux bằng PBS để rửa tế bào

(3) Bổ sung 1 ml dung dịch BSA 1% vào bình Roux

(5) Tráng đều bề mặt Roux bằng PBS để rửa tế bào

(6) Bổ sung 100 àl dung dịch chạy Flow 10X, bổ sung thờm 900 àl PBS, tráng đều bề mặt bình Roux

(7) Ủ bình Roux trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc

(8) Tráng đều bề mặt Roux 2 lần bằng 2 ml PBS để rửa sạch dung dịch cố định FCM

(9) Bổ sung kháng thể anti-GFAP có gắn rhodamine và Hoechst 33342 theo hướng dẫn của nhà sản xuất Vortex vài phút

(10) Ủ 30 phút trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, bọc giấy bạc tránh ánh sáng

(11) Tráng đều bề mặt Roux bằng 2 ml PBS để rửa bề mặt

(12) Quan sát tế bào dưới kinh hiển vi huỳnh quang đảo ngược.

Nội dung 3: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu lên khả năng tăng sinh của tế bào gốc thần kinh in vitro

khả năng tăng sinh của tế bào gốc thần kinh in vitro

Tác động kích thích tăng sinh được đánh giá qua sự thay đổi số lượng tế bào, tốc độ tăng sinh và chu kỳ tế bào khi so sánh giữa việc bổ sung dược liệu và không bổ sung (đối chứng âm), cũng như khi bổ sung nhân tố tăng trưởng thần kinh NGF.

Nghiên cứu này so sánh tác động của các dược liệu với nồng độ khác nhau và một số chất kích thích tăng trưởng đối với tế bào gốc thần kinh in vitro Kết quả sẽ cung cấp thông tin quý giá về hiệu quả của các dược liệu và chất kích thích trong việc phát triển và duy trì tế bào gốc thần kinh.

Để đánh giá khả năng tăng sinh, các phương pháp như đo kích thước neurosphere, chu kỳ tế bào, và phân tích biểu hiện gen liên quan đến chu kỳ tế bào bằng q-RT-PCR được áp dụng Đồng thời, việc đo đường cong tăng trưởng tế bào thực thời cũng được thực hiện Những thí nghiệm này nhằm đánh giá hiệu quả tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu.

Thí nghiệm 1 đã tiến hành khảo sát tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau trên dòng tế bào gốc chuột, với NGF (nhân tố phát triển thần kinh) được sử dụng làm chất đối chứng dương Kết quả của nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng kích thích tăng sinh của các dược liệu trong môi trường tế bào gốc.

Thí nghiệm 2 được thực hiện nhằm khảo sát tác động kích thích tăng sinh của các dược liệu khác nhau trên dòng tế bào gốc người, với các nồng độ khác nhau Trong thí nghiệm này, NGF (nhân tố phát triển thần kinh) được sử dụng làm chất đối chứng dương để so sánh hiệu quả của các dược liệu Kết quả của thí nghiệm sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng kích thích tăng sinh của các dược liệu đối với tế bào gốc người.

2.3.1 Đ ánh giá d ự a trên kích th ướ c neurosphere

Mỗi phân đoạn cao chiết được thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, với mỗi nghiệm thức được lặp lại 10 lần Chứng âm được sử dụng là môi trường nuôi cấy không có bổ sung dịch chiết.

(1) Cho vào các giếng môi trường nuôi cấy NCS có bổ sung các chất như sơ đồ bố trí thí nghiệm

(2) Chuyển cỏc sphere cú kớch thước tương đồng từ 100-200 àm vào cỏc giếng

(3) Đo kích thước neurosphere bằng phần mềm Axio Converter 1 lần /ngày vào giờ cố định, liên tiếp trong 5-7 ngày

(4) Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel, tính độ lệch chuẩn bằng hàm STDEV (vùng số liệu)

2.3.2 Ph ươ ng pháp đ ánh giá chu kì t ế bào

1 Tế bào gốc thần kinh sau được cảm ứng bằng các cao chiết dược liệu, được tiến hành thu nhận bằng Trypsin-EDTA 0,25% và được cố định trong ethanol lạnh 70%, trữ ở 4 o C và xử lý với 1mg/ml RNAse trong 30 phút ở

2 DNA được đỏnh dấu bằng 20àg/ml PI trong tối 30 phỳt ở 4 o C và hàm lượng DNA được đánh giá bằng flow cytometry Calibur sử dụng phần mềm CellQuest Pro

3 Thí nghiệm phân tích được lập lại ba lần

2.3.3 Ph ươ ng pháp đ ánh giá s ự bi ể u hi ệ n các gen liên quan đế n chu kì t ế bào b ằ ng q-RT-PCR (theo ph ươ ng pháp 2.2.7)

Bảng 2 1 Trình t ự m ồ i s ử d ụ ng đ ánh giá gen liên quan đế n chu trình t ế bào

Tên gen Trình tự ki67 [34] Forward: GCAGGAAGCAACAGATGAGAAGCC

Reverse: GCTCAGGTGATACATGCCTCCTGC cycA [51] Forward: GTTTCCCCAATGCTGGTTGA

Reverse: AACCAAAATCCGTTGCTTCCT cycD [17] Forward: CCAGAGGCGGATGAGAACAA

Reverse: ATGGAGGGTGGGTTGGAAAT cycC [54] Forward: CAGGACATGGGCCAGGAA

2.3.4 Ph ươ ng pháp đ o đườ ng cong t ă ng tr ưở ng t ế bào th ự c th ờ i (H ệ th ố ng xCelligence)

Phương pháp xCelligence, được phát triển bởi Roche và ACE Biosciences, cho phép ghi nhận sự tăng sinh tế bào theo thời gian thực Thí nghiệm sử dụng đĩa 96 giếng đặc biệt (E-plate) với các vi điện cực bằng vàng ở đáy, thay vì đĩa 96 giếng thông thường Khi số lượng tế bào bám dính vào đáy giếng tăng lên, trở kháng của điện cực cũng sẽ tăng theo Ngoài số lượng tế bào, các yếu tố như sự tương tác di động và hình thái tế bào cũng ảnh hưởng đến giá trị trở kháng.

Trở kháng điện cực phản ánh chỉ số tế bào (Cell Index - CI), cho thấy tình trạng sinh học của tế bào, bao gồm hình thái, số lượng tế bào sống và tế bào bám dính Chỉ số tế bào (CI) là một tham số có thể biến động tùy thuộc vào tình trạng của tế bào.

$ Khi không có tế bào, hoặc tế bào không bám dính vào điện cực ở đáy, chỉ số

Chỉ số CI bằng 0 cho thấy rằng trong cùng điều kiện sinh lý, số lượng tế bào bám càng nhiều thì chỉ số CI sẽ càng cao Hơn nữa, sự thay đổi về trạng thái tế bào, bao gồm hình thái, mức độ bám dính và sức sống, sẽ ảnh hưởng đến chỉ số CI.

Hệ thống này nổi bật với khả năng ghi nhận số liệu thực thời chính xác từng phút, giúp theo dõi sự tăng sinh tế bào và tác động của các yếu tố lên tế bào mà không cần can thiệp trực tiếp, khác biệt so với các phương pháp truyền thống như MTT, XTT, BrdU.

Quy trình thí nghiệm và thử cao chiết

1 Tách tế bào gốc thần kinh người và xác định mật độ tế bào

• Hút bỏ toàn bộ môi trường trong roux

• Thêm vào 2 ml Tryple và ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 2 phút

• Bất hoạt Tryple bằng môi trường nuôi

• Thu toàn bộ dịch nổi và ly tâm thu cặn tế bào

• Huyền phù tế bào trong 2 ml môi trường hNSC Complete

• Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu và Trypan Blue

2 Bố trí thí nghiệm và nuôi ổn định tế bào

• Phủ dĩa vàng với CellStart trong 2 giờ ở 37 o C, 5 % CO2

• Hút bỏ dung dịch CellStart khỏi dĩa nuôi

• Thờm vào 50 àl mụi trường hNSC Complete

• Chạy Step 1 lấy số liệu Blank của dĩa

• Pha loãng huyền phù tế bào sao cho đạt được 10x10 3 tế bào/ml

• Thờm vào mỗi giếng 100 àl huyền phự tế bào

• Ly tâm nhẹ trong 2 phút

• Đặt dĩa lên máy và để ổn định trong 1 giờ

• Bắt đầu các step khảo sát tăng trường tế bào

3 Khảo sát tác động dược chất đến sự tăng trường của tế bào

• Tế bào nuôi ổn định trong 24 giờ

• Hỳt bỏ ẵ mụi trường trong giếng

• Thờm vào ẵ mụi trường mới với nồng độ 2X với nồng độ khảo sỏt theo như bảng sau

• Tiếp tục thay môi trường sau mỗi 24 giờ Cho đến khi kết thúc khảo sát.

Nội dung 4: Đánh giá tác động kích thích biệt hóa của các dược liệu lên khả năng biệt hóa của tế bào gốc thần kinh in vitro

khả năng biệt hóa của tế bào gốc thần kinh in vitro

Tế bào gốc thần kinh có khả năng biệt hóa thành tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm Quá trình biệt hóa này được theo dõi và đánh giá thông qua việc xác định sự biểu hiện của các marker chuyên biệt cho từng loại tế bào, sử dụng các phương pháp như RT-PCR, realtime RT-PCR ở mức phiên mã và flow cytometry, hóa miễn dịch tế bào huỳnh quang ở mức dịch mã.

" Cảm ứng biệt hóa tế bào gốc thần kinh bằng các dược liệu khác nhau ở các nồng độ khảo sát khác nhau

" Đánh giá tế bào đã biệt hóa bằng các phương pháp: flow cytometry, RT-

Để đánh giá tác động kích thích biệt hóa của các dược liệu, chúng tôi thực hiện thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các dược liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau trên dòng tế bào gốc chuột bằng phương pháp PCR và hóa miễn dịch tế bào huỳnh quang.

+ Thí nghiệm 4: Khảo sát tác động kích thích sự biệt hóa của các dược liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau trên dòng tế bào gốc người

2.4.1 Ph ươ ng pháp đ ánh giá các gen liên quan đế n quá trình bi ệ t hoá b ằ ng q-RTPCR (theo ph ươ ng pháp 2.2.7)

Bảng 2 2 Trình t ự m ồ i s ử d ụ ng đ ánh giá gen bi ệ t hoá

Tên gen Trình tự map-2 Forward: GGCACTCCTCCAAGCTACTCT

Reverse: AGGCGGTTATATTAAGAAGC sox2 [11] Forward: AAGGGTTCTTGCTGGGTTTT

2.4.2 Ph ươ ng đ ánh giá s ự bi ể u hi ệ n marker bi ệ t hoá b ằ ng flow cytometry

Tế bào gốc thần kinh, sau quá trình cảm ứng biệt hóa, sẽ thể hiện các dấu ấn (marker) đặc trưng của tế bào thần kinh, khác biệt hoàn toàn so với tế bào gốc thần kinh trước khi trải qua quá trình này.

1 Tế bào nuôi cấy được thu nhận bằng TrypLE Express (Invitrogen/Gibco)

2 Lọc tế bào qua màng lọc 35-àm (mesh; BD Biosciences) để thu nhận tế bào đơn (10 6 tế bào/ml)

3 Nhuộm tế bào với các kháng thể đặc trưng cho tế bào sau biệt hóa: GFAP, MAP2 trong khoảng 20 phút Rửa tế bào bằng dung dịch PBS

4 Huyền phù tế bào trong PBS chứa 20mM D-glucose và 2% FBS

5 Tiến hành phân tích tế bào bằng máy Facs Calibus, sử dụng phần mềm Cell Quest pro để phân tích kết quả

2.4.3 Ph ươ ng pháp nhu ộ m hoá mi ễ n d ị ch t ế bào

1 Loại bỏ môi trường cũ và rửa nhẹ nhàng tế bào một lần với D-PBS, tránh không làm thất thoát tế bào

2 Cố định tế bào với paraformaldehyde Fixing Solution 4% sạch (PFA) ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

3 Rửa với D-PBS 3X chứa Ca 2+ và Mg 2+

4 Kiểm tra hình dạng tế bào sau khi cố định

5 Tiếp tục nhuộm và định rõ lớp phía dưới Bảo quản mẫu nhuộm khoảng 3 đến 4 tuần trong D-PBD ở 4 0 C trước khi nhuộm Không để cho mẫu bị khô

1 Ủ ấm tế bào trong 30 đến 60 phút trong chất đệm ức chế (5% huyết thanh của kháng thể vật chủ thứ yếu, 1% BSA, 0,1% Triton-X trong D-PBS chứa

2 Loại bỏ chất đệm ức chế và ủ ấm tế bào qua đêm ở 4 0 C với kháng thể sơ cấp được pha loãng trong 5% huyết thanh Đảm bảo bề mặt tế bào được phủ kín với dung dịch kháng thể

3 Rửa tế bào 3 lần với D-PBS chứa Ca 2+ và Mg 2+

4 Ủ ấm tế bào với kháng thể thứ cấp có đánh dấu huỳnh quang (5% huyết thanh trong D-PBS chứa Ca 2+ và Mg 2+ ) trong tối ở 37 0 C từ 30 đến 45 phút

5 Rửa tế bào 3 lần với D-PBS chứa Ca 2+ và Mg 2+ và trong lần rửa cuối, đếm tế bào nhuộm với dung dịch DAPI (3 ng/ml) trong 5 phút và rửa lại bằng D- PBS

6 Quan sát kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang

Nội dung 5: Đánh giá tác động kích thích tăng sinh, biệt hóa của các dược liệu lên tế bào gốc thần kinh in vivo trên mô hình chuột bệnh Parkinson và chuột bình thường

dược liệu lên tế bào gốc thần kinh in vivo trên mô hình chuột bệnh

Parkinson và chuột bình thường

Nghiên cứu tạo mô hình chuột bệnh Parkinson Để tạo mô hình chuột bệnh Parkinson, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau:

- Khảo sát liều MPTP cấp tính: 10 mg/kg, 14 mg/kg, 16 mg/kg và 18 mg/kg tiêm tối đa 4 liều, mỗi liều cách quãng 2 giờ trong 1 ngày

Khảo sát liều MPTP cận cấp tính được thực hiện với liều 15 mg/kg/ngày trong 8 ngày nhằm đánh giá tác động của các dược liệu trên chuột Chúng tôi đã lựa chọn những dược liệu có kết quả thử nghiệm in vitro tốt nhất để tiến hành các nghiệm thức tiếp theo.

- Nghiệm thức ĐC 1: Cho uống dung dịch muối sinh lí cho chuột bình thường

- Nghiệm thức ĐC 2: Cho uống dung dịch muối sinh lí cho chuột bệnh

- Nghiệm thức 7: Tiêm/cho uống các dược liệu ở các nồng độ khác nhau vào chuột bình thường

- Nghiệm thức 8: Tiêm/cho uống các dược liệu ở các nồng độ khác nhau vào chuột bệnh Parkinson

Tác động dược liệu được đánh giá trên nhiều cấp độ:

- Cấp độ cơ thể: sự thay đổi biểu hiện sinh lý, sinh lý bệnh chuột

- Cấp độ mô: sự hình thành và thay đổi cấu trúc mô não ở vùng chất đen so với chuột đối chứng

- Cấp độ tế bào: số lượng tế bào tại vùng chất đen so với chuột đối chứng, số lượng tế bào hoại tử/apoptosis so với đối chứng

- Cấp độ phân tử: sự thay đổi biểu hiện gene th so với chuột đối chứng

2.5.1 Quy trình tiêm MPTP cho chu ộ t

Chuột Swiss albino đực, khoảng 8 tuần tuổi và nặng từ 20-25gr, đã được nuôi dưỡng ổn định trong vòng 1 tuần Chuột được tiêm MPTP dưới da vùng cổ, với mỗi liều tiêm không vượt quá 10% thể tích máu của chuột.

2.5.2 Ph ươ ng pháp đế m t ế bào b ằ ng công c ụ ITCN c ủ a ph ầ n m ề m Image J

v 70 2.5.3 Phương pháp đánh giá biểu hiện gene th sử dụng RT-PCR (theo phương pháp) 71

Image J là phần mềm phân tích hình ảnh miễn phí do Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ phát triển, cung cấp nhiều công cụ xử lý hình ảnh, trong đó có ITCN (Công cụ đếm nhân tế bào dựa trên hình ảnh) ITCN yêu cầu người dùng thiết lập các thông số ngưỡng cho cường độ màu sắc, độ rộng nhân và khoảng cách tối thiểu giữa các tế bào dưới dạng điểm ảnh, giúp đếm số lượng tế bào trong ảnh qua tập hợp các điểm màu sắc.

Sử dụng công cụ có sẵn trong phần mềm để đo đường kính trung bình của tế bào dưới dạng pixel Lặp lại quy trình này trên nhiều hình ảnh khác nhau với cùng một độ phóng đại để tính toán đường kính trung bình Để thiết lập khoảng cách tối thiểu giữa các tế bào, bạn có thể tham khảo khuyến cáo của chương trình, với khoảng cách này bằng độ rộng chia cho 2.

Sử dụng đường kính trung bình của tế bào đã được xác định để nhập vào phần mềm phân tích Điều chỉnh thông số threshold dựa trên cường độ màu sắc trong ảnh cho đến khi chương trình cung cấp kết quả chính xác nhất.

2.5.3 Ph ươ ng pháp đ ánh giá bi ể u hi ệ n gene th s ử d ụ ng RT-PCR (theo ph ươ ng pháp)

Bảng 2 3 Trình tự mồi sử dụng đánh giá gene th và gadph

2.5.4 Ph ươ ng pháp đ ánh giá hóa mô mi ễ n d ị ch [1, 4, 25, 26]

Ph ươ ng pháp thu nh ậ n m ẫ u:

Quá trình chuẩn bị mô đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính nguyên vẹn của cấu trúc mô và tính kháng nguyên của đối tượng nghiên cứu Để đảm bảo mẫu mô không bị nhiễm máu, cần thu thập trong tình trạng sạch sẽ, và phương pháp truyền dịch tràn có thể được áp dụng cho động vật thí nghiệm Sau khi rửa sạch máu, mô cần được cố định để bảo vệ các kháng nguyên, vì các protein hòa tan có thể làm cản trở quá trình này Dung dịch formaldehyde 4% pha trong PBSA thường được sử dụng cho việc cố định, nhờ vào khả năng liên kết chéo các protein và giữ cho cấu trúc tế bào không bị phân hủy.

Chuột được gây mê sâu bằng hỗn hợp ketamine và xylazine Sau 10 phút, kiểm tra phản xạ bằng cách kẹp nhẹ chi sau; nếu chuột không còn phản xạ, có thể tiến hành bước tiếp theo.

Mở lồng ngực chuột bằng kéo và cẩn thận cắt bỏ các mô liên kết xung quanh tim Sử dụng mũi kéo, tạo một lỗ ngay bên dưới tâm thất trái và tương tự, tạo một lỗ ngay bên trên tâm nhĩ phải.

Truyền khoảng 200 ml dung dịch PBSA qua lỗ ở tâm thất sẽ giúp đẩy máu ra khỏi hệ tuần hoàn và ra ngoài qua tâm nhĩ trái Quá trình này sẽ làm cho màu đỏ ở phổi và gan do máu tạo ra dần dần nhạt đi.

Khi dung dịch chảy ra từ cơ thể chuột trở nên trong suốt, tiến hành truyền dung dịch paraformaldehyde 4% trong vòng 10 phút Sau khi truyền, cơ thể chuột sẽ cứng lại do tác dụng của paraformaldehyde, có thể kiểm tra độ cứng bằng cách sờ vào các chi của chuột.

Sau khi ngưng truyền dịch, cần để cơ thể chuột yên tĩnh trong 30 phút để paraformaldehyde thẩm thấu vào tất cả các mô Tiếp theo, sử dụng kéo để cắt đầu chuột và tách lấy não.

Ngâm não chuột trong dung dịch sucrose 30% và bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 24-48 giờ cho đến khi não chìm hẳn xuống đáy Khi đó, mẫu não đã sẵn sàng để tiến hành cắt lát mô lạnh.

Hình 2 5 Các bước phẫu thuật để thực hiện phương pháp truyền dịch tràn Thực hiện theo thứ tự a-b-c-d-e

Ph ươ ng pháp nhu ộ m kháng th ể :

Phương pháp hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) dựa trên kiến thức về giải phẫu học, miễn dịch và phản ứng sinh hóa để phân biệt cấu trúc mô thông qua tương tác giữa kháng thể gắn chỉ thị và kháng nguyên trong mô Chất chỉ thị có thể là cơ chất hiện màu hoặc phát huỳnh quang Có hai phương pháp nhuộm: trực tiếp với một loại kháng thể hoặc sử dụng kháng thể thứ cấp để khuếch đại tín hiệu Phương pháp hai kháng thể không chỉ tăng cường tín hiệu mà còn tiết kiệm chi phí, vì kháng thể sơ cấp chỉ phù hợp với đối tượng cụ thể Quy trình nhuộm mô miễn dịch được chia thành hai bước chính: chuẩn bị mô và nhuộm mô.

Mẫu mô sau khi cố định có thể được cắt lát để quan sát cấu trúc quan tâm Các lát cắt này sẽ được xử lý để khóa các vị trí không đặc hiệu, nhằm hạn chế sự nhiễu nền do kháng thể bám vào các vị trí không mong muốn Đối với phương pháp gián tiếp, huyết thanh cùng loài với kháng thể thứ cấp thường được sử dụng để giảm thiểu nhiễu nền Tùy thuộc vào việc kháng nguyên được biểu hiện bên ngoài hay bên trong tế bào, mẫu mô có thể cần xử lý đục lỗ màng tế bào, thường bằng chất tẩy như Triton X-100 Cuối cùng, mẫu mô đã chuẩn bị sẽ được ủ với các loại kháng thể đã chuẩn bị trước.

Alexa Fluor® 488, được cung cấp bởi công ty Life Technologies, là một chất nhuộm phát huỳnh quang màu xanh sáng khi được kích thích bởi laser có bước sóng 488 nm Huỳnh quang phát ra từ chất nhuộm này có thể dễ dàng quan sát dưới kính lọc FITC.

488 được dung hợp với kháng thể thứ cấp Anti-Rabit sản xuất từ dê bắt vùng Fc trên kháng thể sơ cấp được sản xuất trên thỏ

Sau khi ủ mẫu với kháng thể thứ cấp, bước cuối cùng là thực hiện nhuộm chồng để tạo sự tương phản, làm rõ cấu trúc cần quan sát Chất nhuộm sử dụng có thể là tín hiệu màu quan sát được qua kính hiển vi quang học hoặc phát huỳnh quang.

Quy trình thu nhận lát cắt mô não chuột và nhuộm hóa mô miễn dịch nhằm quan sát tế bào tiết dopamine trong vùng SNpc được thực hiện theo hướng dẫn của atlas não chuột từ Allen Brain Atlas.

- Mô não được cắt lát lạnh ở -25 o C

- Lát mô được rửa với TBST 2 lần, mỗi lần 2 phút

- Lát cắt mô được cố định và làm khô trên lame với acetone -20 o C trong vòng 5 phút

- Đục lỗ màng tế bào trờn lỏt mụ với 200 àl dung dịch Triton X-100 0.25 % trong

- Rửa lát mô với TBST 2 lần, mỗi lần 2 phút

- Ủ lỏt mụ với 200àl Blocking Buffer Serum trong 30 phỳt

- Hút bỏ Blocking Buffer Serum, lau sạch mép ngoài của lame Ủ lame với kháng thể sơ cấp Anti-mouse tyrosine hydroxylase sản xuất từ thỏ pha loãng 1:100 ở 4 oC trong 24h

- Sau khi ủ, rửa sạch kháng thể không bám bằng hỗn hợp Triton X-100 0.25 % và BSA 1 % trong vòng 5 phút

- Ủ lát mô với kháng thể thứ cấp Anti-rabbit Alexa Fluor® 488 sản xuất từ dê pha loãng 1:80 ở 4 o C trong 24h

- Rửa sạch kháng thể không bám bằng 10ml dung dịch HBSS 5 lần

- Nhuộm nhõn tế bào bằng Hoechst 33258 Cho lờn bề mặt lỏt mụ khoảng 10 àl dung dịch phủ, đậy lát mô bằng lamelle